中間径フィラメントと微小管 2次元直接確率光再構成顕微鏡イメージング

サマリー

この方法論の全体的な目標は、固定細胞における微小管、中間径フィラメントの 2D デュアル カラー dSTORM イメージを実行するために、画像の獲得および復興にサンプル準備から最適な実験条件を与えるには

要約

アクチン フィラメント、微小管、中間径フィラメント (場合) から成る骨格はセルの形状、極性・細胞運動の制御に重要な役割を果たしています。微小管とアクチン ネットワークの組織が広く研究されていますが、IFs のまだ完全に特徴付けられない。IFs は、細胞の細胞質に広がるネットワーク 10 nm とフォームの平均直径を有する。アクチンと微小管分子モーター、細胞骨格のリンカーを物理的に関連付けられています。このタイトな関連付けは、ほとんどの細胞機能に必要な 3 つの細胞骨格ネットワークの連携制御機構を確保する規制メカニズムの核心です。したがって、If だけで、また一緒にそれぞれの他の骨格のネットワークを可視化することが重要です。ただし、場合ネットワークはほとんどの細胞の種類、グリア細胞の特に中に非常に密な解像度に標準の蛍光顕微鏡と達成するために非常に困難なる (~ 250 の解像度を横 nm)。直接確率光再建顕微鏡 (dSTORM) はゲイン 1 桁の水平解像度で可能にする技法です。ここでは、横 dSTORM 解像度ある場合ネットワークの特に、もし束周囲の微小管の密な組織を解決するための十分なことを示します。このような緊密な関連が説明する、これら 2 つのネットワークの連携制御機構に参加する可能性がどのようにビメンチン IFs テンプレートと微小管の組織を安定させると同様、微小管依存の小胞輸送に影響を与える可能性があります。もっと一般に、デュアル カラー dSTORM 技術 2 つの細胞骨格成分の観測が彼らの相互作用に新しい洞察力をもたらす方法を示す.

概要

細胞の中間径フィラメント (IFs) は、直径 10 nm のヒト - または場合蛋白質の特定のサブセットを携帯型の heteropolymers です。IFs は、細胞運動、増殖やストレス応答など細胞機能の広い範囲に参加します。その重要な役割が 90 以上の人間の病気直接場合蛋白質で突然変異によって引き起こされるという事実によって強調表示されます。例えば、腫瘍の増殖および^1,2,3を広める場合組成の変化を伴います。細胞の極性形成、部門と移行^2,3などの細胞機能を制御する共同で 3 つの骨格システムが働くという証拠が高まっています。建築の空間と機能の間の密結合なので、他のフィラメントの場合の構造への洞察力を得るし、細胞骨格のクロストークを理解することが重要です。この記事は、超解像技術のデュアル カラー dSTORM (直接確率再建顕微鏡)⁴との間の相互作用を調査する使用方法と微小管を実行するプロトコルを提供しますで固定、培養2 次元 (2 D) 内のセル。

いくつかの超解像技術は、過去に開発されている年とそこ発見 2014年⁵ノーベル化学賞の原点であった。これらすべての方法の間であるパーム⁶ (Photo-Activated ローカリゼーション顕微鏡) スイッチング蛍光タンパク質を使用して嵐⁷ fluorophores が付いてまたは dSTORM^{4 のペアのような単一分子局在に基づく方法}従来 fluorophores が付いています。ローカライズするためにこれらすべてのメソッドは、「オフ」状態に (i) 蛍光レポーターのほとんどのスイッチから成っている同じ原理に基づいています」(非蛍光灯)、(ii) それらのサブセットを蛍光の確率論的活性化状態のナノメートル精度、および (iii) できるだけ fluorophores の多くのサブセットをアクティブにするためにこのプロセスの繰り返しと空間的な位置。最終的なイメージは、20 ~ 40 までの横方向の分解能を提供する活性化分子のすべてのローカライズを使用して再構築されます nm。パーム/嵐をできるようにいくつか商品化された光学系のルーチンの実験のための生物学者に今あります。ここでは、1 つのようなシステムは微小管と IFs の結合構造を研究に使用されました。非常に薄い層状の領域を観察する最適ですのですべて単一分子局在ベースのメソッドの間でデュアル カラー dSTORM 手法が選ばれた (< 1 μ m) 付着性のセルの画像解像度の大幅な改善を提供することができます、最小限の時間とお金の投資。確かに、dSTORM は、細胞染色と蛍光抗体法により定期的に使用される標準的な有機色素と互換性がある非常に便利な汎用性の高いテクニックです。

限られている場合は特に、選択バッファーに正しく 2 つの染料が点滅する場合もあるので、実験の条件を最適化する必要がありますデュアル カラー dSTORM 1色 dSTORM 画像は Alexa647⁸蛍光体を使用して取得する比較的簡単なレーザー パワー。優秀な論文は dSTORM^{9,10、11,12,13}, マルチカラー イメージングをセットアップする方法に使用されておりこれらの書類は、詳細に説明の可能なソース成果物と劣化画像の解像度だけでなく、それらを克服する方法。この記事は、細胞の固定、染色、サンプル準備の面で最適な実験条件、画像取得と画像再構成が密な細胞質場合ネットワークと微小管の画像を得るために説明デュアル カラー dSTORM とグリア細胞。簡単に言えば、Chazeau ら¹²の抽出/固定方法がグリア細胞に適応されポスト固定ステップ、最適化された抗体濃度で使用、10 ミリメートルと嵐バッファー MEA の記載したデンプシー⁹ら実験のセットアップとサンプル タイプに最適なことが判明します。

グリア細胞は主に 3 種類の場合はタンパク質を表現: ビメンチン、ネスチンと GFAP (グリア細胞の酸性タンパク質の線維性)。これらの 3 つのタンパク質は、アストロ サイト¹⁴共重合に示されていた。我々 は以前超解像の構造化照明顕微鏡 (SR SIM) 同じ単一の場合フィラメントのこれらの 3 つの場合の蛋白質を見つけることができます、グリア細胞¹⁵と同様の分布と動態表示ことを示した。3 の場合蛋白質の間の類似点のため全体の場合ネットワークの腔は使用レポーターとして。DSTORM を使用すると、回折では不可能でしたが微小管に沿って場合フォーム バンドルが顕微鏡技術¹⁵に限られた解決することができた。これらの観察は、ビメンチン IFs にテンプレート微小管ことができる方法を理解し、彼らの成長の軌道の細胞移行¹⁶中極性軸の整備を推進を規制できます。超解像画像 2 つの細胞骨格サブシステムの相互作用に重要な情報を提供し、空間協会とセル型特定¹⁷となるローカル関数間のリンクへの洞察力をもたらした。一般に、密度と特異性の面で条件が良い染色に達した、デュアル カラー dSTORM を骨格要素やその他の細胞小器官間のクロストークを勉強する使用できます。この手法は膠芽腫と星の中に、細胞骨格の変化を特徴付けるより役に立つでしょう、最も一般的なと最も悪性の腫瘍の場合蛋白質の表現が、中枢神経系の変更^{18 、19,20,21}。

プロトコル

1. Coverslips 準備 (日 1、30 分)

1. プラスチック ラックに 18 mm nº1.5H (5 μ m ± 170 μ m) のガラス coverslips を配置します。
2. アセトン、5 分間浸漬が入った 100 mL ビーカーにラックを置きます。
3. 無水エタノール、5 分間浸漬が入った 100 mL ビーカー ラックに転送します。
4. 無水エタノールが入った新しい 100 mL ビーカーにラックを転送し、超音波クリーナー装置にビーカーを置きます (材料の表参照) 室温で。"On"を押すし、10 分間待ちます。
5. 層流フードの下でラックを入れ、乾燥または乾燥フィルターの空気の流れと coverslips coverslips を聞かせてください。
6. プラズマ クリーナー装置で coverslips にラックを置きます。真空ポンプのスイッチ、ドアを閉め、真空洗浄直後後 1 分使用、coverslips プラズマにスイッチし 3 分待ちます。それらを保存しません。

2. セルめっき (日 1、20 分)

1. 10 cm 直径プラスチック シャーレにグリア細胞ライン U373 最小必須培地 (MEM) で 10% 牛胎児血清、1% ペニシリン-ストレプトマイシンおよび 1% 非本質的なアミノ酸を成長します。
2. 層流フードの下で 12 ウェル プレートできれいなガラス coverslips を置き、ウェルあたり予熱した細胞用培地 1 mL を追加します。
3. セル インキュベーター (37 ° C、5% CO₂) からの細胞を含んでいる皿を取る。
4. メディアを削除し、10 mL の PBS を追加します。
5. PBS を削除し、追加の 1 mL 0.05% トリプシン-EDTA。
6. 2-3 分のためのインキュベーターに戻って料理を配置します。
7. 皿の上の 37 ° C で予熱した温かい媒体の 10 mL を追加し、細胞を再懸濁します。
8. Coverslips を含む 12 ウェル プレートのウェル (細胞の 〜 150 μ L) あたりの種子約 100 000 細胞。
9. 少なくとも 6 時間 (または一晩) 細胞の拡散を許可するを待ちます。

3. セル固定 (日 2、2 h)

1. 7 mM の MgCl₂、1 mM グリコールエーテルジアミン四酢酸、150 mM の NaCl、80 mM パイプで骨格バッファーを準備し、6.9 に pH を調整します。
2. PBS で 1 回洗浄を行う。
3. PBS を削除し、ゆっくり抽出/固定の解決の井戸あたり 1 mL を追加 (0.3%、0.25% グルタルアルデヒド骨格バッファーでトリトン X-100) 37 ° C で予熱
4. 60 間インキュベート ルーム温 s。
5. ソリューションを削除し、優しく骨格バッファーで希釈した予熱と作りたての 4 %pfa (パラホルムアルデヒド) ソリューションの井戸あたり 1 mL を追加します。
   注意:手袋を使用し、化学のフードの下で動作します。
6. 37 ° C で 10 分間のインキュベーターに戻って 12 ウェル プレートを配置します。
7. PFA を削除し、ウェルあたり 3 mL の PBS を追加します。
   注:手袋と化学のフードの下で動作し、特定のビンのリサイクル PFA を置きます。
8. PBS で 2 回洗浄します。
9. PBS を削除し、グルタルアルデヒドから蛍光をクエンチするために、PBS で希釈した作りたて 10 ミリメートル NaBH₄のソリューションを追加します。
10. 部屋の温度で 7 分間インキュベートします。
11. 特定のビンのリサイクル NaBH₄を置きます。
12. PBS で洗浄 3 回 5 分。
13. PBS を削除し、ブロッキング液 (PBS で 5 %bsa 溶液) を追加します。
14. 部屋の温度 (または一晩で 4 ° C) に 1 時間孵化させなさい。
    注:骨格バッファーは、数ヶ月の常温保存できます。グルタルアルデヒド NaBH₄ PFA は、特別な注意 (フード、手袋、および特定のリサイクル ビン) と処理必要があります。ソリューションの追加や優しく細胞の整合性を維持するために削除する必要があります。細胞の乾燥をさせないことが重要です。

4. 免疫染色 (日 2, 5 h)

1. 抗ビメンチンと抗チューブリンのブロッキング溶液 1: 500 希釈使用一次抗体の溶液を準備します。
2. パラフィン膜層に希釈した一次抗体 100 μ L 滴を置いて、下向きセルとそれらの上に coverslips に配置。
3. PBS で 12 ウェル プレートに戻って coverslips いっぱい入れて 2 における一次抗体と細胞を孵化させなさい。軌道シェーカーで室温で PBS のたびに 5 分間 3 回リンスします。
4. 一方で、抗マウス Alexa647 と抗ラット Alexa555 を使用してブロッキング液で 1:1, 000 の希釈で二次抗体溶液を調製します。室温で 1 h の二次抗体と細胞を孵化させなさい。4.2 のように進んでください。光から細胞を保護します。
5. PBS でいっぱい 12 ウェル プレートに、coverslip を置きます。軌道シェーカーで室温で PBS のたびに 5 分間 3 回リンスします。PBS を削除し、0.5 mL の PBS 0.1 μ m tetraspeck ビーズの 1 μ L で混合を追加します。
6. 30 分 PBS で洗浄軌道シェーカーに井戸を置きます。PBS を外し、PBS の 4 %pfa ソリューションと 5 分のセルを孵化させなさい。PBS に 3 回すすぐ。
   注:PBS で 4 ° C で数週間のカップルのため固定セルを格納できます。最後の最後で、免疫染色を行う必要があります。

5. 試料 (日 3、5 分)

1. アイス バスケットに MEA (システアミン、1 M、pH 8.3)、グルコースオキシダーゼ (100 x, 50 mg/mL)、カタラーゼ (500 x、20 mg/mL) の因数を置きます。
2. 50 mL のトリス NaCl バッファーを準備 (50 mM トリス、10 mM の NaCl、pH = 8) ブドウ糖 (100 mg/mL) の 10% を添加しました。
3. 10% ブドウ糖でトリス NaCl バッファーのちょうど 10 mM MEA、0.5 mg/mL (75 U/mL) グルコース酸化酵素は、40 μ g/mL カタラーゼ (80-200 U/mL) のイメージングの前にバッファーをイメージングの 1.2 mL を準備します。
4. 磁気サンプル ホルダー (例えば chamlide 商工会議所) にラベル付きセルを含む coverslip をマウントし、チャンバーを完全に画像バッファーを追加します。ふたし、イメージングのバッファーと蓋の間に気泡がないことを確認してください。
5. 無水エタノールとサンプルの下をきれいにし漏れがないことを確認します。グリースを使用して、必要に応じて正しくサンプル ホルダーをシールします。
   注:MEA ソリューション (pH 8.3 HCl を使用して調整)、ブドウ糖酸化酵素 50 mg/ml の在庫および 20 mg/mL の水の中にカタラーゼの在庫の 1 M 在庫を準備し、因数 MEA とグルコース酸化酵素やカタラーゼの年まで 1 ヶ月-20 ° C で保存します。因数は再冷凍しないでください。トリス NaCl バッファーを事前に準備、それを数ヶ月常温で保存します。実験 (ステップ 5.3) の日に血糖値を追加します。

6. 画像の取得 (日 3、セルごとの ~ 1 h)

1. 顕微鏡を切り替えます。集録ソフトウェアに切り替えるし、システムを起動を押します。
2. セットアップ マネージャー ツール グループで買収タブ展開イメージ投射セットアップツールを選択します。買収のレーザー WF (広視野) モードを選択します。100 X ナ 1.46目的を選択します。照らされている視野を減らすためのコリメーターを使用して全反射 u HPモードを選択し、小さな領域にレーザー エネルギーを集中します。Optovarレンズ 1.6 倍100 nm のピクセル サイズを使用します。
3. 時系列ツールを選択し、50 000 のフレームとフレーム間 0.0 ms の時間経過を設定します。集録パラメーター ツール グループチャンネルツールを展開し、「すべて表示」を選択します。
4. Alexa647 トラックを設定: チェック、642 と 405 レーザー励起用ラインとオンに受け入れます。イメージング セットアップで"655 LP"排出フィルターを選択します。「647」の名前を変更します。
5. '+'チャンネルツールで別の光パスを追加し、モードを選択するにはクリックして"スイッチ トラックごと: フレーム」イメージ投射セットアップツールで。561, 488 と 405 レーザー ラインを確認し、オンに受け入れます。選択、"BP 570-650 + LP750"排出フィルターし、optovar レンズ 1.6 を使用して x。全反射 uHP モードが選択されていることを確認します。トラック「555」の名前を変更します。
6. アクイジション ・ モードツールを選択し、フレーム サイズを 200 × 200 ピクセルに設定します。フォーカス デバイスと戦略ツールを選択し、(フォーカス ロック システムが存在する場合) 1 000 フレームに明確なフォーカスを設定します。
7. 目的のオイルを入れてサンプルを置きます。[検索] タブを選択し、蛍光ランプのシャッターを開きます。フォーカスを検索し、画像の接眼レンズを使用するセルを探します。ジョイスティックを使用してビューのフィールドの中央にそれを置きます。
8. アクイジション ・ モードに戻って取得] タブを選択します。「647」トラックを選択して、642 レーザパワーを 0.2% に設定、405 レーザー パワーを 0 に設定、露出時間を 50 ms と 50 の利得に設定。画面上のセルを観察する連続集録モードを選択します。フォーカスを調整します。ビューのフィールドの少なくとも 1 つの tetraspeck ビーズがあることを確認、必要に応じてそれらを参照するコントラストを増加します。ディスプレイの自動サイズ調整モードを使用します。スナップをクリックしてビメンチン ネットワークの広視野落射蛍光画像を取るし、それを保存します。全反射照明をチェックするには、全反射をつけ、照明の均一なフィールドとそれを保存する必要がある場合、照明やコリメータの角度を調整します。
   注: それは全反射と epifluorescent の画像が高品質の raw データ集録を開始する前にいることが重要です。不連続、非一様にラベル付きのフィラメントは質の悪い dSTORM 画像に上昇を与えます。
9. 「647」トラックをオフに選択し、「555」トラックを確認します。微小管ネットワークの落射蛍光画像を撮影し、それを保存します。全反射画像を取るし、あまりにもそれを保存します。
10. 「555」トラック オフに、[、"647"トラックをチェックし、、連続を押します。ゲインを 0 に置くし、10 さんに露出時間を濃い状態 (~ 2 kW/cm²) Alexa647 染料のほとんどをポンプするために 642 nm レーザー パワーを 100% に設定します。一度、fluorophores が付いて 15 ms への暴露を入れて点滅を開始し、300 を得る。照明の全反射モードを選択します。自動スケールなし範囲インジケーターモードを使用して、単一分子信号が (赤い色で示される) カメラを飽和させないことを確認します。その場合は、彩度が消えるまでゲインを減少します。Tetraspeck ビーズ獲得の初めに飽和状態のままです。セルの連続観測を停止する停止を押します。
11. オンライン処理ツールを展開し、集録時に嵐の画像を視覚化するオンライン パームの処理をチェックします。次のパラメーターを使用する: ピーク マスク サイズ (9 ピクセルの直径)、および騒音ピーク強度の 6 の 9。論文パラメーターは (十分に明るくと重複する) 処理で考慮されて分子を定義します。PAL-統計情報ツールでのプロット タイプを選択:ヒストグラム、およびヒストグラム ソース:精度。集録を開始を押してください。
12. 集録中に再び (フォーカス ロック デバイスがない) 場合に必要に応じて焦点を当てます。(露出、レーザー) のパラメーターを調整し、最終的に (0.001% から開始) 1 μ m 単一分子間の最小距離と fluorophores の中密度を保つために 405 nm レーザー ラインのスイッチ (> 9 ピクセルの 100 nm、マスクのピーク サイズ) (図 1 aB)。分子密度は少し高すぎる、全反射ではなく照明のヒロ (高傾斜・積層光学シート) モードを使用します。これは 20% 増のレーザー出力。ローカリゼーション精度再構成画像の下のヒストグラムのピークが周りや 10 の下に中央揃えされていることを確認 nm。
    注:通常の分子の数は時間とともに減少、405 nm レーザーのパワーは必要に応じてゆっくりと増量します。目的は 10 以下のピークと可能な限り定位精度 (ヒストグラム超解像画像の下に表示) を減少させる、nm (図 1)。椰子の画像も多く明るいビーズがフィールドに存在する場合、必要に応じてコントラストを上げます。
13. (通常後 40 000 フレーム) 局在化⁶以上 10 に達したときに、ムービーを停止する停止を押します。0.2% にレーザーを置く (642 nm) と 0 (405 nm)。.Czi 形式で嵐の買収の生データを保存します。チャンネル ツールでトラック「647」をオフに選択し、トラック「555」をチェックします。
14. 露出時間を 25 ミリ秒に設定し、0 に得る。連続ボタンを押すし、暗い状態 (~ 2 kW/cm² ) ポンプ Alexa555 染料 100% の 488 561 のレーザーを設定します。始めれば、fluorophores が付いて点滅、250 にゲインを置くヒロ照明モードを使用し、単一分子が範囲インジケーター モードでカメラを飽和させないことを確認します。場合場合は、利得が低下します。停止を押します。488 レーザー出力の 50% を減少させます。
15. 集録を開始を押してください。集録中に徐々 に飽和度の限界に常にゲインを上げます。視野 (を参照してくださいステップ 6.18) で単一分子の中の密度を保つために 405 nm レーザー力を高める一歩一歩。405 レーザが 15% より高い 488 レーザー出力の 20-30% を減少します。徐々 に減少し、488 分子の点滅は、可能な限り高速を保つために 405 のレーザー ラインを増加させながら。最大強度で 561 励起レーザーと相まって 488 レーザー ラインは 405 レーザー ラインのみでの率の増加に対し両方オンとオフ、fluorophores の率を増加します。
16. これ以上の分子は、点滅しているときは、(後で約 20000 フレーム) 以上 500 000 のローカライズに達しているときの買収以上を停止します。.Czi 形式で嵐の買収の生データを保存します。
    注:常に他の色の漂白 (または活性化) を避けるためにより高い波長で始まります。定期的に、例えば画像バッファーを変更することが可能です chamlide チャンバーがシールされていないので別のバッファー条件をテストします。561 レーザー パワーが (100 mW のレーザー) と限られている場合にのみ、Alexa 555 染料を使い果たす 488 レーザー ラインを使用してな。

7. 画像再構成 (5 分)

1. PAL ドリフトツール 8 の最大サイズ自動セグメントモデルに基づく補正タイプを使用します。行で、ドリフトを修正するまで複数回を適用に押します。このモデルに基づく補正は、ドリフトを修正する相互相関解析に基づくアルゴリズムを適用します。
2. PAL フィルターツールを使用して、ローカライズされた最高分子のみを選択することによって嵐画像の外観を改善します。たとえば、30 に定位精度に制限 nm と 120 180 nm に PSF。
3. 1 PSF. のレンダリングを選択自動ダイナミック レンジ HR 値が 95% と 90% 値とレンダリング自動ダイナミック レンジ SWF の拡大要因とガウス表示モードと同様、 PAL レンダリングツールで 5 または 10 nm のピクセルの解像度を使用します。最高品質のレンダリングを選択します。
4. (後処理モード) の [処理] タブのメニューのパームでパームに変換を選択します。選択し、適用を押します。形式で作成された画像を保存します。LSM (およびない .czi、非常に重要です)。
   注:取得または取得ソフトウェアの画像処理モードを使用して後の直後に画像再構成を実行できます。オフライン モードが後処理、パラメーター (マスクのピーク サイズ、騒音ピーク強度) の異なる値を持つスタックを再分析することが可能です。常に「重複する分子を破棄」してない「ローカライズ前に平均する」を選択します。

8. 嵐画像 (10 分) のローカリゼーションの精度の推定

1. あなたの嵐の生データを開き、処理タブパーム方法の選択と、パームを再度イメージを使用します。選択を押します。
2. 9 と 6 (またはイメージ用に選択したパラメーター) の騒音ピーク強度のピークのマスクのサイズを使用して再建開始に適用を押します。
3. 四角形グラフィック ツールを選択し、ガラス表面に単分子の周り raw 画像に四角形を描画します。いくつかの単一の分子が通常あります。
4. プレス適用再度、および四角形の領域の内部に存在分子のみを分析します。
5. PAL-統計情報ツールでのプロット タイプを選択: ヒストグラム、およびヒストグラム ソース: X 位置、Y 位置、位置ヒストグラムを視覚化します。
6. 下の画像左上のローカライズの一覧でテーブルを保存します。
7. X のヒストグラムを作成する、データ解析のソフトウェアを使用しておよび Y 位置 (図 1)。
8. ガウス関数による分布に合い、σ_X σ_Yの値を保存します。定位精度 σ_SMLMを用いて (σ_{X *}σ_Y) ^0.5。
9. 可能な限りとして多くの分子で 8.3 8.8 手順を繰り返し、平均 σ_SMLM

9. チャンネル登録 (5 分)

1. フィジー (画像 J) ソフトウェアを使用して各色の嵐画像を開きます。
2. Tetraspeck ビーズの位置を測定するための杖ツールを選択します。
3. それぞれのビーズの X と Y のシフトを計算し、それらの平均します。
4. 計算と 2 番目の画像に変換する「変換」コマンドを使用して X と Y のシフト。
5. チャンネルを統合コマンドを使用して 2 つの画像をマージします。

結果

アルファ Plan Apo 100 X 512 x 512 カメラ 50 mW 405 nm と 100 mW 488、561、642 nm 固体レーザ、EMCCD 搭載顕微鏡/570 650 を渡す/655 放出フィルターがロングパス 1.46 の目標とバンド以下に示す代表的な結果を得るのために使用されました。

図 1 aは、対雑音比 raw 画像取得時に使用する分子密度と信号の例を与えます。良い品質の画像は、隣接分子間 〜 1 μ m の最小値が得られます。良い点滅状態で fluorophores が付いてはのみ 1 つのフレーム内に存在する必要があります。画像バッファー条件 (pH、還元剤、酸素システムを消去) を調整する必要があります良い点滅とレーザーに- とオフ-料金の蛍光物質したがって、義務に影響を及ぼすサイクル (、fluorophore に費やしている時間の割合オン状態)

ディスカッション

プロトコルの重要なステップ

微小管の dSTORM 画像内のアーティファクトとグリア細胞における IFs を最小にするプロトコルをご紹介します。サンプル準備およびイメージ投射の各ステップでの成果物を作成できます: 固定、ブロック、反応、ドリフトの買収により、非最適な点滅条件²³。我々 は、最も重要な手順以下リストします。

表面に蛍光物質の非特異的結合を制限する重要なステップは、クリーニング、coverslips したがって dSTORM 画像の背景ノイズを制限します。

PFA (パラホルムアルデヒド) (ステップ n ° 3) とグルタールアルデヒドとトリトン、および固定のミックスを使用して抽出し、固定のソリューションの手順とサンプルを修正お勧めします。固定のプロトコルは、Chazeau et al¹²から適応された: 我々 は 60 に抽出/...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
最小必須培地(MEM)	Gibco	41090-028	細胞培養
非必須アミノ酸	Gibco	1140-050	細胞培養 1/100e
ペニシリン-ストレプトマイシン	Gibco	15140-122	細胞培養 1/100e
F&oE;タルウシ血清	Gibco	10270-106	細胞培養 1/10e
0,05 % トリプシン-EDTA (1X)	Gibco	25300-054	細胞培養
PBS 10x	フィッシャー 科学	11540486	細胞培養
カバースリップ 18 mm n°1,5H	マリエンフィールド/ドミニク・ダッチャー	900556	カバースリップ
パラホルムアルデヒド(PFA)溶液	シグマ	F8775	細胞固定
グルタルアルデヒド	シグマ	G5882	細胞固定
トリトン X100	シグマ	T9284	非イオン性界面活性剤。細胞固定に使用
水素化ホウ素ナトリウム(NaBH4)	グマ	452904-25ML	細胞固定
BSA	シグマ	A7906	サンプル不動態化 PBS中の3%
モノクローナル 抗ビメンチン(V9)マウスで産生	シグマ	V6630	一次抗体
抗アルファチューブリン	バイオラッド	MCA77G	一次抗体
ヤギ抗ラットIgG(H + L)二次抗体、Alexa Fluor 555	ッシャー科学	10635923	二次抗体
ロバ抗マウスIgG(H + L)二次抗体、Alexa Fluor 647	ッシャー科学	10226162	二次抗体
テトラスペックマイクロスフィア、0.1 & micro;m、蛍光ブルー/グリーン/オレンジ/ダークレッド	フィッシャーサイエンティフィック	T7279	蛍光ビーズ
チャムライド 磁気チャンバー	ライブセル機器	CM-B18-1	磁気サンプルホルダー、最大容量 1,2 mL
システアミン (MEA)	シグマ	30070	点滅バッファー用
アスペルギルス・ニジェールからのグルコースオキシダーゼ	シグマ	G0543	バッファー用
まばたき緩衝液	グルコース	シグマ
緩衝液		シグマ	C9322
トリス(trizma)	緩衝液のための	シグマ	T1503
ウォッシュNドライカバースリップラック	シグマ	Z688568
パラフィルム	シグマ	P7793-1EA	パラフィンフィルム
超音波洗浄機	フィッシャーサイエンティフィック	15-335-6
プラズマクリーナー	ハリックプラズマ	PDC-32G-2