研究室住宅のターコイズ メダカ (による furzeri) のためのプロトコル

彼らの短い寿命のスパンと迅速なライフ サイクルを考えると、ターコイズ メダカが生物学^1,2,3で有望な新しいモデル生物として急速に高まっています。この種は、硬骨魚類の胚の休眠、急速の性的成熟と生殖のロングライフ ステージ^4,5で構成されるのユニークなライフ サイクルが特徴です。最近の作品は捕われの身と野生^6、7の両方この種の生物学の解明に貢献しています。ターコイズ メダカが、ジンバブエやモザンビークにおいてアフリカのサバンナで梅雨の時期にそのフォームを季節の新鮮な水の体に住んでいます。乾燥する季節の間に胚は休眠と呼ばれるストレス耐性のライフ ステージのおかげで水のない状態で乾いた泥で生き残る。

この種の遺伝のマップは生成された^8,9をされている、最近のゲノム シーケンスと組み立てられた^10,11をされています。いくつかの近交系実験室魚株が開発され、遺伝子とゲノム CRISPR/Cas9 を介して編集が事実上^{競争力研究所脊椎動物のモデル生物として青緑色のメダカを推進、この種で利用可能になります。12,,1314}。

この種の¹⁵のため、実験室のプロトコルは既に公開されているがこの議定書の高齢化と生存率の調査研究を具体的に目的とした実験ガイドラインの包括的なリストを開発します。この議定書によりなる青緑色のメダカ飼育でキー調整の最小数を採用することにより精通するゼブラフィッシュとメダカ飼育に既に精通している研究者です。同じ時に、このプロトコルは、盛んなターコイズ メダカ コロニーを高めるために不可欠なツールで魚飼育の経験のない研究者を提供します。

魚は、水循環システムで 28 ° C で発生 (水のパラメーターを参照)、10-20% 毎日の水処理に。3 つの異なるタンクのサイズをお勧めします: 0.8 L、2.8 L と 9.5 L各タンクは、2 mL/s の一定の水の流れを受け取ります。

1. 試薬の準備 (材料には含まれません)

注: アフリカ ターコイズ メダカ (による furzeri) は、研究所設立株式から指定できます。年間メダカ乾燥耐性胚は、メールで発送できます。8-30 ° C の温度範囲内で胚を出荷するが重要です。

1. フミン酸 (孵化) ソリューション システムで 1 グラム/L のフミン酸を溶解することにより水を準備します。オートクレーブと 10 週間のための 4 ° C でストア。
2. ともない, メガロパ アルテミア濃縮の準備、ブラインシュリンプ溶液の濃度 500 μ L/L で毎日ブラインシュリンプ ハッチャーにともない, メガロパ濃縮を追加します。
3. 以前オートクレーブ システム水にメチレン ブルー原液の 100 μ L/L を溶解することによりメチレン ブルー溶液を準備します。メチレン ブルーは光に敏感なため、暗いボトルのソリューションを保持またはアルミホイルをかぶせてください。室温ストア
4. 胚培養の固体基板としてココナッツ繊維を準備します。また、フィルター紙 (セクション 1.5 参照) を使用します。
   1. 蒸留水と掛けココナッツ繊維。オートクレーブと 5 週間のための 4 ° C でストア。
   2. 胚移植の日、湿ったココナッツ繊維でシャーレを準備します。
   3. ココナッツ繊維ヒューム フードの下で、酵母や細菌による汚染を減らすために、炎の横に直径 90 mm シャーレを入力します。
   4. 滅菌のティッシュで、1 cm の高さにココナッツ繊維を最適化します。ココナッツ繊維から余分な水分を吸収する紙をさせるため、板の上にペーパー タオルを押すことによって、水分のほとんどを削除します。金属製のスプーンを炎で熱、ココナッツ繊維の表面全体に押し下げます。これはココナッツ繊維細菌/真菌汚染を防ぎます。
5. 固体基板として胚培養のフィルター ペーパーを準備します。
   1. 胚転送日 90 mm のシャーレに合うフィルター ペーパー ディスクの 3 つの層を配置します。湿度を保つためにフミン酸溶液の 5 mL を追加します。

2. 繁殖

1. ひずみメンテナンスの青緑色のメダカの繁殖
   注: このプロトコルに従って性的に成熟に達する 〜 4 週間で 7-9 週間孵化直後と産卵のピーク。産卵数が周波数と食品の品質を供給に依存することに注意してくださいすることが重要胚収量 (セクション 5.6 を参照してください。) を高めるために繁殖タンクあたり一日に少なくとも 2 つの授乳を推奨するため、
   1. 9.5 L 飼育槽をセットアップします。システム水を記入し、1 人の男性と女性の 2 つの魚を追加します。
   2. 男性アフリカ ターコイズ メダカ表示中に嵌合、女性への嫌がらせにつながる可能性があります支配交尾ストレスを軽減し、生殖出力を増加する女性よりもわずかに小さい体サイズの男性を選択します。6/7 週齢の雌を 5 週齢の男性を設定します。
   3. オートクレーブ養生砂 2 ~ 3 cm の最終的な深さに達するとプラスチック容器 (10 x 10 x 5 cm) を記入し、飼育槽の中心に砂箱を置き。
   4. ターコイズ メダカが継続的に繁殖し、胚胚孵化のため週に一度の収穫をしましょう。
      注: 砂基板の使用集中濾過システムの課題し、将来的に別の方法で置き換える必要があります。可能な選択肢は、ゼブラフィッシュ飼育タンクの使用可能性があります。
2. 遺伝子の繁殖
   1 細胞期で同期する必要があります注: 注射に使用する胚は、受精の直後に収集される必要です。
   1. 注入および形質転換線の生成に使用する 1 つのセル段階の胚を収穫、1 人の男性 (2.1 と同じ) 2 つの女性の魚と飼育槽を設定します。
   2. 2 日前の胚のコレクション、分離個々 のタンクの男性と視覚的な接触で成人女性と男性を維持します。
   3. コレクションの日、飼育槽に男性と砂箱を追加、2 h のスポーンみましょう。

3. 胚飼育

1. 胚のコレクション
   注: 胚のコレクションは、篩分法と砂箱から胚の収穫によって実行されます。通常の条件下では、200 の胚に 30 から各サンド ボックスを含めます。
   1. コレクションの日、飼育槽からサンド ボックスを削除します。ストレーナー (ひずみサイズ ~0.9 mm) に砂箱を空にしてシステム水ですすいでください。これはオートクレーブ用砂を収集するために大きいタンクで行うことができます。
   2. 部分的にシステム水でストレーナーが水没し、優しく、渦巻き模様の中心部で一緒にグループ化する胚をさせます。
   3. 10 mL のパスツール ピペットで胚を収集します。
   4. 90 mm ~ 40 mL のシステム水でシャーレに胚を転送します。
   5. ペトリ皿光顕微鏡下で胚を検査し、絨毛膜の破裂や損傷の兆候を提示されてを削除します。
   6. 胚の漂白に直接進みます。
      注: は常にクロス歪み胚の潜在的な汚染を防ぐために魚ひずみあたり 1 つのストレーナを使用します。
2. 胚の漂白
   注: 胚の漂白微生物培養メディアを汚染するから水槽に存在を防ぐことができます。
   1. 漂白、前に収集した胚を含むシャーレからシステム水を削除するのに使い捨てのパスツール ピペットを使用します。
   2. 不要な真菌や細菌の成長を防ぐためには、収集した胚に作りたて H₂O₂ (オートクレーブ システム水 1 %v/v) の 50 mL を追加します。
   3. 50 mL の溶液で 90 mm シャーレで低速で 5 分のための胚を振る。
   4. 使い捨てのパスツール ピペットで H₂O₂ソリューションを削除し、3 回メチレン ブルー溶液 50 mL で 5 分のための胚を洗ってください。メチレン ブルー溶液を削除します。
   5. 胚に H₂O₂ (オートクレーブ システム水 1 %v/v) の 50 mL を追加し、5 分間振る。
   6. H₂O₂ソリューションを削除し、3 回メチレン ブルー溶液を 50 mL で 5 分間洗浄します。
   7. 90 mm シャーレ メチレン ブルー溶液 40 ml あたり 100 の胚の最大密度での同期の胚の開発の増加に 28 ° C で胚を孵化させなさい。
      注: は、漂白液で胚培養を拡張しません。これは卵の絨毛膜に損傷を与える可能性があります、胚死亡率を増加します。胚の漂白で変更された絨毛膜の生理学および成功を孵化卵の絨毛膜の主要な物理化学的変化の原因。
3. メチレン ブルーで胚培養
   注: メチレン ブルー溶液の液体培養寄生虫の成長を防ぎ死胚と未受精卵の検出を可能に。
   1. 培養胚、ライブ健康な胚の生存に影響を与える真菌や細菌の汚染を防ぐためにシャーレから任意の死胚 (メチレン ブルーによる染色ブルー) を削除することを確認します。
   2. 古いメチレン ブルー溶液を削除し、新鮮なソリューションに置き換えます。
   3. シャーレを 28 ° C の定温器 (図 1 a) に戻ります。7-10 日以内、開発の胚が見える黒い目を示すことを確認します。これらの胚を転送すると、ココナッツの繊維またはフィルター紙固体基板媒体 (図 1 b)。
   4. メチレン ブルーで未開発の胚を保持、毎日、監視および固体基板媒体に転送したら黒い目を開発しています。
   5. 胚を持って目に見える黒い目までの手順 3.3.1-3.3.3 を毎日繰り返します。
      注: メチレン ブルーに胚の一定の暴露が成魚の生理学の長期的変化を誘発します。
4. ろ紙に胚移植
   注: ターコイズ メダカ胚を乾燥基板、自然条件をさたに開発できます。さらに乾燥胚培養により胚を同期して同じ日にそれらを孵化研究者です。
   1. として開発された胚は 7-10 日以内表示の黒い目がある、フィルターの事前に準備された紙皿にメチレン ブルー溶液からの胚を転送するのに使い捨てのパスツール ピペットや高級ピンセットを使用します。
   2. 90 mm プレート (図 1 b) あたり 100 胚までの鉗子で胚 ~ 5 mm の間隔を広げます。
   3. パラフィルムでシャーレをシールします。
   4. 28 ° c の胚を 2-3 週間、ゴールデン アイリスを完全に開発している (図 1) を孵化の準備ができているまでにインキュベートします。
      注: は、2 週間以上の生存率は劇的に減ると準備ができて-ハッチング胚の孵化を長引かせるありません。
5. ココナッツの繊維を胚移植
   注: オートクレーブ、滅菌のココナッツ繊維 (または有機ピートモス) 使用できます有効な代替手段として固体基板孵化のため。
   1. すぐ使えるココナッツ繊維板にメチレン ブルー溶液からの胚を転送するのに使い捨てのパスツール ピペットや高級ピンセットを使用します。
   2. 〜 5 mm 離れて、最大 90 mm プレート (図 1 b) あたり 100 の胚の胚を広めます。
   3. パラフィルムでシャーレをシールします。
   4. 2-3 週間、彼らは完全に (例えば、図 1) ゴールデン アイリスを開発してまで 28 ° C で胚を孵化させなさい。
      メモ: 長期保存 (1 年) を 3 日間ポスト コレクションで胚メチレン ブルー溶液からの転送 17 ° C で固体基板板彼らは黒い目を開発するまでは、胚を孵化させなさい。

4. ターコイズ メダカの孵化

注: ターコイズ ブルー メダカ胚は、正常にフミン酸溶液¹⁴で孵化することができます。

1. 転送慎重に 50-100 は 4 ° C でフミン酸溶液でいっぱい孵化ボックスに胚を開発高級ピンセットを使用して、腐植酸は、1 g/L システム水中のフミン酸で構成されます。オートクレーブと 10 週間のための 4 ° C でストア。すべての胚が完全に浸漬されていることを確認します。フミン酸溶液は、浅い、2 cm より深くではないにする必要があります。
   注: フミン酸溶液の低温孵化が向上し、ソリューションの胚の完全な浸漬により同期孵化。
2. 28 ° C の孵化インキュベーターに孵化ボックスを配置します。ふた付き孵化ボックスをカバーします。十分な通気を供給するには、空気の供給がチューブによる孵化ボックスを接続します。
   注: 孵化の間に十分な通気ガス膀胱を埋めることができない稚魚の高率の結果 (「腹スライダー」の表現型、セクション 5.1 での注を参照)
3. 孵化翌日から孵化ボックスで適切な水質を維持するために水を加えるオートクレーブ システム 1:1 の割合で一日一回 2 cm の最終的な深さを維持します。
4. 死ご胚を固体基板に転送し、一週間後に孵化を試みます。
   注: ハッチング、ターコイズ メダカ容易に吸収することができる、生きている食糧を消費します。最適な成長の余分な新鮮な孵化したブラインシュリンプ (アルテミア) の 1 日 2 回フライをフィードします。完全飽食の記号は、それぞれの餌の 10-15 分後にフライのオレンジ色の腹部です。日常的にパスツール ピペットを使用して余分な食べ残しと分解ブラインシュリンプを吸い上げます。

5. 魚稚魚と成魚の調達

1. 孵化後 5 日で稚魚を水の再循環システムに移動します。400 μ m のフライの画面 (図 2) を装備した 0.8 L 戦車ごと慎重に使い捨てプラスチック ピペット (またはプラスチック スプーン) を使用して転送 5 青少年。
   注: 少年メダカの一部がガス膀胱、典型的な「腹スライダー」表現型、魚は浮力に到達、継続的に泳ぐことを強いることによって特徴付けられる重篤な奇形の原因と結果が入力していないということは大人の魚。これらの魚は生存の試金のためまたは効率的な繁殖のため使用できず、検閲する必要があります。
2. 過剰に新たに孵化したブラインシュリンプを孵化後 14 日まで 1 日 2 回稚魚をフィードします。毎日各タンクの底から残骸を吸い上げます。
3. 14 日齢、2.8 L タンクに転送稚魚は 850 μ m フライ画面を装備しました。このポイントから魚 ID を持つ各タンクのラベル、日付、ひずみ情報、魚の性別および魚の識別番号 (図 3) にハッチを示します。生存の試金のため個別にこの時点以降から単一タンクでそれぞれの魚を家します。
4. 次の 7 日間 〜 2 ml のブラインシュリンプ魚ごとの 1 日 2 回稚魚をフィードします。1-3 ライブ血液ワームでこの段階で魚を補完することができます (血虫が魚のためには大きすぎる場合にそれらをチョップにかみそりの刃で細かく)。水質の悪化を防ぐためには、食べられていない食糧と週 2 回余分な廃棄物を吸い上げます。
5. 孵化から 3 週間後のタンクの背面からフライ スクリーンを削除、1 日 〜 2 mL ブラインシュリンプ、血液ワームの 0.5 mL 2 回それぞれの魚の餌に開始。この段階で、稚魚の体の大きさ 1 cm に達している必要があり、フルサイズ血液ワームを摂取できる必要があります。
6. 4 週齢、ブラインシュリンプ、ワームの血 1 mL ~ 2 ml 1 日 2 回それぞれの魚をフィードします。女性は、2.8 L タンク 1 基あたり最大 3 女性の密度で共同収容できます。
7. この段階で、魚が完全な性的成熟に達することを確認します。男性の着色の兆候と大きな背、アナルと尾側のフィンの有無の確認し、女性の卵の腹部をラウンドします。
   注: 生存コホート研究のため個々 のタンクの成魚を調達に悪影響を及ぼす魚類の行動と健康。しかし、生存コホート研究グループ ・ ハウジングは、厳格な社会階層につながる社会的順位と男性の領土の確立による交絡因子を追加します。

6. 摂食

注: 研究室ターコイズ メダカの赤ちゃんブラインシュリンプ (アルテミア給餌) と血液ワーム (属ユスリカ幼虫) の組み合わせを取り込むことができます。青緑色のメダカの稚魚は、専ら赤ちゃんブラインシュリンプを供給されています。少年と大人の魚は 1 日 2 回を供給、ブラインシュリンプと血液ワーム (図 2)。理想的には、このプロトコルでは、魚には、複数回の日を与えることができる、2 授乳を超える示されています。

1. ブラインシュリンプを養殖
   1. ブラインシュリンプ ハッチャーに逆浸透 (RO) 水と紅海の塩 350 g 10 L を追加し、通気管と通気による解散。
   2. 5 ml の高度不飽和脂肪酸 (ともない, メガロパ) の文化を豊かに。
   3. 孵化ソリューションにブラインシュリンプ嚢胞の 20 グラムを追加します。ブラインシュリンプの嚢胞が水の表面で浮かぶ、適切な酸素化と文化の循環を確保し、することを確認します。
      注意: 乾燥ブラインシュリンプ嚢胞の毎日の因数が 4 ° C で保存することができます。
   4. 次の日の午後にともない, メガロパの 5 mL のもう一つの因数を持つカルチャを指定します。
2. 孵化したブラインシュリンプを収穫
   注: 開始の文化から 〜 36 時間後ブラインシュリンプです (令 II 相) の収穫の準備ができて。
   1. 5 L、ハッチャーの底面にタップを使用してコンテナー内の文化を収集し、10 分間座ってみましょう。
   2. 10 分後 5 L 容器の上部から塩水エビの殻 (茶色) を削除し、メッシュで孵化したブラインシュリンプ (オレンジ色) をフィルター処理します。非孵化卵や死んだブラインシュリンプが含まれているコンテナーの下部にある土砂を除外するのに注意を払います。
   3. 2 L 容器に RO 水で孵化したブラインシュリンプを洗い、10 分間座ってみましょう。
   4. 10 分後再びメッシュでブラインシュリンプをフィルターし、RO 水 2 L で収集します。
   5. ブラインシュリンプ ソリューションが孵化した非嚢胞と塩水エビ殻から解放されるまで、前の 3 つの手順を繰り返します。
   6. スクイズ ボトルを供給するために、2 L コンテナーからブラインシュリンプを転送します。
      注: は、かなり堅牢で信頼性の高い、ブラインシュリンプを養殖します。ただし、ブラインシュリンプ孵化失敗した場合の不足を避けるためより小さい (500 mL) バックアップ hatchers を使用できます。
3. バックアップのハッチャーの設定
   1. 通気による RO 水の 500 mL の紅海の塩の 17.5 g を溶解します。
   2. ともない, メガロパの 500 μ L で文化を豊かに。
   3. ブラインシュリンプの嚢胞の 2 g を追加します。
   4. 18-24 h 後ともない, メガロパの 500 μ L でもう一度文化を提供します。
      注: ブラインシュリンプ ~ 24 h 後収穫する準備ができています。
4. ライブ血液ワームの準備
   1. 授乳の直前に RO 水を使用してこし器を通って血液ワームの適切な量をフィルターします。
      メモ: ライブ血液ワームは 4 ° C で 7-10 日間保存できます。
   2. プラスチックの容器に少量の RO 水と血液ワームをすすいでください。
   3. プラスチックのパスツール ピペット (狭い先端を削除)、血液ワーム混合物の餌を取る。
      注: 非制御震源から生きている食糧と共に植民地研究室メダカを餌寄生虫や病原微生物からの外部汚染リスクを追加します。将来は、アドホック滅菌飼料を開発する必要があります。

7. メダカ研究所ひずみジェノタイピング

注: 各ひずみ内で性別を決定するためだけでなく、, 青緑色のメダカ系統を区別するには、特定の遺伝子 (マイクロ サテライト) マーカーは使用⁹ (表 1) をすることができます。

1. サンプリング
   1. ぬれたスポンジの上に網で魚をしっかりと保持します。
   2. 尾鰭の綿棒を使用して、蓋から魚体から 2-3 スケール、綿棒します。
   3. 綿棒の縮尺を選択し、2-3 水酸化ナトリウム溶液 1 mL の管にスケールを転送 (200 μ L 0.5 mol/L 水酸化ナトリウム、1% β-メルカプトエタノール、および 0.5% ポリビニルのピロリドン)。
   4. スピン 15 PCR チューブのスケールが NaOH 溶液に完全に没頭していることを確認します。
2. ゲノム DNA の隔離
   1. 95 ° C で 20 分間サンプルをインキュベートします。
   2. RT でクール、1 の 1/10 量とサンプルを中和する pH 8.0 M トリス-HCl。
   3. 全速力で 5 分のサンプルを遠心します。

8. 水のパラメーター

注: その用途はアダルト表現の生物の飼育対象種の寿命を通して非常に安定した飼育条件が必要です。したがって、青緑色のメダカなどの水の生物を培養するには、水のパラメーターの厳密な制御が必要になります。追加の 4 ステップでの水の循環は水のろ過、水のパラメーターは、同じ水の条件を時間をかけてすべてのタンクを提供する制御を達成するために堅牢な基礎を保証します。逆浸透膜 (RO) 水、商業海洋塩と重炭酸ナトリウムからシステム水を再構成することをお勧めします。

1. 水循環システム方式: 最初に、魚から廃水タンク フローのすべての非食べた残骸およびより大きい粒子をキャプチャする固体粒子の金属フィルターを。金属フィルター洗浄週 3 回第二に、最初の機械的なろ過水は大きい油溜めで伝え、バクテリアが亜硝酸塩および硝酸塩; にアンモニアを変換、バイオ フィルターに送られます第三に、バイオ フィルターから 25 μ m フィルター スリーブは、細かいサイズの粒子をトラップに水が注入されます。最後に、水には、細菌やウイルスからの水を殺菌する紫外線の (紫外線) ランプが流れます。次の 4 つのステップ、ろ過された水を水槽に返します。
2. タンクで微生物の成長を減らすし、硝酸塩の蓄積を防ぐ、減らす、全体的な塩分、システムの水の 10-20% は、日常的に破棄されます。
3. 水 28 ° C、7.0 から 7.5 の範囲内で水 pH 一定で温度を一定に維持します。
4. メダカは塩分の広い範囲を許容、oodinosis を避けるために範囲 650 710 のマイクロ Siemens 内伝導率は保持します。年間 12 h ダーク/ライト サイクルは、植民地の健康と生産性を保証します。
   注: メダカ 1500 マイクロ-シーメンスまで水の伝導率を耐えることができます。

ターコイズ メダカ適切な飼育は、見る: GRZ ひずみ (例えば図 4 a) で 12-18 週まで生存期間中央値の結果します。生存期間中央値の変化は、食事療法、摂食頻度、および温度条件の住宅によって異なります。貧しい飼育結果提示生存曲線では、早期死亡と生存時間中にいくつかの変曲点 (図 4 b) によって特徴付けられるの繰り返し、突然滴に増加しました。

図 1: それぞれ培養基質との代表的な胚発達段階。(A)たて 28 ° C でインキュベーターでメチレン ブルー溶液で培養した胚を収集(B)固体媒体に転送する準備ができての胚か紙やココナッツ繊維をフィルターします。(C)胚孵化するのに典型的なゴールデン アイリスを表示する準備が整いました。スケール バーは均等に 1 mmこの図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 2: 青緑色のメダカが孵化後の開発の段階。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 3: ステージ 3 以降から魚の代表魚 ID タグ。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 4: 70 男性ターコイズ メダカの代表的な生存曲線。(A)ターコイズ メダカの研究所発生の一般的な生存率曲線です。(B) (ブラック) 最適な飼育条件下で発生する魚から得られる生存曲線の比較と貧しい飼育 (赤と青)。赤色水平の破線は、50% 生存期間は、平均寿命 (x 軸で示される) で交差する生存曲線を示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

表 1: 遺伝子型プライマーひずみ識別のため。

すべての著者は財務および非財務の利害を宣言しません。