水溶性と不溶性の Huntingtin 種の解像度の分別

サマリー

不溶解性および溶ける変異ハンチンチン種マウス脳と細胞培養からの分別の方法を説明します。記載されているメソッドは、特性評価および huntingtin 蛋白質フラックスと病気の発症と摂動存在下での蛋白質の恒常性の分析にエイズの定量化の便利

要約

誤って折りたたまれたタンパク質の蓄積は、ハンティントン病 (HD) および他の多くの神経変性疾患の中心です。具体的には、HD の病理学的特徴は高分子量複合体に突然変異体の HTT (mHTT) 蛋白の異常な蓄積、断片および他の蛋白質の細胞内封入体が構成されます。測定および蛍光顕微鏡、西部のしみの分析、フィルターなどの mHTT を含む集計の様々 な形の貢献を理解する従来の方法は、アッセイをトラップします。

ただし、これらのメソッドのほとんどは、特定の構造、したがって mHTT タンパク質フラックス集計溶解度と解像度の複雑な性質のための完全な状態を解決できません。

集計 mHTT の変更されたフォームと複合体の様々 な識別、分離、細胞凝集体とフラグメントの可溶化は必須です。ここで分離し、可溶性 mHTT、モノマー、オリゴマー、フラグメントを視覚化する手法について述べるし、不溶性の高分子量分画法蓄積 mHTT 種。HMW mHTT を追跡、病気の進行とマウス動作の読み出しに対応し、有益ある特定の治療上の介在の¹によって調整されています。この方法は、マウスの脳、末梢の組織および細胞培養で使用できるが他のモデル システムや疾患のコンテキストに適応することがあります。

概要

適切な折りたたみをするタンパク質品質管理ネットワークの中断、細胞蛋白質の低下はアルツハイマー病 (AD)、パーキンソン病 (PD)、ハンチントン病 (HD)、病理学に可能性が高い中央および他の「タンパク」^{2,3 を}障害します。プロテオステイシス ネットワーク コンポーネントおよび病理学への貢献の詳細な理解したがって改善の治療上の介在を開発することが重要です。HD は polyglutamines (polyQ) (HTT) huntingtin 蛋白質⁴での拡張されたストレッチの結果 HD 遺伝子内の CAG リピートの異常な拡張によって引き起こされます。HD 発症の一貫した病理学的機能、蓄積、および正常細胞の恒常性と機能にいくつかの方法で干渉する示されている HTT 脳の地域および末梢組織での集計は、結果として得られる折りたたみとして、します。^5,6。 中の HTT は普遍的表現、線条体中とげだらけニューロンは、選択的に脆弱性が存在と影響を受ける最もあからさま HD 病因にも関連付けられている注目すべき皮質萎縮。

脳内 HD 患者と動物モデルの HTT の集合体の形成は通常病気の進行とドミナント....

プロトコル

動物の倫理の声明 - 実験が実施されたケアと健康の国民の協会および制度的動物ケアおよび使用委員会 (承認された動物の研究プロトコルの実験動物の使用のためのガイドに従い、IACUC) カリフォルニア大学アーバイン校、AAALAC 認定機関。すべての努力は、動物の苦痛を最小限に抑えるために行われました。

1. 換散バッファーの準備

1. 「水溶性」の換散バッファーの準備 (10 mM Tris pH 7.4 では、1 %x トリトン 100、150 mM の NaCl、10% グリセロール) と 0.22 μ m のフィルターを通して無菌フィルター。
   1. 作業「可溶性」換散バッファーの N-エチルマレイミド (NEM) を測定し、100% に溶解し 100 mM phenylmethysulfonyl フッ (PMSF) で十分に溶かして江藤。
      注: 換散バッファー阻害剤: (i) 20 mM N-エチルマレイミド (NEM);(ii) 0.2 mM PMSF;(iii) 1 mM バナジン ナトリウム (Na₃VO₄);(iv) 1 μ G/ml leupeptin;(v) 1 μ G/ml アプロチニン;(vi) 20 mM フッ化ナトリウム (NaF)。
      注意: は、プロトコル全体 NEM を操作するときに、マスクを着用します。換散バッファーの作業行う必要がありますアクティブな阻害剤を確保する....

結果

水溶性と不溶性のセル lysates 分別を次の解像度は、ウエスタン解析とフィルター障害アッセイ (図 2) を使用して検出できます。例として HEK293T 細胞のトランスフェクション試薬 (例えば、lipofectamine 2000) を使用してを導入させた、HTT エクソン 1 エンコード cDNA 97 グルタミンを含む繰り返し¹⁵ポリ プロリンの豊富な地域に続いて、これらの細胞を許されました。特急 44 h. 細胞のいずれかの 5 μ m プロテアソームをブロックする MG132 または 18 収穫前に h ととして分離するためのコントロールとして DMSO 上記。分別のプロトコルに従い変異 HTT エクソン 1 水溶性モノマーとして約 45 kDa Bis トリス ページ ゲル 4-12%、3 ~ 8% トリス酢酸ページのゲル (図 2 a) の HMW の不溶性蓄積された種.......

ディスカッション

定量的な一貫性のある結果を確保するため上記のプロトコルのいくつかの対策が必要です。両方分数で mHTT が複数の凍結融解時に時間をかけて集計を自発的に形成するまず、特に高濃度で。したがって、タンパク質プレップの因数を凍結し、上記のプロトコルで説明されているように分析を実行する前に必要な量のみを解凍するが重要です。さらに、不溶性画分利回り融解時に白い鉛塩法は、再構成は追加 5 s 超音波パルス、5 分沸騰させると、再定量生化学的アッセイによる解析する前に、必要にあります。

この試金のため定量的な解像度は、読み込みコントロールまたは各サンプル内の家は維持遺伝子の可溶性画分の平均輝度を正規化することで達成可能です。下図のように、GAPDH として使用された家は維持遺伝子可溶性画分のそれは主に細胞質 (図 1) に局在するよう。他の一般的に使用される家は維持蛋白質は、アクチン、α-チューブリンと Erk 1/2 です。ただし、適切な正規化蛋白質は左右されない正確な正規化の定常状態式を確保するために検討されているシステムの最適化必要.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
滅菌フィルター	ミリポア	SCGP505RE	スクリューキャップ、滅菌真空フィルター
1 mL ティッシュグラインダー、Dounce	Wheaton	357538
Sonicator	Qsonica	モデル Q125
DC タンパク質アッセイ	Biorad	5000111	Lowry アッセイ
Tris 1M 緩衝液	Alfa Aesar	J60636
Triton X-100	Fisher	BP151-100
NaCl 5M溶液	Teknova	S0251
グリセロール	Fisher	BP229-1
20% SDS溶液	Teknova	S0295
N-エチルマレイミド	Sigma	E1271
フェニルメチルスルホニーフッ化	Sigma	P7626	100mMストック溶液を100%作成EtOH、4°Cで保存。C
オルトバナジン酸ナトリウム	Sigma	S6508	水中で 0.5M ストック溶液を作成
ロイペプチン	Sigma	L2884	水中で 10mg/ml ストック溶液を作成
アプロチニン	Sigma	A1153	水中で 10mg/ml ストック溶液を作成
フッ化ナトリウム	Sigma	S4504	水中で 500mM ストック溶液を作成
アンチ HTT	ミリポア	MAB5492	ウェスタンブロットには1:1000、フィルター遅延アッセイには1:500
Anti-GAPDH	Novus Biologicals	NB100-56875	可溶性ウェスタンブロットには1:1000を使用

に匹敵する物 を使用