方法論記事

天然化合物の存在下でそのまま β 細胞のミトコンドリア機能を測定するための高解像度の呼吸

DOI：

10.3791/57053

⸱

2018年1月23日

 ,  ,  , 
1Nutrition, Dietetics and Food Science Department, Brigham Young University

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルの目的は、高解像度の呼吸を使用してそのまま 832/13 ベータ細胞に及ぼす天然化合物の存在下でのミトコンドリアの呼吸にグルコース依存性の変化を測定するためです。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

高解像度の呼吸は、分離ミトコンドリア、細胞、組織の酸素消費量の測定が可能です。Β 細胞は、高グルコース濃度に応じてインスリン分泌を制御血糖レベルが体内で重要な役割を果たします。インスリン分泌は、糖代謝とミトコンドリアの呼吸によって制御されます。したがって、そのまま β 細胞呼吸を測定する糖尿病の治療として β 細胞機能を改善することが不可欠です。Β 細胞の細胞呼吸のグルコース濃度の増加の効果を測定することができますを派生そのまま 832/13 プラグイン-1 を使用します。このプロトコルは、ベータ細胞の呼吸を可能にする効果を決定する種々 の化合物の存在の有無で測定することができますそのまま細胞の呼吸に化合物を与えられました。低 (2.5 mM) または高グルコース (16.7 mM) の条件の存在下で β 細胞呼吸に及ぼすクルクミン、エピカテキン単量体、2 つの自然発生する化合物を示します。この手法は、様々 な化合物が異なるグルコース濃度の存在下でそのまま β 細胞呼吸に及ぼす影響を決定する使用できます。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

膵臓のベータ細胞の主な目的は、グルコース刺激によるインスリン分泌を介してシステムな場合を維持することです。Β 細胞感覚主低親和性、高容量グルコーストランスポーター GLUT2 によりブドウ糖の循環の生理学的変化 (ブドウ糖トランスポーター 2、Km 16.7 mM)1。循環のブドウ糖のレベルの上昇とこの高容量低親和性トランスポーターは β 細胞内でブドウ糖を細胞内に比例して増加を促進します。グルコースは解糖系、TCA サイクル (トリカルボン酸) 細胞 ATP (アデノシン三リン酸) レベルの上昇で、その結果ミトコンドリア呼吸代謝されます。高架の ATP 濃度は ATP 敏感な K+チャネル、膜の脱分極の結果をブロックします。膜の脱分極を引き起こす電圧依存性 Ca2 +チャネルの開口部と小胞の後続のリリース バインド インスリン顆粒2。Β 細胞機能不全を示し、低下し、コントロール不良インスリン分泌と最終的には β 細胞死3(T2D) 2 型糖尿病の特徴です。ダグラス T2D 用治療薬として維持または β 細胞機能を改善するメカニズムを使用できます。

研究は、天然の有益な効果を示している膵 β 細胞4植物化合物。これらの化合物増加 β 細胞の増殖、生存、またはグルコース刺激によるインスリン分泌に効果があります。例として、最近の研究は、エピカテキン単量体ミトコンドリア呼吸の増加を介してのグルコース刺激によるインスリン分泌を高め、レベル5の細胞の ATP を増加を実証しています。したがって、これらの化合物は機能の β 細胞を増やすことができますどのように理解質量は潜在的な治療としてこれらの化合物を活用することが重要です。

細胞呼吸は、ツールの数を測定できます。高解像度計グリセリンまたはそのままのセル人口6化学変調器の滴定の使用します。このツールは、このように幅広い情報を与える異なる濃度で様々 な化合物の添加を許可します。

糖代謝と β 細胞機能との間に親密な関係を考えると、細胞呼吸の測定が重要です。細胞呼吸の測定を行うことができます独自の利点と欠点の7,8のセットを持っているそれぞれのグリセリンまたは無傷のベータ細胞を使用して。Β 細胞の透過電子輸送チェーンのさまざまな側面を測定することができます、なしで β 細胞は、グルコース取り込み代謝呼吸を誘発するメカニズムに関しては。したがって、unpermeabilized のベータ細胞の呼吸の使用は、読み出しとして酸素消費量を使用して様々 な血糖値のレベルに対する β 細胞の応答を判断する非常に有用なテクニックです。

この手法の目的は、そのまま INS 1 の酸素消費量を測定する派生 832/13 β 細胞です。この手法では、条件刺激グルコース (ブドウ糖 16.7 mM) だけでなく、unstimulatory グルコース条件 (2.5 mM グルコース) に対する β 細胞の応答を判断出来ます。Unpermeabilized 細胞を私たちは複合体を個別にテストすることはできません私は、II または III の電子輸送チェーン、手法が複雑な IV 阻害 (オリゴマイシン A) 非呼吸 (FCCP カルボニル シアン化物 - を扱う測定を許可4-(フッ素系低分子) phenylhydrazone)、呼吸 (アンチマイシン A) を完全に抑制します。本研究は、2 つの自然発生する化合物、エピカテキン単量体とクルクミン、β 細胞呼吸に及ぼす影響と同様に、そのまま unpermeabilized 膵 β 細胞における呼吸の測定の有効性を示しています。

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プロトコル

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1. 細胞培養

  1. 文化 INS 1 派生 10% 牛胎児血清 (FBS)、1% ペニシリン-ストレプトマイシン、10 mM HEPES、グルタミン 2 mM、1 mM ピルビン酸ナトリウム 0.05 mM 2-メルカプトエタノール9,10,11 と添加 RPMI 1640 年に 832/13 β 細胞 ,12,13。
  2. 完全な RPMI 1640 メディアの 8 mL を追加して 10 分 Neutralize トリプシンの 37 ° C で培養、0.25% トリプシンの 2 mL を使用して T75 フラスコから 832/13 セルを削除します。
  3. 診断を使用してセルをカウントし、ステップ 1.2 で 900 μ L の PBS からの細胞容積の 100 μ L を希釈します。
  4. 6 2 × 106セル/ml の密度でプレート 832/13 セルはよく料理します。
  5. 呼吸の実験を開始する前に 48 h 37 ° C および 5% CO2で加湿のインキュベーターでの細胞を培養します。

2. 高解像度呼吸用細胞の調製

  1. ココアの派生エピカテキン単量体と 832/13 セルを扱います。
    1. 37 ° C、5% CO2で加湿のインキュベーターでめっき後 24 h の 832/13 細胞を培養します。
    2. めっき後メディア 24 h に変更し、車両制御 (3 ウェルズ) や 100 nM ココア モノマー (3 井戸)、37 ° C、5% CO2で加湿のインキュベーターで追加 24 h (合計 48 h) の文化に続いて 832/13 セルを扱います。
    3. 1 低グルコース分泌の試金 (SAB) のバッファー 5 分吸引バッファー x 832/13 セルを洗浄し、変更低血糖 SAB x 1 時間ごと、3 時間の低血糖 SAB x 1 に 832/13 セルを孵化させなさい。
      1. 33.32 g の NaCl、KCl、1.73 g、KH2PO4MgSO4 0.7 g の 0.82 g を 10 x SAB と H2O 500 mL の最終巻を追加。滅菌フィルター最終的な解決策。
      2. 0.25 M CaCl235 %bsa 溶液、NaHCO3 0.21 g 0.57 mL 作る低血糖 SAB SAB、100 μ L の 45% のグルコース、1 M HEPES、1 mL の 2 mL x 10 の 10 ml × 1 H2O に 100 mL の最終巻を追加。滅菌フィルター最終的な解決策。
  2. クルクミンと 832/13 セルを扱います。
    1. 37 ° C、5% CO2で加湿のインキュベーターでめっき後 48 時間 832/13 細胞を培養します。
    2. 1 低血糖 SAB x 5 分吸引バッファーの 832/13 セルを洗浄し、変更低血糖 SAB x 1 時間ごと、3 時間の低血糖 SAB x 1 に 832/13 セルを孵化させなさい。
    3. 1 低血糖 SAB x 3 時間培養の 2.5 時間後バッファーを吸引し、車両制御と低グルコース SAB または 30 分の 40 μ M クルクミン x 1 のセルを孵化させなさい。次の孵化、バッファーを吸引します。
  3. 高解像度の呼吸のトリプシンで細胞を収穫
    1. 1 低血糖 SAB x 3 時間培養後 250 μ L/ウェル 0.25% トリプシンのプレートからセルを削除します。
    2. 車両制御または 4 ml を 15 mL の円錐管に SAB の関心の複合治療 3 井戸からトリプシンのセルを結合します。
    3. 診断を使用してセルをカウントし、ステップ 2.3.2 で 900 μ L の PBS からの細胞容積の 100 μ L を希釈します。
    4. 低糖各商工会議所の適切な濃度で 3 mL にする SAB x 1 のセルの適切な数を希釈します。データは、1 × 106セル/mL の濃度が最も有効であることを示します。
  4. 高解像度の呼吸の機械的解離でセルを収穫
    1. 1 x 3 時間培養後低血糖、SAB は、それぞれに低グルコース SAB もゆっくりと機械的解離でプレートからセル 1000 μ L ピペット チップでピペッティングによる爆破 1 x の 1 mL を追加します。
    2. 車両制御または呼吸のための 15 mL の円錐管に 3 mL SAB の合計への関心の複合治療 3 井戸からセルを結合します。

3. 高解像度の呼吸

  1. 高解像度の呼吸の準備。
    1. 高解像度の呼吸および呼吸の分析プログラムを起動して、デスクトップに接続します。
    2. 両院から 70% エタノールを吸引します。45 分以上 70% エタノールでこれらの部屋を浸します。
    3. 70% エタノール, 各ステップ後吸引で 2 回部屋を洗ってください。
    4. 3 回で ddH2O、各ステップ後吸引チャンバーを洗います。
    5. DdH2O. 商工会議所プランジャーをすすいでください。これは、プランジャーとチタン ポートから残留エタノールをクリーンアップします。
  2. ポーラロ グラフ法による酸素センサーの校正。
    1. 継続的に 2.0 データ記録間隔と 750 rpm、37 ° C でチャンバー内電磁攪拌バーを使用してバッファーを攪拌各 oxygraph 室に 2.4 x 低グルコース SAB バッファー 1 mL を追加 s f7 キーのボタンを押すと、タブを開く「システム」というラベルの付いた。プランジャーを押すすべての方法で、レンチの曝気設定に撤回し。安定した酸素流量が得られるまで 1 時間の最小値の平衡機をしましょう。
    2. 実験の期間中、37 ° C でマシンを設定します。偏波電圧を 800 に設定 mV、f7 キーのボタンを押すと「酸素、O2」というラベルの付いたタブを開いて 2 ゲインを持つ。酸素濃度の変化が安定している間、少なくとも 30 分間 SAB バッファーの酸素濃度を平衡 (未満 2 pmol/(s*mL))。
    3. 酸素濃度安定化、次の酸素濃度の変化が安定して酸素濃度変化のバック グラウンド測定を確立する地域を選択します。
      1. Shift キーを押し、マウスを左クリックして選択した領域でマウスをドラッグして領域を選択します。2 つの部屋のそれぞれに対応する、各トレースの選択した領域と"R1"への変更に関連付けられている文字をクリックします。
      2. 左下の「O2校正」ボックスをダブルクリックして、画面の角を右、R1 として「空気校正」の「マークの選択」ボタンをクリック、衆参両院の「調整とクリップボードにコピーします」を選択。
  3. 2.1.5 または 2.2.5 832/13 β 細胞の呼吸の評価は手順で準備。
    1. 1 x 低グルコースお手元で 2.4 mL 各商工会議所 (車両処理細胞、化合物の処理セルと 1 つの室を用いて 1 つの区域) のサンプルを読み込む機械的解離方法 (測定後の-20 ° C で凍結) を使用する場合 (ビシンコニン酸) BCA アッセイによってタンパク質濃度の細胞サンプルの 0.5 mL を保持します。
      1. すべての方法プランジャーを押し、残留量を吸引します。750 rpm とすべての後続のステップの 37 ° C で実験を通して継続的に細胞をかき混ぜます。F4 をクリックしてサンプルが読み込まれるときに「セル」としてラベル付けによって印を作りなさい。
      2. 30 分のサンプルを測定します。信号の安定化後、3.2.3 で説明するように低血糖状態 (2.5 mM グルコース) に対応する酸素濃度変化の領域を選択します。
    2. 信号の安定化に達した後は、注射器を使用してポートをロード チタンを通して各商工会議所に 45% 滅菌グルコース溶液 (16.7 mM 最終濃度) の 12.5 μ L を追加します。マーク測定「ブドウ糖」として治療を追加 3.3.1 に記載されているを確認します。Let の信号を安定させるため、安定した酸素流量を達成するまでに細胞呼吸を記録。3.2.3 で説明するように酸素濃度の変更のこの地域を選択します。16.7 mM グルコース読書、刺激条件7に対応します。
    3. 信号の安定化に達した後は、5 mM オリゴマイシン (2.5 μ M 最終濃度) 各チャンバーに読み込みポート経由の 1 μ L を追加します。マーク測定"OligoA"としてトリートメントを追加 3.3.1 に記載されているを確認します。Let の信号を安定させるため、安定した酸素流量を達成するまでに細胞呼吸を記録。3.2.3 で説明するように曲線のこの領域を選択します。オリゴマイシン A は ATP 合成酵素を阻害する、電子と酸化的リン酸化されない7のリークでは唯一酸素磁束発生します。
    4. 信号の安定化に達した後は、最大呼吸が確立されるまで、1 μ L 単位で 1 mM FCCP を追加します。これは最大の共役呼吸を表します。3-4 μ L の間 FCCP 濃度である十分な (1.5-2.0 μ M 最終) INS 1 832/13 セルの最大の共役呼吸を誘発します。治療が追加されるときに、3.3.1 で説明したよう「FCCP」というラベルの付いた印を作りなさい。Let の信号を安定させるため、安定した酸素流量を達成するまでに細胞呼吸を記録。3.2.3 で説明するように曲線のこの領域を選択します。FCCP は、脱共役剤です。これは共役呼吸7を測定することができます。
    5. 信号の安定化に達した後は、読み込みポートを介して各部屋に 5 mM アンチマイシン A の 1 μ L (最終濃度が 2.5 μ M) を追加します。治療が追加されるときに、3.3.1 で説明したよう「アンティア」というラベルの付いた印を作りなさい。Let の信号を安定させるため、安定した酸素流量を達成するまでに細胞呼吸を記録。3.2.3 で説明するように曲線のこの領域を選択します。
      注: アンチマイシン A シトクロム C レダクターゼをバインド、ユビキノン酸化を抑制する、すべての呼吸をブロックします。これにより、呼吸7を完全に停止することができます。
  4. 832/13 β 細胞タンパク質濃度と呼吸の正規化を測定します。
    1. BCA 法13を使用して測定蛋白質のサンプルをロードで保持されるサンプルの 0.5 mL を使用しています。
    2. 製造元の指示に従って希釈せず、3 通で各サンプルを実行します。
  5. 細胞をトリプシンから 832/13 β 細胞呼吸計算。
    1. 計解析プログラムの F3 ボタンを押してアッセイに mL 使用あたりのセル数を入力します。単位をセル/mL に変更、細胞濃度を入力し、お手元に媒体を変更
    2. 選択し O2校正フォーム 3.2.3 で説明するように入力データを正規化するバック グラウンド測定値を選択します。
    3. 2.5 mM グルコース、16.7 mM グルコース、オリゴマイシン A、FCCP およびアンチマイシン A 3.3.1 に記載からの測定値の選択を行います。
    4. 計解析プログラム内でタンパク質濃度を入力し、呼吸測定時にそれぞれの治療のため適切な平均値を選択後各商工会議所の測定値をエクスポートします。これは F2 をクリックして、クリップボードの機能に「コピー」を押します。その他の解析プログラムで使用するデータをエクスポートします。計算のため「O2斜面ネガティブ"値を使用します。
    5. 車両の 3-5 独立した実行処理コントロールと天然化合物の INS 1 832/13 β 細胞の無傷の細胞呼吸に及ぼす影響を決定するための処理セルは、データをコンパイルします。
  6. 832/13 β 細胞呼吸計算から機械的に細胞を分離しました。
    1. 計解析プログラムの F3 ボタンを押して BCA アッセイからタンパク質計算を入力します。単位を mg に変更、BCA 濃度を入力し、お手元に媒体を変更
    2. 選択し O2校正フォーム 3.2.3 で説明するように入力データを正規化するバック グラウンド測定値を選択します。
    3. 2.5 mM グルコース、16.7 mM グルコース、オリゴマイシン A、FCCP およびアンチマイシン A 3.3.1 に記載からの測定値の選択を行います。
    4. 計解析プログラム内でタンパク質濃度を入力し、呼吸測定時にそれぞれの治療のため適切な平均値を選択後各商工会議所の測定値をエクスポートします。これは F2 をクリックして、クリップボードの機能に「コピー」を押します。その他の解析プログラムで使用するデータをエクスポートします。計算のため「O2斜面ネガティブ"値を使用します。
    5. 車両の 3-5 独立した実行処理コントロールと天然化合物の INS 1 832/13 β 細胞の無傷の細胞呼吸に及ぼす影響を決定するための処理セルは、データをコンパイルします。

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結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

準備され、プロトコルで説明されているように収穫 INS 1 832/13 β 細胞は酸素消費量 (図 1 a) 様々 な化学的介入に基づく変調を示します。呼吸の増加が観測される時グルコース濃度は 16.7 mM グルコース (図 1 b) に増加します。そのままセルはオリゴマイシン A と扱われるとき呼吸が減少します。この呼吸は、基底、nonphosphorylating 呼吸状態として定義されているリークと呼ばれます。最大呼吸は、ベータ細胞を脱共役剤 FCCP ETS 呼吸または電子輸送システム呼吸として定義されている処理するとき達成されます。最後に、呼吸はアンチマイシン A、細胞の非呼吸の酸素消費量は、ROX (残留酸素消費量) というレッテルと扱われるとき 0 にドロップされます。

セル数の違いはこの手法から得られたデータの質を大きく変えます。グルコース誘発する呼吸は、0.5、1、および 2 x 106セル/mL (

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ディスカッション

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このプロトコルの目的は、高解像度の呼吸を使用してそのまま膵 β 細胞における呼吸速度を測定することです。このメソッドは、高められたブドウ糖のレベルに β 細胞応答の測定できます。プロトコルは、この自然に発生する単量体エピカテキンやクルクミン4,5プロトコルで示されて様々 な化合物の前処理でできます。他の種々 の化合物による治療は、前処理 (下図) または基本プロトコルに最小限の変更で呼吸器チャンバ内を扱うことにより、このプロトコルで使用できます。

様々 な方法では、このメソッドを変更することがあります。他のベータ細胞を使用できる;しかし、細胞数と SAB 洗浄時間は、実験的に決定する必要があります。プライマリの齧歯動物と人間の小島もされる可能性があります。しかし、細胞や膵島の同等の数を実験的に決定する必要があります。少なくとも 1 つの...

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開示事項

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著者が明らかに何もありません。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者は、アシスタントと科学的な議論について Tessem とハンコックのラボのメンバーに感謝したいと思います。著者は、アンドリュー ・ ニールソン博士 (バージニア工科大学) がココア派生エピカテキン単量体の一部を提供することをありがちましょう。本研究は、JST に糖尿病アクション ・ リサーチと教育財団からの助成金によって支えられました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
O2kコア:オキシグラフ-2kオロボロスインスツルメンツ10000-02高解像度呼吸測定用機器
DatLab 6プログラムオロボロスインスツルメンツ27141-01高分解能呼吸器測定分析用コンピュータプログラム
INS-1 832/13 デューク大学医療センターなしベータ細胞株、クリストファー・ニューガード・
クルクミン博士からの贈り物シグマC7727ベータ細胞の前処理
ココア エピカテキン モノマーバージニア工科大学 州立大学なしベータ細胞の前処理、アンドリュー・ニールソン博士からの贈り物
トリプシンシグマT4049細胞培養用
RPMI-1640シグマR8758832/13 ベータ細胞培
ウシ胎児血清ハイクロンSH30071.03832/13 ベータ細胞培地成分
ペニシリン-ストレプトマイシンΣP4458832/13 β細胞培地成分
HEPES ΣH3662832/13 β細胞培地成分/ 1x SAB バッファー
グルタミンケーソンGLL01832/13 β細胞培地成分
ピルビン酸ナトリウムΣS8636832/13 β細胞培地成分
2-メルカプトエタノールΣM3148832/13 β細胞培地成分
NaClFisherS27110x SABバッファーの成分
KClSigmaP954110x SABバッファーの成分
KH2PO4SigmaP565510x SABバッファーの成分
MgSO4SigmaM264310x SAB バッファーの成分
D-(+)-グルコース溶液Sigma G87691x SAB バッファーの成分、呼吸アッセイ用薬品
CaCl2SigmaC56701x SAB バッファーの成分
35% BSA 溶液ΣA79791x SAB バッファーの成分
NaHCO3SigmaS57611x SABバッファーのコンポーネント
200プルーフエタノールシグマ459844洗浄オキシグラフO2kチャンバー
オリゴマイシンAシグマO4876呼吸アッセイ用化学薬品
FCCPシグマC2920呼吸アッセイ用化学薬品
アニトマイシンAシグマA8674呼吸アッセイ用化学薬品
BCAプロテインキットサーモフィッシャー23225タンパク質濃度の決定用
地

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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