この方法論の全体的な目標は、固定細胞における微小管、中間径フィラメントの 2D デュアル カラー dSTORM イメージを実行するために、画像の獲得および復興にサンプル準備から最適な実験条件を与えるには
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この記事について
サマリー
要約
アクチン フィラメント、微小管、中間径フィラメント (場合) から成る骨格はセルの形状、極性・細胞運動の制御に重要な役割を果たしています。微小管とアクチン ネットワークの組織が広く研究されていますが、IFs のまだ完全に特徴付けられない。IFs は、細胞の細胞質に広がるネットワーク 10 nm とフォームの平均直径を有する。アクチンと微小管分子モーター、細胞骨格のリンカーを物理的に関連付けられています。このタイトな関連付けは、ほとんどの細胞機能に必要な 3 つの細胞骨格ネットワークの連携制御機構を確保する規制メカニズムの核心です。したがって、If だけで、また一緒にそれぞれの他の骨格のネットワークを可視化することが重要です。ただし、場合ネットワークはほとんどの細胞の種類、グリア細胞の特に中に非常に密な解像度に標準の蛍光顕微鏡と達成するために非常に困難なる (~ 250 の解像度を横 nm)。直接確率光再建顕微鏡 (dSTORM) はゲイン 1 桁の水平解像度で可能にする技法です。ここでは、横 dSTORM 解像度ある場合ネットワークの特に、もし束周囲の微小管の密な組織を解決するための十分なことを示します。このような緊密な関連が説明する、これら 2 つのネットワークの連携制御機構に参加する可能性がどのようにビメンチン IFs テンプレートと微小管の組織を安定させると同様、微小管依存の小胞輸送に影響を与える可能性があります。もっと一般に、デュアル カラー dSTORM 技術 2 つの細胞骨格成分の観測が彼らの相互作用に新しい洞察力をもたらす方法を示す.
概要
細胞の中間径フィラメント (IFs) は、直径 10 nm のヒト - または場合蛋白質の特定のサブセットを携帯型の heteropolymers です。IFs は、細胞運動、増殖やストレス応答など細胞機能の広い範囲に参加します。その重要な役割が 90 以上の人間の病気直接場合蛋白質で突然変異によって引き起こされるという事実によって強調表示されます。例えば、腫瘍の増殖および1,2,3を広める場合組成の変化を伴います。細胞の極性形成、部門と移行2,3などの細胞機能を制御する共同で 3 つの骨格システムが働くという証拠が高まっています。建築の空間と機能の間の密結合なので、他のフィラメントの場合の構造への洞察力を得るし、細胞骨格のクロストークを理解することが重要です。この記事は、超解像技術のデュアル カラー dSTORM (直接確率再建顕微鏡)4との間の相互作用を調査する使用方法と微小管を実行するプロトコルを提供しますで固定、培養2 次元 (2 D) 内のセル。
いくつかの超解像技術は、過去に開発されている年とそこ発見 2014年
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プロトコル
1. Coverslips 準備 (日 1、30 分)
- プラスチック ラックに 18 mm nº1.5H (5 μ m ± 170 μ m) のガラス coverslips を配置します。
- アセトン、5 分間浸漬が入った 100 mL ビーカーにラックを置きます。
- 無水エタノール、5 分間浸漬が入った 100 mL ビーカー ラックに転送します。
- 無水エタノールが入った新しい 100 mL ビーカーにラックを転送し、超音波クリーナー装置にビーカーを置きます (材料の表参照) 室温で。"On"を押すし、10 分間待ちます。
- 層流フードの下でラックを入れ、乾燥または乾燥フィルターの空気の流れと coverslips coverslips を聞かせてください。
- プラズマ クリーナー装置で coverslips にラックを置きます。真空ポンプのスイッチ、ドアを閉め、真空洗浄直後後 1 分使用、coverslips プラズマにスイッチし 3 分待ちます。それらを保存しません。
2. セルめっき (日 1、20 分)
- 10 cm 直径プラスチック シャーレにグリア細胞ライン U373 最小必須培地 (MEM) で 10% 牛胎児血清、1% ペニシリン-ストレプトマイシンおよび 1% 非本質的なアミノ酸を成長します。
- 層....
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結果
アルファ Plan Apo 100 X 512 x 512 カメラ 50 mW 405 nm と 100 mW 488、561、642 nm 固体レーザ、EMCCD 搭載顕微鏡/570 650 を渡す/655 放出フィルターがロングパス 1.46 の目標とバンド以下に示す代表的な結果を得るのために使用されました。
図 1 aは、対雑音比 raw 画像取得時に使用する分子密度と信号の例を与えます。良い品質の画像は、隣接分子間 〜 1 μ m の最小値が得られます。良い点滅状態で fluorophores が付いてはのみ 1 つのフレーム内に存在する必要があります。画像バッファー条件 (pH、還元剤、酸素システムを消去) を調整する必要があります良い点滅とレーザーに- とオフ-料金の蛍光物質したがって、義務に影響を及ぼすサイクル (、fluorophore に費やしている時間の割合オン状態)
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ディスカッション
プロトコルの重要なステップ
微小管の dSTORM 画像内のアーティファクトとグリア細胞における IFs を最小にするプロトコルをご紹介します。サンプル準備およびイメージ投射の各ステップでの成果物を作成できます: 固定、ブロック、反応、ドリフトの買収により、非最適な点滅条件23。我々 は、最も重要な手順以下リストします。
表面に蛍光物質の非特異的結合を制限する重要なステップは、クリーニング、coverslips したがって dSTORM 画像の背景ノイズを制限します。
PFA (パラホルムアルデヒド) (ステップ n ° 3) とグルタールアルデヒドとトリトン、および固定のミックスを使用して抽出し、固定のソリューションの手順とサンプルを修正お勧めします。固定のプロトコルは、Chazeau et al12から適応された: 我々 は 60 に抽出/.......
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開示事項
著者は競合する金銭的な利益を宣言しません。
謝辞
ミカエル ・ Lelek、オレシティス Faklaris と有意義な議論のニコラス ・城下町、アンドレイ Aristov と超解像技術のヘルプについてエレナ練とシャイラージャ ・ Seetharaman 原稿の注意深い読書のために感謝します感謝するフランス国立研究機関 (ANR 10 INSB 04; サポート フランス バイオ イメージング インフラストラクチャ ネットワークと同様、UtechS フォトニック バイオ イメージング (Imagopole) Citech のパスツール研究所 (パリ, フランス)未来への投資)、および地方イル (ドメーヌ d プログラム ' 水利 Majeur Malinf) Elyra 顕微鏡の使用のため。この仕事に支えられ、リーグ Contre le がんとフランス国立研究機関 (ANR-16-CE13-0019)。
....アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 最小必須培地(MEM) | Gibco | 41090-028 | 細胞培養 |
| 非必須アミノ酸 | Gibco | 1140-050 | 細胞培養 1/100e |
| ペニシリン-ストレプトマイシン | Gibco | 15140-122 | 細胞培養 1/100e |
| F&oE;タルウシ血清 | Gibco | 10270-106 | 細胞培養 1/10e |
| 0,05 % トリプシン-EDTA (1X) | Gibco | 25300-054 | 細胞培養 |
| PBS 10x | フィッシャー 科学 | 11540486 | 細胞培養 |
| カバースリップ 18 mm n°1,5H | マリエンフィールド/ドミニク・ダッチャー | 900556 | カバースリップ |
| パラホルムアルデヒド(PFA)溶液 | シグマ | F8775 | 細胞固定 |
| グルタルアルデヒド | シグマ | G5882 | 細胞固定 |
| トリトン X100 | シグマ | T9284 | 非イオン性界面活性剤。細胞固定に使用 |
| 水素化ホウ素ナトリウム(NaBH4) | グマ | 452904-25ML | 細胞固定 |
| BSA | シグマ | A7906 | サンプル不動態化 PBS中の3% |
| モノクローナル 抗ビメンチン(V9)マウスで産生 | シグマ | V6630 | 一次抗体 |
| 抗アルファチューブリン | バイオラッド | MCA77G | 一次抗体 |
| ヤギ抗ラットIgG(H + L)二次抗体、Alexa Fluor 555 | ッシャー科学 | 10635923 | 二次抗体 |
| ロバ抗マウスIgG(H + L)二次抗体、Alexa Fluor 647 | ッシャー科学 | 10226162 | 二次抗体 |
| テトラスペックマイクロスフィア、0.1 & micro;m、蛍光ブルー/グリーン/オレンジ/ダークレッド | フィッシャーサイエンティフィック | T7279 | 蛍光ビーズ |
| チャムライド 磁気チャンバー | ライブセル機器 | CM-B18-1 | 磁気サンプルホルダー、最大容量 1,2 mL |
| システアミン (MEA) | シグマ | 30070 | 点滅バッファー用 |
| アスペルギルス・ニジェールからのグルコースオキシダーゼ | シグマ | G0543 | バッファー用 |
| まばたき緩衝液 | グルコース | シグマ | |
| 緩衝液 | シグマ | C9322 | |
| トリス(trizma) | 緩衝液のための | シグマ | T1503 |
| ウォッシュNドライカバースリップラック | シグマ | Z688568 | |
| パラフィルム | シグマ | P7793-1EA | パラフィンフィルム |
| 超音波洗浄機 | フィッシャーサイエンティフィック | 15-335-6 | |
| プラズマクリーナー | ハリックプラズマ | PDC-32G-2 |
参考文献
- Herrmann, H., Aebi, U. Intermediate Filaments: Structure and Assembly. Cold Spring Harb Perspect Biol. 8 (11), (2016).
- Huber, F., Boire, A., Lopez, M. P., Koenderink, G. H. Cytoskeletal crosstalk: when three different personalities team up. Curr Opin Cell Biol. <....
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再版と許可
