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方法論記事

水溶性と不溶性の Huntingtin 種の解像度の分別

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DOI：

10.3791/57082

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2018年2月27日

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1Department of Psychiatry and Human Behavior, University of California Irvine, 2UCI MIND, University of California Irvine, 3Department of Neurobiology and Behavior, University of California Irvine, 4Board of Governors Regenerative Medicine Institute, Cedars-Sinai Medical Center

この記事について

サマリー

不溶解性および溶ける変異ハンチンチン種マウス脳と細胞培養からの分別の方法を説明します。記載されているメソッドは、特性評価および huntingtin 蛋白質フラックスと病気の発症と摂動存在下での蛋白質の恒常性の分析にエイズの定量化の便利

要約

誤って折りたたまれたタンパク質の蓄積は、ハンティントン病 (HD) および他の多くの神経変性疾患の中心です。具体的には、HD の病理学的特徴は高分子量複合体に突然変異体の HTT (mHTT) 蛋白の異常な蓄積、断片および他の蛋白質の細胞内封入体が構成されます。測定および蛍光顕微鏡、西部のしみの分析、フィルターなどの mHTT を含む集計の様々 な形の貢献を理解する従来の方法は、アッセイをトラップします。

ただし、これらのメソッドのほとんどは、特定の構造、したがって mHTT タンパク質フラックス集計溶解度と解像度の複雑な性質のための完全な状態を解決できません。

集計 mHTT の変更されたフォームと複合体の様々 な識別、分離、細胞凝集体とフラグメントの可溶化は必須です。ここで分離し、可溶性 mHTT、モノマー、オリゴマー、フラグメントを視覚化する手法について述べるし、不溶性の高分子量分画法蓄積 mHTT 種。HMW mHTT を追跡、病気の進行とマウス動作の読み出しに対応し、有益ある特定の治療上の介在の1によって調整されています。この方法は、マウスの脳、末梢の組織および細胞培養で使用できるが他のモデル システムや疾患のコンテキストに適応することがあります。

概要

適切な折りたたみをするタンパク質品質管理ネットワークの中断、細胞蛋白質の低下はアルツハイマー病 (AD)、パーキンソン病 (PD)、ハンチントン病 (HD)、病理学に可能性が高い中央および他の「タンパク」2,3 を障害します。プロテオステイシス ネットワーク コンポーネントおよび病理学への貢献の詳細な理解したがって改善の治療上の介在を開発することが重要です。HD は polyglutamines (polyQ) (HTT) huntingtin 蛋白質4での拡張されたストレッチの結果 HD 遺伝子内の CAG リピートの異常な拡張によって引き起こされます。HD 発症の一貫した病理学的機能、蓄積、および正常細胞の恒常性と機能にいくつかの方法で干渉する示されている HTT 脳の地域および末梢組織での集計は、結果として得られる折りたたみとして、します。5,6。 中の HTT は普遍的表現、線条体中とげだらけニューロンは、選択的に脆弱性が存在と影響を受ける最もあからさま HD 病因にも関連付けられている注目すべき皮質萎縮。

脳内 HD 患者と動物モデルの HTT の集合体の形成は通常病気の進行とドミナント ネガティブ益 mHTT7の関数のプロキシ マーカーを務めています。どのタンパク質の折りたたみと集約に貢献するかもしれない mHTT 誘発毒性正確なメカニズムは不明と様々 な動物モデルの HD 患者の頭脳のこれらの介在物の生成は、不変、必然的な機能です。介在物表示を蓄積した HTT 断片を N 末端の主構成するその分解を示す polyQ を拡大し、9 8,をスプライシングの代替と同様、フルレングスの HTT の処理再生ことがあります、HTT ビジュアルエフェクト N 末端フラグメントの病因に重要な役割は、急速に集計することができます、核と加速や集計プロセス10を伝達する HTT の病理学的フォームを構成するかもしれない。

ただし、これらの介在物の存在では、HTT による毒性や細胞死11と必ずしも関連しません。HTT は不溶性の集計および介在物12に可溶性オリゴマー種と β シート線維を通じて水溶性モノマーから集計プロセスを経るに提案されています。標準生化学的アッセイを介してこれらの様々 な蛋白質種を解決する低洗剤換散バッファーで安定性と標準的な生化学的アッセイを使用して可視化の難しさのためフィールドで課題となっています。したがって、方法論的考察、程度や蓄積・集計 mHTT のパターンを検出するに重要です。

ここで提示されたプロトコルは HTT は、具体的に HD 病因と病気進行1,13 と密接に追跡するために表示される不溶性の HMW HTT 種の形成のいくつかの中間を可視化するメソッドを提供します。、14。解決および mHTT の複数の種を追跡することは、研究者に病因を研究し、変調して病気の発症に影響を与える潜在的な治療上の介在を評価する生化学的なツールを提供します。

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プロトコル

動物の倫理の声明 - 実験が実施されたケアと健康の国民の協会および制度的動物ケアおよび使用委員会 (承認された動物の研究プロトコルの実験動物の使用のためのガイドに従い、IACUC) カリフォルニア大学アーバイン校、AAALAC 認定機関。すべての努力は、動物の苦痛を最小限に抑えるために行われました。

1. 換散バッファーの準備

  1. 「水溶性」の換散バッファーの準備 (10 mM Tris pH 7.4 では、1 %x トリトン 100、150 mM の NaCl、10% グリセロール) と 0.22 μ m のフィルターを通して無菌フィルター。
    1. 作業「可溶性」換散バッファーの N-エチルマレイミド (NEM) を測定し、100% に溶解し 100 mM phenylmethysulfonyl フッ (PMSF) で十分に溶かして江藤。
      注: 換散バッファー阻害剤: (i) 20 mM N-エチルマレイミド (NEM);(ii) 0.2 mM PMSF;(iii) 1 mM バナジン ナトリウム (Na3VO4);(iv) 1 μ G/ml leupeptin;(v) 1 μ G/ml アプロチニン;(vi) 20 mM フッ化ナトリウム (NaF)。
      注意: は、プロトコル全体 NEM を操作するときに、マスクを着用します。換散バッファーの作業行う必要がありますアクティブな阻害剤を確保するため新鮮です。
    2. プロテアーゼ阻害剤と水溶性の換散バッファーの次の順序で阻害剤を追加: Leupeptin、アプロチニン、バナジン ナトリウム (Na3VO4) 冷たい換散バッファーのボリュームまでフッ化ナトリウム (NaF)。
  2. 「不溶性」の換散バッファーの「水溶性」換散バッファーの 2 mL に 20% SDS の 500 μ l を追加することにより 4% SDS への補足します。室温に置いたまま。
    注: SDS を沈殿が 4 ° C で保管するとき部屋の温度で、これをしてください。最終的な換散バッファー組成: 10 mM トリス (pH 7.4)。1% トリトン X-100;150 mM の NaCl;10% グリセロール;4 %sds (不溶性のみ)。

2. 水溶性/不溶性分別のプロトコル

注: は、回路図の図 1を参照してください。

  1. 各サンプルのため管の 2 つのセットのラベル:「水溶性」と「不溶性」。
  2. 組織に (1.1.1 参照) プロテアーゼ阻害剤を添加した冷たい作業可溶性換散バッファーの X μ L を追加します。
    注: X = ボリュームによって異なります組織量;表 1を参照してください。
  3. マウス脳組織 (すなわち、線条体)、dounce ガラス 1 mL douncer と「不溶性」にピペットでゆっくり 30 回はチューブ (氷の上維持) をラベル付けします。
    注: 気泡を形成する不完全な均質化をもたらす可能性がありますと、douncing を起動した後の液体の表面を壊さないように気をつけてください。
  4. 細胞 (すなわち、hela 細胞、HEK293T)、寒さ、1x PBS で 1 回細胞をすすいでください。PBS を外し、セル換散バッファーの最小ボリュームに適用し、細胞スクレーパーと。
    注: の上記のセル行細胞 6 ウェル プレート当たり 5 x 10 の5セルでメッキ, 付近の confluency に成長して.1 つはよくマウス線条体に使用されるボリュームと同等です。
  5. 転送磨砕液や細胞ライセートにラベル「不溶性」チューブと氷 1 h (開始クロック最終管が処理された後) に溶解します。
    注: セル lysates のカップ培養を開始する前に細胞塊を破るために数回を刻んだ。気泡の形成を避けるため。簡単に渦パルス 1 の各サンプル溶解の途中で s。
  6. 20 分間 15,000 × g で 4 ° C でサンプルを遠心します。
  7. 「水溶性」分数として清を回復します。
    1. ピペットを使用して削除、これは分数を汚染するとペレット/曇りの層を邪魔しないように注意してください。「水溶性」にピペットで移しなさい可溶性画分は、チューブをラベル付けします。氷の上を保ちます。
  8. 各洗浄後 5 分 15,000 × g で 4 ° C で 500 μ L の換散バッファー (x2) と遠心分離機でペレットを洗浄します。オフ戻曇り層の一部が場合、それは大丈夫です。
  9. 最終的な洗浄の後組織ペレットだけを残して残りの洗浄バッファーのすべてを削除します。
    注意: このポイントから、不溶性サンプルは必要があります常温保管今。
  10. X μ L 換散バッファー 4 %sds を添加したペレットを再懸濁します (ペレット サイズに応じて音量を調整することができます;テーブル 1を参照)。
  11. 30 の各サンプルを超音波プローブ超音波発生装置で室温で s (125 ワット、20 kHz、パルス、振幅 40%、材料表を参照してください)。
  12. サンプル (沸騰ローリング) を煮る 30 分;簡単に遠心分離機 (15 s) 任意のサンプルを失わないよう 6,000 x g で。
  13. DC (互換性のある洗剤) 蛋白質の試金の実行 (材料の表を参照してください) または Lowry 蛋白質の試金 (細胞培養用それぞれの換散バッファーのサンプルの 1/5、1/10 組織溶解液のための開始の希釈を推奨) タンパク質の濃度を測定します。
    注: タンパク質の濃度は、高濃縮のための DC またはロウリー アッセイを使用して読み取る必要があります。
  14. 凍結融解の問題を避けるために 50 μ L バッチに割り切れるサンプル。
    注: プロトコルを一時停止できるここでさらに生化学分析の前に-20 ° C で両方の分数を格納することによって

3 西部のしみと定量化

  1. 実行報告として西部のしみ他1,13サンプル バッファー (ローディングの染料、削減 x 1 x 1.6) で 1:1 の 30 μ g 希釈します。
    注: 分数あたり蛋白質の 30 μ g 十分、しかし最適解像度に調整することができます。3-8% トリス酢酸ポリアクリルアミドゲル不溶性画分を使用してください。4-12% ビス トリス ゲルは可溶性画分に適しています。
  2. 簡単に 5 分遠心分離機のサンプル (沸騰) を沸騰 (15 s) サンプルを収集するために 6,000 x g で。
  3. 減らされたサンプルの製造元のプロトコルに従って SDS-PAGE および西部のしみ、分数を分析します。
    注: 不溶性画分を 0.45 μ M 硝酸セルロースの膜に転送されたとき最もよい解決します。0.45 または 0.2 μ M 硝酸セルロースは興味の蛋白質のサイズによって可溶性画分に使用できます。高分子材料の最適な移転に必要ないくつかの最適化があります。
  4. タンパク質効率の読み込みを視覚化するタンパク質全体染色 (例えばMEMcode、参照テーブルの材料) で膜を染色します。
    注: 西部のしみは、平均輝度によって分析できます。可溶性画分は、実験システムに適した家は維持蛋白質の最高に正規化することができます。相対的な蛋白質量として不溶性画分は、可逆的なタンパク質染色または別のしみにヒストン 3 正規化によって確認されました。

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結果

水溶性と不溶性のセル lysates 分別を次の解像度は、ウエスタン解析とフィルター障害アッセイ (図 2) を使用して検出できます。例として HEK293T 細胞のトランスフェクション試薬 (例えば、lipofectamine 2000) を使用してを導入させた、HTT エクソン 1 エンコード cDNA 97 グルタミンを含む繰り返し15ポリ プロリンの豊富な地域に続いて、これらの細胞を許されました。特急 44 h. 細胞のいずれかの 5 μ m プロテアソームをブロックする MG132 または 18 収穫前に h ととして分離するためのコントロールとして DMSO 上記。分別のプロトコルに従い変異 HTT エクソン 1 水溶性モノマーとして約 45 kDa Bis トリス ページ ゲル 4-12%、3 ~ 8% トリス酢酸ページのゲル (図 2 a) の HMW の不溶性蓄積された種...

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ディスカッション

定量的な一貫性のある結果を確保するため上記のプロトコルのいくつかの対策が必要です。両方分数で mHTT が複数の凍結融解時に時間をかけて集計を自発的に形成するまず、特に高濃度で。したがって、タンパク質プレップの因数を凍結し、上記のプロトコルで説明されているように分析を実行する前に必要な量のみを解凍するが重要です。さらに、不溶性画分利回り融解時に白い鉛塩法は、再構成は追加 5 s 超音波パルス、5 分沸騰させると、再定量生化学的アッセイによる解析する前に、必要にあります。

この試金のため定量的な解像度は、読み込みコントロールまたは各サンプル内の家は維持遺伝子の可溶性画分の平均輝度を正規化することで達成可能です。下図のように、GAPDH として使用された家は維持遺伝子可溶性画分のそれは主に細胞質 (図 1) に局在するよう。他の一般的に使用される家は維持蛋白質は、アクチン、α-チューブリンと Erk 1/2 です。ただし、適切な正規化蛋白質は左右されない正確な正規化の定常状態式を確保するために検討されているシステムの最適化必要...

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開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

この作品は、NIH (RO1 NS090390) によって支えられました。博士ジョアン Steffanfor 技術支援とこの試金の開発の間に議論に感謝も申し上げます。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
滅菌フィルターミリポアSCGP505REスクリューキャップ、滅菌真空フィルター
1 mL ティッシュグラインダー、DounceWheaton357538
SonicatorQsonicaモデル Q125
DC タンパク質アッセイBiorad5000111Lowry アッセイ
Tris 1M 緩衝液Alfa AesarJ60636
Triton X-100FisherBP151-100
NaCl 5M溶液TeknovaS0251
グリセロールFisherBP229-1
20% SDS溶液TeknovaS0295
N-エチルマレイミドSigmaE1271
フェニルメチルスルホニーフッ化SigmaP7626100mMストック溶液を100%作成EtOH、4°Cで保存。C
オルトバナジン酸ナトリウムSigmaS6508水中で 0.5M ストック溶液を作成
ロイペプチンSigmaL2884水中で 10mg/ml ストック溶液を作成
アプロチニンSigmaA1153水中で 10mg/ml ストック溶液を作成
フッ化ナトリウムSigmaS4504水中で 500mM ストック溶液を作成
アンチ HTTミリポアMAB5492ウェスタンブロットには1:1000、フィルター遅延アッセイには1:500
Anti-GAPDHNovus BiologicalsNB100-56875可溶性ウェスタンブロットには1:1000を使用
に匹敵する物 を使用

参考文献

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