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方法論記事

タイムのエッセンシャル オイルのアプリケーションの肉乾燥中の微生物負荷に及ぼす影響

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DOI:

10.3791/57054

⸱

2018年3月14日

 ,  ,  , 
1Department of Sustainable Technologies, Faculty of Tropical AgriSciences, Czech University of Life Sciences Prague, 2Department of Quality of Agricultural Products, Faculty of Agrobiology, Food and Natural Resources, Czech University of Life Sciences Prague

この記事について

サマリー

肉製品を汚染する大腸菌などの微生物は、食中毒を引き起こします。肉の乾燥工程でのエッセンシャル オイルの使用は深く研究されていません。ここでは、乾燥肉の微生物負荷を低減する乾燥時に肉にタイムのエッセンシャル オイルを適用する手法を提案する.

要約

肉は、保全と安全性が重要なぎくしゃくした、人気のある食品おやつの準備で使用されている、高たんぱくな食事です。食品の安全性を確保するために、肉及び肉製品の棚寿命を延ばすため、合成又は天然の防腐剤の使用はコントロールに適用されているし、食中毒細菌を除去します。肉の天然食品添加物のアプリケーションの関心の高まりが増加しています。肉及び肉製品、食中毒を引き起こす大腸菌などの微生物を汚染します。したがって、肉保全プロセスを改善する必要があります。しかし、肉を乾燥するときのエッセンシャル オイルの使用は深く研究されていません。この点で、乾燥肉の価値を増加し、乾燥処理中にエッセンシャル オイルを適用することによって媒介する病気のリスクを軽減する機会があります。このプロトコルでは、乾燥、乾燥室で直接蒸気の形で具体的には肉の中にタイムの精油 (テオ) を適用する手法を提案する.評価は、最小阻止濃度 (MIC) を使用して、raw のサンプルと比較して扱われたサンプルで有害な細菌の数を検出します。予備的な結果は、このメソッドは、実行可能な代替オプション合成防腐剤を示し乾燥肉の微生物負荷が大幅に減少すること。

概要

乾燥食品を保存する伝統的な方法としては、古くから使用されています。最近では、乾燥食品保全1,2,3の効果的な方法としての関心の高まりがあります。それは様々 な特殊加工肉を作るためです。最もよく知られているの 1 つはジャーキーです。

ジャーキー、肉保存のための最も古い方法の 1 つは、硬化・乾燥を行う低水分活性に基づいて、したがってその寿命4を拡張します。今日では、保存塩漬け肉は非常に人気があるまだぎくしゃくした、食品の安全性、味、テクスチャが必須です。肉は、牛肉、豚肉、鶏肉、またはゲーム5を含むほぼすべてのタイプのけいれん的な準備が使え、無駄のないストリップで肉をまな板と乾燥が必要です。通常、硬化ソリューションまたは喫煙で肉をマリネ乾燥と共に得られるぎくしゃくの独特の味6。

本当に食べ物を保存する乾燥の広大な関心にもかかわらず不十分な乾燥肉から大腸菌による食中毒発生の危険性は非常に重要で、制御する必要があります。いくつかの研究は、特にE. 大腸菌o157: h7、ホーム乾燥中の処理不十分な熱に帰因すると食中毒胃腸炎アウトブレイクの報告があります。似たようなケースは、ぎくしゃくした7,8,9を商業的準備でも発生しています。レバイン氏ら。10は、食中毒微生物が商業のぎくしゃくした生産者によって使用される適度な乾燥条件 (約 60 ° C) を生き残ることができることを提案しました。エシェリヒア属大腸菌o157: h7、1990 年代半ばに食中毒の発生は、乾燥させてすりつぶした肉製品6,11に帰因しました。興味深いことに、すべての前の例で主なリスクが認められた非人為的 (VBNC) が実行可能な細菌の病原体が原因です。大腸菌の細胞は飢餓や温度変化など様々 なストレスの下で、VBNC 状態12,13として知られている特定の状態を入力しました。VBNC セル適切な条件への露出によって培養細胞に戻る、蘇生可能性があり、食中毒汚染14,15による人の健康への脅威。これは、製品を乾燥させた直後に肉を消費した場合は、安全を意味します。ただし、湿度が高くなどの不適切なストレージの場合、病原体や微生物の増殖の再活性化のリスクが高いがあります。

乾燥とマリネの方法に加えて、食品品質16,17を改善する添加物の代替として自然の製品を使用する消費者からの高い需要があります。古典的な合成防腐剤18,19,20,21の代わりに肉の天然食品添加物のアプリケーションに特に興味があった。肉を乾燥エッセンシャル オイルの使用に十分な実験的証拠の欠乏がある、にもかかわらず、この分野の初期の研究は既に肯定的な結果22,23を示します。

中間年齢以来、人々 は、抗菌、殺虫、駆虫特性24,25,26精油化合物 (Eoc) を認識しています。今日、Eoc 生理活性天然化合物の最も重要なグループの 1 つの一部であります。異なる Eoc のチモールは、最もよく知られているの 1 つです。それはテオ23の 85% 以上で構成されます。このフェノールは、食品に追加される微生物・化学的劣化を防ぎます。さらに、その他天然の防腐剤2,27,の28,29,30との組み合わせでその抗菌特性を改善可能性があります。タイム (タチジャコウソウ)、今日では、シソ科の家族に属しているハーブ香料剤として非常に効果的な肉防腐剤31として認識されています。ガルシーア ・ ディーツらによる研究。30肉製品には、テオに他のエッセンシャル オイルと比較した場合の食品由来病原体に対する広い阻害パターンが表示されることを発見しました。したがって、乾燥肉の価値を増加し、乾燥処理中にエッセンシャル オイルを適用することによって媒介する病気のリスクを軽減する機会があります。

このプロトコルでは乾燥肉中にテオを適用する手法を提案する、商工会議所、乾燥蒸気フォームで直接で具体的に。評価、原料のものと比較して扱われたサンプルで病原性の細菌の有無を決定するためにマイクを使用します。予備の結果は、このメソッドが合成防腐剤に非常に効果的な代替手段であり、この乾燥肉の微生物負荷が大幅に減少することを示します。

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プロトコル

1. 肉準備

  1. 地元の肉屋から牛 (大腿二頭筋から新鮮な牛) のロースを入手して研究室に転送します。
    注: 気密密閉袋に入れて 20 分より長くない期間常温 (20-25 ° C)、牛ロース肉を輸送する勧めします。
  2. 層流の安全キャビネットで、牛筋の外側の表面を殺菌する 10 の 70% (v/v) エタノールを噴霧して筋肉を洗うスクイズ ボトル 500 mL を使用して s。筋表面の 1 cm2あたりエタノールの 0.025 g を適用します。
  3. 筋肉の内側に残りのエタノールを避けるためにナイフで肉の外側の表面を無菌削除します。筋肉の表面の均一性を保つために筋肉の内側の約 3 mm を削除します。
  4. プラスチック製の密封された袋の筋をパッケージ化し、冷凍庫に転送すること。
  5. 1 日-18 ° C で筋肉を格納します。その後、6 h 4 ° C で凍結筋を解凍します。
    注: 融解、勧め筋肉を冷凍庫から冷蔵庫に移動します。
  6. 層流安全キャビネットで各筋肉カッターで 0.5 cm 厚切りにスライスします。ナイフで切ると小さな 5 × 2.5 cm2長方形のサンプル。
  7. パッケージのビニール袋に長方形の肉サンプル、-18 ° c 保存用冷凍庫で保管します。

2. 標準化と層流安全キャビネット内接種手順の準備

  1. 標準化された接種 (1.5 × 108 CFU/mL)エシェリヒア属大腸菌ATCC 25922 肉サンプルを接種するを準備します。
    1. ストックの接種材料の準備のため最初入力済みに 10 ml の滅菌バッファー ミュラー ヒントン スープ (BMHB) 15 mL 滅菌チューブに (製造業者によって配信) 凍結乾燥細菌培養を調剤します。37 ° C で 24 時間この懸濁液を育成します。
      1. 次のように細菌の貯蔵液の準備: 取る約 0.1 - 0.2 mL の細菌懸濁液 20 mL バイアルに希薄で閉じてゴム栓滅菌 BMHB 15 mL のアルミ キャップ付き。37 ° C で 24 時間この懸濁液を育成します。
      2. 標準化された接種の準備のための 4 ° C で冷蔵庫内を格納します。
    2. 原液から (手順 2.1.1 参照)大腸菌取るの約 0.1 - 0.2 mL の細菌懸濁液とプラスチック製の 15 mL の希釈滅菌チューブ 10 mL の滅菌バッファー ミュラー ヒントン スープ (BMHB) が記入されました。24 h の 37 ° C でチューブを孵化させなさい。
    3. 標準化された接種 (1.5 × 108 CFU/mL) の準備のため事前の滅菌 BMHB 10 mL でいっぱい 15 mL 滅菌チューブにこの懸濁液の少量を追加します。
    4. 徹底的に渦混合物とメジャー 600 の光学濃度 (OD) 濃度計32nm。
    5. 2.1.3 - 2.1.4 マクファーランド値はきれいな BMHB の値と比較して 0.5 ずつ増加を示した OD までの手順を繰り返します。
  2. 接種の手順 2 つ異なるアルミ箔 (20 cm × 30 cm) コントロールのサンプルと接種肉サンプルの 2 番目の長方形の肉サンプルを配置します。
    1. 2 番目のアルミ箔を表面に接種を均等に分散することにより (これは 1.2 × 108 CFU 肉サンプルごとに相当) 選択したひずみの細菌懸濁液の 800 μ L で生肉長方形サンプルを接種します。
      1. サンプルの 1 つの側面に 400 μ L をピペットし、無菌細胞拡散を用いた表面を軽く広げ。サンプルの 10 分反対側の懸濁液の残りの部分と同じ手順の繰り返し乾燥させます。

3. 乾燥とテオの応用

  1. ドライヤーに層流の安全キャビネットから長方形の肉のサンプルを含む両方のアルミ箔を転送: 各アルミ箔でカバーし、ドライヤー内サンプルを配置。
  2. 標準的な実験室のドライヤーで乾燥を行います。
    注: 最初に、オーブンを 55 ° Cこの手順は、20 分間続くことができます。
    1. 乾燥空気相対湿度値 30-45% から 55 ° C で 6 時間コントロールのサンプルを乾燥させます。
      注: 乾燥空気相対湿度値肉からの液体の蒸発の率によって時間が異なります。
  3. 適用すると、テオのボリュームを計算し、ドライヤー ボリューム (mL/L 空気) ごとにテオのボリュームとしてエッセンシャル オイルの濃度を表します。たとえば、53 L (ドライヤーのボリューム) でテオの 1.5 mL の用量は 0.028 mL/L 空気の濃度の結果します。エシェリヒア属大腸菌のテオのマイクを決定するするには、1.5 mL (0.028 mL/L 空気)、1 mL (0.019 mL/L 空気) と 0.75 mL (0.014 mL/L 空気) の用量を使用します。
  4. テオの適用のため、乾燥する前に、(主な複合 79% としてチモール)、蒸気は、ファンの前でドライヤーにテオと場所の 1.5 mL の用量フィルター紙 (12 cm × 20 cm) を浸します。
  5. コントロールのサンプル (3.1 と 3.2 の手順) と同じ手順を使用して扱われるテオ肉サンプルを乾燥させます。
    注: 乾燥のプロセスが終了し、サンプルを削除したら 80 ° C で 3 時間オーブンのスイッチ、オーブンからのエッセンシャル オイルの残留物をきれいにするため 100% 通気する空気弁表示を設定します。

4. 微生物解析

  1. 細菌と肉接種前に任意の粗悪品のため肉のサンプルを確認します。スライムの外観は、任意の強く、刺激的な匂いの検出は、肉の腐敗を示しています。テクスチャは、ぬるぬるした感じ、細菌を始めていると、肉の表面に掛けるかもしれない。
  2. 接種効率を評価するために大腸菌ATCC 25922 の存在の raw サンプルをテストし、乾燥の手順の前に非接種コントロールのサンプルとの比較をします。この目的。
    1. 各肉サンプル (2 コントロールのサンプルおよび 2 サンプル) を洗います。1:10 (w/v) 7 7.3 から pH の範囲との比率でペプトン水 (8.5 g, 塩化ナトリウムのペプトン 1 g、リン酸緩衝生理食塩水、5 錠、1 L の水にポリソルベート 80 の 1 g) で滅菌フラスコ内の各肉サンプルを中断します。室温で 10 分間 140 rpm でシェーカーを使用して横に振る。
      注: 接種手続き後すぐに洗ってください。
    2. プレート カウント寒天培地 (PCA) とマッコンキー寒天培地 (MCA) アーウィン ・ ネース, 陳33によって要約される調整 6 × 6 ドロップ プレート プロシージャによって細菌数を評価します。
      注: 6 × 6 ドロップ方法は、マルチ チャンネル ピペット、集中的より経済的な従来法33,と比較してより少ない労働であると調査のサンプルの 10 倍のシリアル希薄を準備するスープ マイクロ希釈法を使います34。
    3. エシェリヒア属大腸菌の評価による 6 × 6 ドロップ プレート シリアル サンプルの 10 倍希釈液を栽培してください。
      注: 特に 6 × 6 ドロップ方法、栽培使用 6 5 μ L-滴、6 から選択マルチ チャンネル ピペットの調査のサンプルの希釈液。適切に乾燥ペトリ皿に寒天に滴をすぐに吸収してこのメソッドによって植わることは非常に便利で管理しやすい34。
    4. 24 h の 37 ° C でシャーレを孵化させなさい。栽培期間後に、セクション 5 で説明したようペトリ皿 (乾燥肉 CFU g-1 )エシェリヒア属大腸菌の細菌コロニー数を評価します。
  3. 乾燥後 2 つ接種乾燥サンプルと実行可能な大腸菌、それぞれそれら乾燥非接種コントロールの 2 つのサンプルと比較します。これらの 4 つのサンプルのエシェリヒア属大腸菌の有無を決定するには、各肉のサンプルの前濃縮プロセスをとおり実行します。
    1. ペプトン水で滅菌フラスコ内の各肉サンプルを中断 (を参照してくださいステップ 4.2.1)、室温で 10 分間 140 rpm でシェーカーを使用して横に振る。その後、前濃縮 6 h 中に 37 ° C で各フラスコを孵化させなさい。
    2. 細菌の培養と評価の手順 4.2.2 - 4.2.4 で同じ手順に従います。

5. 結果を確認します。

  1. 孵化が完了したら、インキュベーターからペトリ皿を削除し、次のように結果を確認します。
    1. PCA (白斑) と典型的なエシェリヒア属大腸菌の中温好気性細菌の存在のプレートを調べるコロニー数の合計を評価する MCA の植民地 (濃いピンクに赤)。病原体が存在しない場合、両方の寒天は成長はありません。
    2. コロニーをカウントし、大腸菌(CFU/g-1乾燥肉の) 現在の量を決定します。
      注: は、ドロップ (図 1) 当たり 30 以下の植民地を含む 2 つの連続希薄でコロニー (N) の数をカウントします。次のとおり35として乾燥肉の CFU/g-1の数Nを決定します。
      figure-protocol-1
      どこで、 Cはカウントすべての滴のコロニーの合計、 vは、サンプル希釈使用ドロップ (ここでは、0.05 mL) あたりの体積、 n1は最初の希釈で使用する滴数、 n2は、液滴の数2 番目の希釈で使用、 dは、最初のカウントがキャプチャされた希釈を表します。
  2. 微生物学的データを解析するには、ログ CFU g-1と治療36の主な効果の分散分析 (ANOVA) にそれらを服従にコロニー数を変換します。
    1. 複数の平均比較36テューキー正直差テスト (テューキー HSD) を行い、治療の重要な違いを特定します。

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結果

まず以前食品の安全性を高めるため、乾燥肉の価値を増加するオレガノ精油 (OEO) を使用してこのメソッドを開発した.一般に、前の実験では大腸菌が生存戦略として乾燥時 VBNC 状態に入る。22乾燥後、培養菌はなかったという事実によってこれを示します。したがって、6 h の前濃縮プロセスひずみのカウントを許可する必要があります。短い期間で成長している細胞の数がまだ低かった。その結果、前の濃縮プロセスの後に結果が表示されます、生を除く接種接種効率の制御を示すサンプル (表 1参照)。全体的にみて、それは私たちの以前の研究22から 3 mL (0.057 mL/L 空気) のテオ線量をテストするエシェリヒア属大腸菌が OEO 治療後見つかりませんでしたし、消費者としてあまりにも強烈な味の評価された必要でした。したがって、大腸菌に対してマイクを定義するテオの低濃度を調べた。

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ディスカッション

以前の研究では、乾燥10年食中毒の原因微生物間生き残ることを示しています。したがって、食品の安全性を確保するために乾燥する前に防腐剤を適用する必要は。本研究で我々 はテオを使用してに焦点を当てます。理由は 2 つあります: 最初に、代替添加剤として天然物を使用して食品品質16; を向上させる消費者からの高い需要があります。第二に、以前の研究は、プロセス22乾燥肉中 OEO を使用した後肯定的な結果を示した。したがって、肉乾燥時 OEO のアプリケーションによる微生物負荷を制御する他のエッセンシャル オイルの使用に拡張されました。

以前の研究では、食品の安全性を改善し、乾燥肉の価値を高める OEO をテストしています。大腸菌が乾燥、エシェリヒア属大腸菌の生菌数が有意に減少 1.5 ml (0.028 mL/L 空気) OEO2255 ° C で乾燥の 6 h ...

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開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

この作品は、熱帯 AgriSciences 部の内部補助金機関によって支えられた (プロジェクト番号: 20175013) と両方の付与、チェコの大学生命科学からたばこ 20182023。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ミートカッターKalorikKP 3530マイアミガーデンズ、フロリダ州、米国
層流安全キャビネットイタリアからの高速s.r.l
500mLのスクイーズボトルCZから Merci632 524 325 025CZから
標準実験室乾燥機 UFE 400MemmertDE 66812464ドイツ
から インキュベーターBT120N / ACZから
DensitometerBiosan220 000 050 122; サプライヤー Merci, CZ
Escherichia coli ATCC 25922OxoidCL7050CZ
VortexChromservis 22008013CZ
滅菌プラスチックチューブ 15 mLGama331 000 020 115からCZ、サプライヤー Merci
20 mL 注射バイアル中国からの健康的なバイアルhvft169
CZの 20 mm 滅菌ブチルゴムストッパーMerci22008013
CZ 20 mm アルミニウム キャップからの健康的なバイアルN/A
タイム エッセンシャル オイルシグマ アルドリッチW306509米国ミズーリ州セントルイスからの
ミューラー ヒントン ブロスオキソイドCM0337CZから
NaClPenta16610-31000CZ
PeptoneOxoidLP0034から
CZ リン酸緩衝生理食塩水Sigma AldrichP4417から CZ
Polysorbate 80 (Tween 80)RothT 13502DE、サプライヤー P-lab
シェーカー SHO-1DVerkonDH。CZからのWSR04020、  10 - 300 rpm. フラスコ用プラットフォーム付き 350 x 350 mm
エタノール 70%BiofermN/ACZ
から マッコンキー寒天オキソイドCM007
CZから プレートカウント寒天オキソイドCM0325CZ
から 濾紙Merci480 622 080 040CZ
から 三角フラスコ 250mLSimax610 002 122 636CZ社、サプライヤー Merci CZ
マルチチャンネルピペットSocorexS852820スイス、サプライヤー P lab、CZ
マイクロタイタープレートGammaV400916CZ
Microlitre pipette 100-1000 μLEppendorf333 120 000 062ドイツ製、サプライヤー Merci、CZ
DE ラトビアの冷蔵庫と冷凍庫 Bosch KGN34VW20G 中国

参考文献

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