方法論記事

マラリア感染時の細胞の小胞の機能評価

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DOI：

10.3791/57067

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2018年2月14日

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1Department of Medicine, University of Fribourg

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

この作品は、熱帯熱マラリア原虫感染赤血球によるリリース細胞小胞 (Ev) の役割を調査するプロトコルについて述べる.特に、我々 は EVs 血管内皮細胞との相互作用に焦点を当てます。

要約

マラリアは、原虫によって引き起こされる生命にかかわる病気、マラリア最もアフリカ大陸で流行しているとほとんどマラリア関連の死の責任世界的に。マラリアに感染した人々 の病気の進化に影響を与える組織、血管不全、および炎症性応答の寄生虫隔離を含むいくつかの要因。マラリアの感染赤血球 (内側) リリース小さな細胞小胞 (Ev) 寄生虫とホスト間の病態と細胞のコミュニケーションを仲介する貨物分子の種類を含みます。EVs は効率的に彼らが彼らの機能を調節する細胞によってとられます。ここで寄生虫ホストの相互作用における Ev の役割に対処するための戦略を議論します。まず、緑細胞リンカー染料を使用してラベリングおよび血管内皮細胞による EV 内面を追跡するために簡単なメソッドを説明します。第二に、蛍光に分類されたデキストランを使用して血管内皮細胞単層膜の透磁率を測定する簡単な方法を報告する.最後に、内皮細胞の機能に小さな非コード RNA 分子の役割を調査する方法を示します。

概要

世界保健機関によると 2015 年に世界的なマラリアの 2 億 1200 万の新しいケースもあったし、約 429,000 人が死亡、子供 5 歳未満年齢1の主に。血管機能障害と関連付けられる多くの場合、深刻な病気につながるメカニズムには、不明確な2が残っています。マラリア原虫感染は分泌細胞小胞 (Ev) として知られている小さい bi 脂質膜球です。知られているこれらの EVs が潜在的に関連する宿主の免疫応答、感染プロセスに感染。しかし、ほとんどはマラリア感染症3の間にこれらの小胞の正確な機能について知られています。彼らは 2 つの重要な役割を果たすことが可能です: 1 つの手を貢献するかもしれない病因活性化マクロファージ4,の5;その一方で、寄生虫および寄生虫とホスト6,7間通信調停をする可能性があります。実際には、寄生虫は、EVs を介してお互いの間蛋白質または核酸を転送できます。たとえば、トリパノソーマrhodesiense EVs 毒性因子 Serum Resistance-Associated (SRA) を転送することができます、他t. グリコシルホスファチジルイノシトールとホストの両方の赤血球8をターゲットすることができます。さらに、マラリア感染は、EVs 内で核酸を転送することによってお互いの間通信します。これにより最適化し、その成長を同期する寄生虫です。実際には、EVs がガメトサイト変換の主要なレギュレータをしてしたがって、伝送ステージ7の規則に貢献。

だけでなく、EVs は寄生虫を規制する、彼らはまた寄生虫ホストの相互作用を仲介します。最近、内側から Ev を含む宿主由来の Microrna (Mirna; 21-25 のヌクレオチド9の範囲で小さな RNA 種) ひと内皮細胞によってとられたことを発見しました。EVs の miRNAs 形成 Ago2 と複雑な安定 (メンバーによる RNA サイレンシングの複雑な)、受信者のセルに届けた後は特にサイレンシング遺伝子発現、細胞10のバリヤ特性に影響を与えることができます。標準的なプロトコルは、EVs の機能を調査するために開発されています。ここでは、我々 はまず受信者細胞による吸収を調査する EVs の蛍光ラベリングを可能にするプロトコルをについて説明します。さらに、共焦点の顕微鏡を使用して、セル内の EV の運命を追跡することが可能です。いくつかの蛍光染料は、EVs を追跡する使用ことができます。アミン反応性色素、5-(and-6) Carboxyfluorescein ジアセテート サクシニミジルエステル (CFSE) と小胞内カルセイン AM になる蛍光を一度。明るくより均一な信号を与えるので PKH、両親媒性ラベルを使うことが望ましい。このアプローチは、EVs と受信者の細胞間の相互作用を理解するための重要な情報を提供します。一方、いくつかのケースで EVs は細胞の表面に結合、いくつかの小胞急速にとられる。取り込み時に EVs は、出す規制機能の細胞に彼らの貨物を提供します。

ここでは、細胞膜を通して蛍光デキストランの転送を定量化することで培養内皮細胞のバリア機能を測定するためのプロトコルについて述べる。敏感なトレーサーは放射性標識マーカーなど使用できます。ただし、使用するため特別な安全上の注意が必要です。他のアッセイは、内皮下電気抵抗 (TEER) タイト結合の整合性を測定するなどの in vitroバリア機能を測定する存在します。最終的に蛍光抗体法で ZO-1、タイト結合蛋白を可視化によりよく10としてタイト結合の整合性の評価ができます。EVs は規制の潜在的な特性を持ついくつかの貨物を含む複雑な異種のエンティティであるので、レシピエントの細胞への影響を研究する特定の RNA をノザンに便利です。したがって、利息10の miRNA を表現する安定したセルラインを生成することを目的とするプロトコルを定義するもできます。

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プロトコル

人間の赤血球は、Swissethics (swissethics.ch) のガイドラインに従って、健康なドナーの血液から得られました。

注:マラリア寄生虫文化 (3 7) や EV 生産以前に記載された Mbagwu、ら。11 マラリアは人間の病原体、取り扱いの地域の規制にご相談ください。文化べき滅菌全体の時間。

1 EVs の蛍光標識

注: 次の手順は、EV 膜の脂質領域で大きな脂肪族尾安定緑色蛍光色素 (PKH67) を組み込むラベリング技術の利点をかかります。200 μ L の最終 PKH67 の 20 μ M の最終的な集中を含むボリュームを染色で反応を行います。周囲温度 (20-25 ° C) ですべての手順を実行します

  1. 微量遠心チューブに 1 mL の PBS で EVs の場所 100 μ。
  2. ペレットに最大速度 (20,000 x g) 7 分で微量遠心チューブ内の EVs を遠心します。
    注: とくにヘモゾインが EVs に存在するので赤暗い茶色ペレットを観察すべき。服従上清は赤みを帯びた、EVs が分離します。
  3. 遠心分離の後に、任意の EVs を削除を避けるために、慎重に、上清を吸引しています。
    注: は、再現性と染色の効率を高めるために希釈 C で EVs を再前にバッファーの残りの量を最小化します。
  4. 希釈 C の 100 μ L で EV ペレットを再懸濁します (EV 停止 X 2) と完全な分散を保証するためにゆっくりピペットで移しなさい。
  5. 新しい遠心チューブを準備し、PKH67 エタノール色素溶液の 4 μ L を希釈 C. 渦もミックスの 100 μ L に追加します。汚れる前にすぐにこの 2 x 色素溶液 (40 μ M) を準備します。
    注: 異種染色避けるために、EV のペレットに直接に PKH67 エタノール色素溶液を追加しないでください。
  6. 急速に、染料の解決 (手順 1.5) × 2 の 100 μ L で EV 懸濁液 (手順 1.4) X 2 の 100 μ L を結合します。その後、上下に 10 回ピペッティングによるサンプルをミックスします。
  7. 5 分孵化の間に 3-4 回ボルテックスによって光とミックスから保護から 5 分ステップ 1.6 EV/色素サスペンションを孵化させなさい。
    注: EV/染料懸濁液をインキュベート時間が長くなるメリットもありません、染色が速いので。
  8. 血清の等しいボリューム (200 μ L) を追加することによって染色反応を停止し、余分な染料のバインドを許可する 1 分間インキュベートします。
    注: 染色を停止する前に、20 分 20,000 × g で遠心分離による EVs から血清を使い果たします。
  9. PBS 洗浄 3 回、20,000 x g で 5 分間でスピンダウンの最終濃度 1 μ g/μ L に到達する PBS 100 μ L に EVs を再懸濁します。

2. 共焦点顕微鏡を用いた電気自動車の吸収を可視化します。

注: 次のプロトコルでは、EV ガラス coverslips 上に成長した内皮細胞によって内面の追跡について説明します。血管内皮細胞は、12に記載されている半不死化ひと骨髄内皮細胞です。

  1. 無菌環境での作業、0.01% ポリ-L-リジン (RT) 室温で 10 分間を超えると coverslips をコートします。
  2. ポリ L リジン ソリューションを吸引し、完全に乾燥する coverslips を許可します。
  3. トリパン ブルー色素排除と診断を使用して実行可能な内皮細胞数を実行します。
  4. 1 x 105 1 mL の完全培の内皮細胞成長ポリ L リジン コーティング coverslips にサプリメントのミックスを含むし、単分子層に成長する細胞の内皮細胞を転送します。
    メモ: メディアに含まれる成長因子細胞単層を形成し、タイトな接合を形成することができます。
  5. セルは、単層を形成、一度慎重に培地を吸引し、セルを洗浄して新鮮培地 1 mL を追加します。洗濯物をもう一度繰り返します。PKH67 ラベル EVs の 50 μ g を追加し、4 時間インキュベートします。
    注: 吸収の時間の最適なポイントを見つけるには、時間コースを実行することができます。
  6. 4 時間後、培地を吸引し、洗浄 3 回過剰および非連結の EVs を削除する PBS のセル。PBS で 3% パラホルムアルデヒド溶液中 15 分間とセルを修正します。
    注: メタノール固定プロセス中にアクチンを破壊できます。したがって、定着剤または他の溶剤系の定着剤を含む任意のメタノールを回避することをお勧めします。定着剤としてメタノール無料ホルムアルデヒドを使用することをお勧めします。
  7. PBS で 3 回洗浄を行う。慎重に 250 μ l 添加 0.1% のセルを permeabilize PBS でトリトン X-100。室温で 5 分間インキュベートします。
  8. 3 回を PBS で洗浄します。非特異的結合をブロックする RT で 30 分のブロック バッファー (PBS で 5 %bsa) の 400 μ L を追加します。
  9. PBS で 1 回洗浄を行う。各カバー スリップあたり 200 μ L PBS/1% BSA にファロイジン原液の 5 μ L に希釈して染色液を準備します。ピペット 200 μ L、coverslip の染色液のルートで 20 分間インキュベートし、
  10. 3 回を PBS で洗浄します。30 の DNA を counterstain 最終濃度 200 μ L の PBS で 2 μ G/ml ヘキスト 33342 で s。
  11. 400 μ L の PBS を追加することによって、coverslip x 2 を洗います。慎重に、coverslip 鉗子でつかんで滴スライド ガラスにメディアをマウント antifade の上に反転します。優しくティッシュで余分なメディアを削除して各側は爪のポーランド語のシールします。
  12. 4 ° C で光から保護されたスライドを保存します。
  13. レーザー励起 543、488、405 nm と 63 X 450-470 nm (青色)、505 530 nm (緑)、620 で蛍光排出量 1.3 NA 石油目的で共焦点顕微鏡を使って細胞を可視化する nm。
    注: 典型的な F アクチン染色結果は図 1のとおりです。

3. 血管内皮細胞の透過性

注: 内皮細胞の透過性は、単層の内皮細胞にローダミン B イソチオ シアン酸デキストラン (平均 MW 70,000) の転送を測定することによって評価されます。デキストランは、血管透過性を研究するための優れたツールを提供します。

  1. 0.4% トリパン ブルー色素排除と診断を使用して実行可能な血管内皮細胞を数えます。
  2. 24 ウェル培養挿入 (0.4 μ m 孔サイズ) や差別化された単分子膜を形成するため、少なくとも 5 日間妨げられていないままに合流点 105セル × 0.6 の密度で内皮細胞をプレートします。媒体ごとの 2 日目を更新します。
  3. 細胞が単層に達すれば、EVs を読み込む (1 mL に 50 μ g) 上部室に。ローダミン デキストランを最終濃度 20 mg/mL でトップの井戸に追加します。5% CO2と 37 ° C でセルを孵化させなさい。
  4. 40 μ L 中因数からの蛍光発光を測定することによっても下に蛍光のデキストランの転送を監視します。544 nm 励起と測定について 590 nm 発光マルチラベル プレート リーダーを設定します。
    注: 拡散デキストランの量が原液と確立の較正曲線を用いて定量化することができます。さらに、運動の実験は、時間コース (図 2) の間に外側室内の中の小さなサンプルを削除することによって実行できます。どんな治療がなくて、デキストランに細胞膜を通して拡散します。

4. ピューロマイシン感度を決定します。

注: レンチ ウイルスと細胞を伝達する前にそれはその特定のセル行の選択した薬の殺す曲線を決定することが重要。すべてのセルを殺すために必要な薬物濃度の最小量を決定する、選択した薬の増分の用量を用いた線量応答実験を実行します。各哺乳類セルライン、実験する前に、別の感受性を持っているので抗生物質の最適濃度を決定して下記のとおり殺すカーブ滴定法を開発してください。

  1. 検定を使用してセルをカウントします。サプリメントのミックスを含んでいる完全な内皮細胞成長媒体で 1 × 105細胞/ml の濃度で内皮細胞を再懸濁します。
  2. 内皮細胞成長培地を 100 μ l 添加の最終巻の 96 ウェル プレートにプレート 1 x 10 の4セルです。
  3. 0.1 10 μ G/ml の濃度に抗生物質を添加した培地を 100 μ l 添加 (図 3参照)。
  4. 20 × 対物を使用して顕微鏡下で 2 日ごと細胞生存率を調べる。10-14 日の培養し、細胞増殖によって 2-3 日毎ピューロマイシンを含むメディアを交換します。
  5. 各ウェル、ミックスに 10 μ L/ウェル MTS 試薬を追加し、標準培養条件で 37 ° C で 4 時間インキュベートします。
  6. シェーカーで簡単にプレートを振るし、490 プレート リーダーを用いた処理と未処理のセルの吸光度を測定 nm (図 3)。

5. 血管内皮細胞のレンチウイルスベクターの伝達

  1. プレート 1 × 105 1 mL の完全培地における内皮細胞伝達の前日。セルが 50-80% の confluency に達したときは、情報伝達を実行します。
  2. 氷の上のレンチ ウイルスを解凍し、凍結融解サイクルを避けるためにウイルス株の因数を作る。30 の 200 x g で材料をスピン上流出を避けるために開く前に管内の s。
  3. 最終 8 μ G/ml の濃度で細胞に hexadimethrine ブロマイドを追加します。
    しかし、いくつかのケースでは、セルのために有毒がある場合があります注: Hexadimethrine 臭化伝達効率ができます。したがって、最適な濃度は、伝達の前に殺害の曲線を実行することによって決定する必要があります。
  4. ミックスに軽くプレートを旋回します。感染症 (MOI) の適切な多様性でウイルス粒子 (0.5-2 x 106粒子) の間の適切な量を追加し、軽く 30 の板を渦巻きを混在させる s。
  5. RT で伝達効率を高めるための 300 x g で 45 分間の遠心でミックスを細胞ウイルスの粒子を遠心します。37 ° C で細胞ウイルスの粒子の混合物を一晩インキュベートします。
  6. 削除ウイルス粒子含有培地では慎重に、適切に廃棄します。新鮮な予め温めておいた完全な培養液中に置き換えます。
  7. 2 日目は、ピューロマイシンを選択を開始: メディアを取り出して、ピューロマイシン セクション 4 (図 3) で定める以前の正しい濃度を含む新鮮な培地に交換します。
  8. ピューロマイシンを選択後細胞を収穫し、製造元の指示に従ってキットを分離する RNA を使用して RNA を分離します。
  9. 選択した cDNA 合成を行う逆のトランスクリプションを用いた Mirna キット (材料の表を参照してください)。
  10. 引用プロトコル13によると qPCR 反応を設定します。

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結果

ここでは、EVs の宿主細胞との相互作用を調査するプロトコルについて述べる.蛍光に分類された EVs の取り込みは、共焦点顕微鏡 (図 1) によって監視されます。取り込みを追跡する EVs とインキュベーション時間を最適化できますが、内皮細胞は効率的に、EVs を取る。細胞内の EVs のより良いローカライズのファロイジンをアクチンを染色します。次に、内皮細胞の単層が育つ上にフィルター膜を使用します。ローダミン B イソチオ シアン酸デキストランはフィルター膜の上部室に適用され、内皮細胞の膜の透磁率監視ボトムチャンバー (図 2 a) に蛍光のデキストランの転送によって測定されます。通常、EVs (図 2 b) の増加量の培養血管内皮細胞の透過性を影響します。単層、そうでなければ染料にすばやく拡散する井戸を形成するかどうかを確認するため数日間セルを育てることが重要です。治療がなくて、デキストラ...

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ディスカッション

トキソ プラズマ、トリパノソーマ、リーシュ マニア、トリコモナスを含むいくつかの寄生虫が感染させた宿主細胞によって電気自動車のリリースをトリガーします。、病原体によってリリースされた EVs は宿主の免疫応答を調節したり寄生虫6間の携帯電話の通信を仲介します。まだ、これらの小胞がマラリア病に貢献する方法を示唆する少し証拠があります。ここでは、マラリア原虫の感染時に EVs の機能を調査するいくつかの方法を説明しました。例えば、PKH67 蛍光色素ラベルで受信者細胞体内の EVs の吸収を効率的に監視できます。いくつかのコントロールは、ラベルの特異性を保証するために行います。一度希釈 C と混ぜ、PKH67 色素集合体を形成する傾向があると非特異染色を決定する Ev なしで単独での色素を持つコントロールを含めることが必要ですが重要です。共焦点顕微鏡は、表面にバインドされ、本当に受信者の細胞によって内面化は小胞を区別する選択の方法です。また、それは追跡し、小胞の細胞によってとらの数を監視するための優れたツールを提供します。しかし、それは不明のまま受信者セル<...

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開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

この研究が、ノバルティス財団医療 - と (ピム) 生物学研究、ゴットフリートとジュリア ・ バンガーター ・ Rhyner 財団 (MW、ピムと) と (ピム) にフリブール大学の研究プールによって財政上支えられる部分で。追加の助成金 (KAB SM し) 外国の学者のスイス政府優秀奨学金があります。テクニカル サポート、イザベルの Fellay と Solange Kharoubi ヘスに感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
PKH67 緑色蛍光セルリンカー ミニキットSigma-AldrichMINI67-1KT
希釈剤 CSigma-AldrichG8278
poly-L-lysineSigma-AldrichP8920
PBSThermoFisher - Gibco10010023
Phalloidin CF594Biotium#00045
Hoechst 33342サーモフィッシャーH3570
プロロングゴールド退色防止マウンタンタントサーモフィッシャーP36934
ローダミンBイソチオシアネート–デキストランサーモフィッシャーR9379-250MG
インサート PETメンブレン透明 ファルコン付き プレート24ウェル用ファルコン353095
内皮細胞増殖 ミディアムMVプロモセルC-22020
ューロマイシン二塩酸塩グマアルドリッチP9620-10MLMTS
細胞増殖比色アッセイキットビジョンK300-500
臭化ヘキサジメトリンシグマアルドリッチ107689-10G
ミッション Lenti microRNA, Human has-miR-451aSigma-AldrichHLMIR0583
MISSION Lenti microRNA, ath-miR416, Negative Control 1 形質導入粒子Sigma-AldrichNCLMIR001
MISSION Lenti microRNA, HumanSigma-AldrichNCLMIR0001
Leica TCS SP5Leica Microsystems
miRNeasy mini KitQiagen217004
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit 1000 reactionsThermoFisher4366597
has-mir-451a RT/750 PCR rxnsThermoFisher001141
U6 snRNAThermoFisher001973
TaqMan Universal Master Mix II, with UNGThermoFisher4440038
StepOnePlus Real-Time PCR SystemThermoFisher4376600
ピシバイオ

参考文献

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