Method Article

特性と密度勾配遠心によるマウスのプライマリ ミクログリアの分離

DOI:

10.3791/57065

⸱

February 16th, 2018

 ,  ,  , 
1The Ritchie Centre, Hudson Institute of Medical Research, 2Department of Obstetrics & Gynaecology, Monash University

In This Article

Summary

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マウスの脳からプライマリ ミクログリアの隔離のためのプロトコルが表示されます。この手法は、神経学的な条件の現在の理解の促進に役立ちます。密度勾配遠心法と磁気分離は、純度の高いサンプルの十分な収量を生成する結合されます。さらに、ミクログリアの特性評価のための手順をまとめました。

Abstract

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ミクログリア、脳内の居住者の免疫細胞は、炎症や中枢神経系に傷害の最初の反応です。最近の研究は、動的、プロ炎症性と抗炎症の表現型を想定しての対応するミクログリアを明らかにしました。M1 (炎症) と M2 (pro 修復) 表現型プレイ アミロイド条件周産期の脳損傷など展示異なる重要な役割機能ある特定の環境刺激に応答します。ミクログリア活性化の変調は神経保護ミクログリアが脳損傷の治療の可能性あるかもしれませんが示唆を与えるに指摘されています。しかしより多くの研究は病気におけるミクログリアの役割を理解するために必要なこのプロトコルを容易にします。プロトコルは下記を組み合わせた磁気分離、体外実験のために使用できる主要な小グリア細胞の純度の高いサンプルの生産と細胞の残骸を減らすために密度勾配の遠心分離プロセス、2-3 週間培養の必要があります。さらに、評価手順は、ミクログリア、偏光の私達の理解を改善するための研究を支援し、これらの細胞のプライミング再生医療の分野で強力な影響を持っている情報の堅牢な機能を得られます。

Introduction

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炎症、低酸素虚血および出血から周産期の期間中に取得した損傷は長期的後遺症の配列を持つことができます。周産期の脳損傷の複雑な病態は炎症や虚血後の神経細胞と軸索の死1理論します。生得の免疫反応は、傷害2につながるイベントの連鎖で重要な役割を果たしています。

ミクログリア、中枢神経系 (CNS)、内居住者の免疫細胞は、傷害3の最初の反応です。ミクログリアは、4の環境保護や毒性、依存する容量を持つプラスチック電池種類です。走化性、食作用、抗原提示、サイトカインや活性酸素種4、5の生産に関与しています。老齢ミクログリアは常に環境を調査し、外国または有害物質4の存在によってアクティブ化されます。活性化は、中枢神経系の保護4で重要な炎症応答に します。これらの M1「炎症」表現型ミクログリア主に抗原提示と病原体4の死に関与しています。にもかかわらず、神経保護の炎症反応の重要な役割は、自由なまたは長期の炎症が神経損傷

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Protocol

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次の手順は、モナシュ大学の動物倫理委員会によって承認されています。代表的な結果を生成する健康的な未処理新生児 C57Bl6/J P3-6 マウスが使用されました。

1. 酵素の消化力

注: 不妊の分離及び初代培養細胞を培養するときを考慮する重要です。環境は可能な限り滅菌を確保しながら初期の郭清とマウス脳の収穫を亂流フード外完了して層流フード内で実行される後続のすべての手順をことができます。

  1. 滅菌器具を使用して、マウスを頚椎脱臼で安楽死、動物の首をはねる、100% エタノールでリンスします。小さな滅菌はさみを使用して、頭の右と左の両側に沿って小さな切開を作る。この歳で、皮膚が離れて簡単にはがれます。カーブタイプ鉗子の先端を使用して、ゆっくり前を含む頭蓋骨を公開する演壇に向かって組織をスライドさせます。
  2. 脊柱管の開口部にはさみの先端を挿入し、外耳道に横切開します。上向きの脳の損傷を防ぐためにはさみの先端をそっと指して前矢状縫合線に沿って切開を行います。前にはさみの先端を挿入し、冠状縫合に沿って頭の左右両側に横切開を加えます。
  3. 鉗子を使用して、そっとはがす脳を公開する頭蓋骨。横切開によって公開される頭蓋骨の端を把握し、頭蓋骨を横に軽く引いてください。頭蓋骨は簡単に離れて皮する必要があります。それを削除する脳スクープ カーブタイプ鉗子を使用して、優しく。
    4. <....

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Results

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ここで説明した方法を使用して、ミクログリアの純粋な人口は分離できるので、体外と FACS 解析を用いた特性評価のために準備することができます。そもそも、18 動物まで使用できます選別、約 450,000 600,000 ミクログリア細胞の期待利回りあたり。最初に単離細胞の純度を確認することが重要だし、CD45 と CD11b ミクログリアの同定、2 つのマーカーの染色で FACS 解析を行ったように証明できる面倒、ミクログリアによって表現される多くのマーカーはまた表明しました。大食細胞、およびこれらの 2 つのマーカーの使用は、正確かつ信頼性の高い定量をことができます。具体的には、ミクログリア CD45、中枢神経系と末梢のマクロファージで高発現と比較しての低表現し、CD11b 陽性があります (図 1)。この特定の分離から 89.3% の純度が報告されました。CD11b の汚損の後、我々 はことを注意してください私たちの主のミクログリアが (より小さいより多くとより分岐し、はっきりと unram.......

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Discussion

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ミクログリアは、環境刺激によって変更両方 pro - と抗炎症、能力を持っています。前の研究は、ミクログリアの活性化の変調は神経保護を与えることができる示されています。ニューロンに保護を提供して損傷を修復する能力は、これらの複雑な細胞の現在の理解を促進するためのより多くの研究を必要とします。したがって、高純度プライマリ ミクログリアの分離は重要かつ有用な手法です。これは非常に純粋なプライマリ ミクログリア 2 日以内の in vitro実験の準備を取得する比較的簡単な方法です。

マウスの脳からプライマリ ミクログリアの分離のための文献に記載されているプロトコルの範囲があります。主な課題は十分なサンプル、生存率と純度の高いを効率的に生成します。このプロトコルの主な利点は、培養時間を必要とせず非常に純粋なサンプルの収量です。したがって、メソッドが 2 週間から 2 日間に短縮、これは容易に高速な結果。評価の手順は、ミクログリア、これらの複雑な細胞の現在の理解を向上させる情報の堅牢な機能を得られます。プロトコルは、2 つの現在のアプローチ - 密度勾配遠心法と磁気分離を.......

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Disclosures

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著者が明らかに何もありません。

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
DMEM、低グルコース、ピルビン酸Gibco11885084
抗生物質-抗真菌薬 (100X)Gibco15240062
DNaseI グレード II ウシ膵臓由来Sigma-Aldrich10104159001
パパイン産 パパイヤラテックス、緩衝液Sigma-AldrichP3125-100mg
ウシ胎児血清、認定、熱不活性化Gibco16140071
PercollGE Healthcare17-0891-01
Hank's Balanced Salt Solution (1X)Gibco14175-103
Hank's Balanced Salt Solution (10X)Gibco14185052
EasySep Mouse CD11b Positive Selection KitStemCell Technologies18770EasySep マグネットバリアント
EasySep 磁石StemCell Technologies18000
EasySep バッファーStemCell Technologies20144
ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水Gibco14040182
トリプシン (2.5%) (10X)Gibco15090-046
精製ラット 抗マウス CD16/CD32 (マウス BD FC Block™)BD Biosciences553141
Falcon 5mL丸底高透明度PP試験管、スナップキャップ付き、滅菌コーニング352063
175cm²ベントキャップ付きアングルネック細胞培養フラスコCorning431080
大腸菌由来のリポ多糖類 O127:B8Sigma-AldrichL5024
96ウェルTC処理マイクロプレートサイズ96ウェル、透明、ポリスチレン、丸底コーニングCLS3799
パラホルムアルデヒド(粉末、95%)Sigma-Aldrich158127
Triton-Xシグマ・アルドリッチX100
ラビット アンチイバ1ワコー01919741 
ヤギ抗ウサギIgGハンド&L (Alexa Fluor 488)Abcamab150077
FACS 抗体企業名カタログ番号
V450,ラット,抗マウス,CD45,30-F11,RUOBD Biosciences560501
PerCP-Cy5.5 CD11b eBiosciences45-0112-82
ZombieNIRBiolegend423105
pHrodo Red E. coli BioParticles ConjugateサーモフィッシャーサイエンティフィックP35361
Annexin.V_FITCMiltenyi Biotech130-093-060
プロポジウムヨウ化物溶液Miltenyi Biotech130-093-233

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Volpe, J. J. Brain injury in premature infants: a complex amalgam of destructive and developmental disturbances (Report). Lancet Neurology. 8 (1), 110(2009).
  2. Saliba, E., Henrot, A. Inflammatory Mediators and Neonatal Brain Damage. Biology of the Neonate. 79 (3-4), 224-227 (2001).
  3. Uwe-Karsten, H., Helmut, K.

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Microglia IsolationDensity Gradient CentrifugationMagnetic SeparationPrimary MicrogliaPercoll GradientCell CountingTrypan Blue StainingCD11b LabelingHemocytometer AnalysisPercoll Layering

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