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方法論記事

初期と後期-段鳥モデルにおける器官形成を探索する 2 段階のアプローチ: 胸腺、副甲状腺腺器官パラダイム

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DOI:

10.3791/57114

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2018年6月17日

 , 
1Instituto de Histologia e Biologia do Desenvolvimento, Faculdade de Medicina, Universidade de Lisboa

この記事について

サマリー

この資料では、新規生体外でそしてovo実験手順を組み合わせることによって器官の形成を研究する古典的なウズラ鶏キメラ システムへの更新されたアプローチを提供します。

要約

鳥類胚実験モデルとしてされている精液の発見の最も重要な発生生物学。いくつかのアプローチ、ウズラ鶏キメラ形成および漿膜 (CAM) の最後の世紀に戻る日を異所性組織の開発を維持するために使用です。今日では、最近の in vitro方法論とこれらの古典的な手法の組み合わせはさらに器官形成を探索する新しい見通しを提供しています。

ここ初期- と - の後期段階の器官形成を研究する 2 段階のアプローチを記述します。簡単に言えば、臓器の推定領域を含む萌芽期の地域は (48 h) 最大の器官システムでウズラ胚および成長の in vitroから分離されます。培養組織にその後鶏胚のカムに接木されます。Ovo の開発の 10 日後、完全に形成された臓器は移植組織から取得されます。このメソッドでは、薬理学的エージェントの通常の管理と生体外でそしてovo発達ステップ全体にわたって組織遺伝子操作によるシグナル伝達経路の調節もできます。さらに、組織の開発は遺伝子発現プロファイル (量的な PCR (qPCR)、マイクロ アレイ等を用いた)、形態 (従来の組織像と免疫評価) を分析する任意の期間で収集できます。

外に完全に形成された器官形成の初期段階と機能の器官からの鳥の胎児の器官形成に従うツールとして記述されていた実験プロシージャを使用できます。

概要

鳥類胚は、種子発達生物学で広く使用されています。鳥のモデルの主な利点は、卵、胚、マイクロマニピュレーションを実行する能力に比較的簡単にアクセスを開く可能性を含まれます。いくつかの例は細胞運命1カム1,3、異所性の細胞構造の成長と胚2、特定の成長因子の応用を勉強するためクラシック ウズラ鶏キメラ システムを構成します。 4。

器官形成の段階に新たな洞察を得る、萌芽期ティッシュ5体外操作と接木技術を組み合わせた方法最近開発しました。2 段階のアプローチにより、差別と探査の両方 - と後期 - の初期段階器官形成、非常にダイナミックで複雑な組織の相互作用2のために制限されます。さらに、適切な組織特異的マーカーの欠乏頻繁の使用を制限遺伝子組み換え動物モデル6。この 2 段階のアプローチ法は主としてこのような制限を克服します。

最初のステップで、器官形成の初期段階を研究するには、将来の臓器の原基を構成するウズラ胚領域は分離、48 時間培養切片システムで栽培します。この期間中に特定のシグナル伝達経路の薬理学的変調は培養培地5,7に薬を追加することによって実行できます。さらに、培養組織が体外で成長のあらゆる段階で収集され遺伝子発現プローブ ( qPCR、マイクロ アレイなどのメソッドを使用して)。

2 番目の手順では、48 h 培養組織が、接ぎ木 (cE8) (E) 8 日 (c) 鶏胚のカム (ハンバーガーとハミルトン (HH)-33-35 の段階)8。カムは栄養素の血管サプライヤーとして動作し、ガス交換1,3,4移植組織を有効にその開発ovo で時間の長い期間のためにことができます。この実験の手順は特に適しています器官形成の後期段階を研究するovo で開発5,9,10,11 の 10 日後、完全に形成された器官を得ることができるよう.形態素解析は簡単に適切な器官形成を確認する従来の組織によって実行され、(すなわち、MAb ウズラ核 (QCPN)) 特異的抗体を用いた免疫組織化学によってドナー細胞の起源を識別できます。カムの潜伏期間中に、移植できる薬理学的エージェントの存在下で成長してがも、器官形成の進行を評価するための開発のあらゆる段階で収集します。

深さで、ここで説明されている 2 段階のアプローチは、フィゲイレドらですでに採用されています。5鳥副甲状腺/胸腺共通原基開発を探検します。したがって、以下、萌芽期の地域の固有の特性と、胸腺・副甲状腺腺の器官形成に関与する開発の段階の設定が表示されます。

胸腺と副甲状腺腺上皮、咽頭の袋の内胚葉からも機能的に異なるを派生すると (PP)12。鳥、これらの器官の上皮に属します、3 番目と 4 番目 PP 内胚葉 (3/4 pp)12、哺乳類で、3PP から派生する胸腺の上皮と副甲状腺腺上皮に由来する 3PP と 3/4 pp マウスと人間、それぞれ13,14。

これらの器官の形成の初期の段階の一つは、離散胸腺・副甲状腺ドメイン共通の原基での登場です。鶏、E4.515、特定の分子マーカーの in situハイブリダイゼーションによるこれらのドメインを識別できます。開発が進むにつれて、これらの器官の基礎が個性し、神経堤由来細胞によって形成される薄い葉カプセル (E5; でそれらを囲む中咽頭から分離HH-stage 27)。後に、胸腺の上皮は造血前駆細胞 (E6.5; で植民地化します。HH-stage 30)12。

古典的なウズラ鶏研究1,12のように 2 段階のアプローチ、すなわち胸腺5リンパ ・造血器官の形成を研究に便利です。移植し、器官原基で、ウズラが外植体として鶏血液媒介性前駆細胞浸潤ウズラ胸腺上皮相手造血前駆細胞の植民地化前に鶏胚におけるキメラ胸腺が形成されて。このメソッドは、したがって、鳥の血液・ リンパ系の開発で造血細胞の貢献を探索する便利なツールです。

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プロトコル

これらすべての実験動物の世話やセントロ Académico ・ デ ・ メディチーナ ・ デ ・倫理的なガイドラインに従うリスボア。

1. 受精ウズラと鶏の卵の孵化

  1. それぞれ、3 と 8 日間ウズラ (について) と鶏 (ギャラス) 受精卵をインキュベートしてください。
    1. 空気室 (卵の鈍い端) 38 ° C で加湿のインキュベーターで上向きに卵を配置します。
    2. この実験を実行するのに約 20 のウズラの卵と 40 の鶏の卵を使用します。
      注: 初めてこの手順を確立するとき、これらの番号を倍増する必要があります。

2. 胸腺、副甲状腺の基礎の推定領域を含むウズラ胚領域の分離

メモ: 実行卵水平層流フードと滅菌器具と材料を使用して無菌状態で操作手順。

  1. について大規模なホウケイ酸ガラスのボウルを準備 3/4 冷たいリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 液でいっぱい。
  2. シェルをタップ、曲線はさみでその鈍い端の反対側に円形の開口部を切断して 3 日間の培養後ウズラ卵を開きます。慎重に殻の部分を削除し、胚を冷 PBS で満たされたガラス ボウルに転送します。
  3. E3 でウズラ (q) 胚を保持 (qE3) (鶏の HH ステージ 21 に対応するウズラ ステージ) 細い鉗子の助けを借りて。曲線はさみを使用して卵黄を包み込む膜の膜へのカットをします。胚体外血管の周囲に外部から前後をカットし続けます。
  4. 転送小さい胚ボウル 3/4 細い鉗子の助けを借りて冷 PBS でいっぱい。接続されている残りの卵黄から胚を徹底的に洗います。
  5. スキマーを使用して 100 ミリメートルのガラス シャーレと黒のベースに胚を転送する (材料の表を参照してください) 10 mL の冷 PBS を含みます。
  6. ペトリ皿を顕微鏡の下に配置します。
    注: このポイントから、進歩的な倍率の顕微鏡下マイクロサージェリー手順を実行します。照明のソースとしては、限られた熱負荷を考慮した、顕微鏡や光ファイバーを組み込んだ LED ライトを使用することをお勧めします。
  7. 薄い昆虫ピンとプレートの底に胚を保持します。胚体外域正方形の形成 4 本のピンを配置します。
  8. 細い鉗子の助けを借りて、頭部領域の胚体外膜を外し、そこに 5 ピンを配置します。
    注: 胚が正しく配置されている場合、耳胞、心臓の管と 1st、2ndと 3rd咽頭アーチ (PAs) が表示されます。
  9. 時空警察ヴェッカーシグナ目はさみを使用しての関心、すなわち、3rd 4thの咽頭アーチ領域 (3/4PAR)、萌芽期の地域を分析します。
    1. 長手方向と平行に体節神経・ チューブ領域と PAs の間の胚軸切断を開始します。
    2. それを切断することによって腹位置中心の管を削除します。同じ位置にはさみを維持する、カットの方向によると胚を再配置するシャーレを回転させます。
    3. 2ndと 3rd PAs の間と 4thペンシルバニアの下カットします。
    4. 細い鉗子の助けを借りて 3/4PAR から残りの膜をデタッチします。
  10. 隔離されたティッシュ (3/4PAR) と冷 PBS 2 mL 滅菌プラスチック ピペットを使用して 3/4 ガラスの皿に満ちて転送を吸い出しなさい。
    注: 以下、組織 h 48 まで育てられた生体外ですることができます。 または E8 でニワトリ胚のカムに接木されるすぐに。
  11. 生体外の試金の準備の間に氷の上分離 3/4PAR を含むガラスの皿を保ちます。

3 切片培養の試金: 胸腺、副甲状腺の基礎の推定領域を含む萌芽期の地域の文化。

  1. 10 %fbs と 1% ペニシリン/ストレプトマイシン RPMI 1640 培で培養液を準備します。
    注: 可溶性の薬理学的試薬は媒体 (たとえば、LY 411.575 (Ly) ・ ディ ・ benzazepine または cyclopamine とビスモデギブ、ノッチとハリネズミ (Hh) シグナル伝達経路、それぞれを阻害する追加できます。この試金のため 3 Notch シグナルを阻害する Ly の 50-200 nM または・ ディ ・ benzazepine の 5-15 μ M を使用して/4PAR. 3/4PAR5Hh シグナルを抑制する cyclopamine の 20 μ M またはビスモデギブの 10 μ M を使用します。
  2. 6 ウェル プレートで 3/4 pp 外植体の in vitro文化を準備します。
    1. 5 ml の培地の 6 ウェル プレートから 1 つの井戸を埋めます。24 ミリメートル ポリカーボネート膜挿入の場所 (材料表参照) 細い鉗子の助けを借りても。
    2. 、実体顕微鏡下で 3/4PAR 外植体ガラス皿からに転送膜表面移植スプーン (またはヘラ) の助けを借りてをスライドさせて、と薄い鉗子。腹側と背側膜外植片を配置します。膜挿入ごとに最大 7 つの植を追加します。3.4 の手順に進みます。
  3. また、文化外植体膜フィルターを浮
    1. 35 mm 5 ml の培地のシャーレを準備します。細い鉗子、フロート膜フィルター (材料の表を参照) と乾燥空気との接触を保つための助けを借りて。
    2. 、実体顕微鏡下で 3/4PAR 植から転送ガラス皿をメンブラン フィルター移植スプーン (またはヘラ) の助けを借りて穏やかなスライドし、薄い鉗子。腹側と背側膜外植片を配置します。メンブレン フィルターあたり最大 8 植を追加します。
  4. 植 3.2 と 3.3 5% CO2と 37 ° C で加湿のインキュベーターでの手順で準備して慎重に置きます。
  5. 48 時間の潜伏期間の後に、インキュベーターから 6 ウェル プレートと 35 mm のペトリ皿を削除します。
    1. 6 ウェル プレートの膜挿入から培養植を収集します。
      1. 常温 (RT) 膜挿入に PBS を追加します。
      2. 2 mL 滅菌プラスチック ピペットを使用して積極的なフラッシュによって膜から植をデタッチします。
      3. ヘラと細い鉗子の助けを借りて、転送した PBS でいっぱい 3/4 ガラスの皿に培養の植
    2. 同様に、35 mm のペトリ皿でフローティングの膜フィルターから培養植を収集します。
      1. 室温 PBS でいっぱい新しい 35 mm のペトリ皿に細い鉗子でメンブラン フィルターを転送します。
      2. 2 mL の滅菌プラスチック ピペットを使用する積極的なピペッティングしてメンブレン フィルターから植をデタッチします。
      3. 細い鉗子の助けを借りて、それを接続外植片が残存していないことを確認した後植無料メンブラン フィルターを放電します。
      4. ヘラと細い鉗子、外植片を室温 PBS でいっぱいガラス皿に転送します。
  6. 総 RNA の隔離のための試薬 1 mL にヘラで培養植を転送し、遺伝子発現の研究で使用します。
    注意:この試薬への暴露は、深刻な健康被害をすることができます (材料の表を参照してください)。適切な保護眼鏡、衣類および手袋を着用します。取扱説明書に従うし、製造元から提供された安全性データシートを読みます。
  7. また、E8 で鶏胚のカムに培養組織を移植します。手順 4 に従ってください。

4. カムの準備

  1. インキュベーターから萌芽期の開発の 8 日間で鶏の卵を削除します。
    注: 卵加湿のインキュベーターで 38 ° C で上向きに直面している空気室で培養。
  2. シェルの部分が空気室に陥るを防ぐために透明なプラスチック テープで卵の鈍端をカバーします。シェルをタップし、曲線はさみで卵円形の開口部をカットします。空気室が表示されます。
  3. 細い鉗子で空気室の白い膜を慎重に削除します。カムは、表示され、異所性組織移植のアクセスです。
    注: は、PBS をスライドさせ、外植片の存在を促進するため、カムを移植、前後に水和物に PBS を使用しないでください。膜が乾く場合は、卵を破棄します。

5. カムに培養外植片の移植

  1. ホルダーに microscalpel カムの小さい船の小血管病変/傷を作成します。
    注: は、余分な出血の場合毛管現象によって血液を削除するのにパスツール ピペットの先端を使用します。
  2. ヘラと細い鉗子を使用して、カムの負傷者の領域に培養外植体を転送します。
  3. 外植体よりわずかに大きいフィルター紙の一部をカットし、外植体の上に置きます。
    注: フィルター ペーパー カムに開発後植場所を追跡ことができます。また、許可外植体への毎日の薬物送達ovo で開発中に必要な場合 (5.6 の手順で説明します)。
  4. 透明なプラスチック テープで卵ウィンドウを密封し、木炭ペンシルを使用してそれを識別します。
    注: プラスチック テープは、潜伏期間中に脱水から胚を保護します。
  5. 38 ° C で加湿のインキュベーターで 10 日間の操作の卵を孵化させなさい手順 6 に従ってください。
  6. オプションのステップ: 毎日潜伏期間薬剤投与。
    1. フィルターにアクセスするため部分的にプラスチック テープを持ち上げて取り外します。一滴ずつ紙の上に薬液の 100 μ L を追加します。ウィンドウを再シールし、38 ° C で加湿のインキュベーターに卵を置き
      注: この試金のため cyclopamine の 20 μ M の用量が抑制 Hh がovo で開発5時伝達します。

6 Ovo の開発の 10 日後、カム異所性器官形成

  1. 培養 10 日後卵をインキュベーターから削除し、慎重にプラスチック テープを撤回します。
  2. 小さなガラスにろ紙をカム派生植ボウル 3/4 冷 PBS でいっぱい曲線はさみと転送を使用して、フィルター領域の周りには、カムをカットします。
  3. 細い鉗子の助けを借りて、10 mL の PBS を含むブラック ベースで 100 mm のペトリ皿にカム由来外植体を転送します。フィルター紙と時空警察ヴェッカーシグナ目はさみや細い鉗子を使用して膜の過剰を慎重に取り外します。
  4. カム外植体を固定液に転送 (3.7 %pbs で PFA) スキマーで。大きなはさみの助けを借りて、胎児の頸部の正確なカットすることによって、卵から削除せず鶏胚を安楽死させます。
  5. 従来の組織および免疫組織化学によってカム派生植のパラフィン切片における器官形成を評価します。

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結果

上記のプロトコルの詳細調査の両方 - と後半-初期頻繁複雑な細胞および分子相互作用によって限られる器官形成を可能にするメソッド。

以前フィゲイレードらの手法は5ノッチと Hh 鳥副甲状腺/胸腺共通原基開発におけるシグナル伝達の役割を解明します。

ここで、図 1と図 2の器官形成の同じモデルを使用して新しい結果が表示されます。図 1 aは、胸腺・副甲状腺形成の初期段階を探るための実験的なデザインを示しています。将来の臓器基礎 (3/4PAR) を構成するウズラ胚領土は切片における分離と栽培

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ディスカッション

このメソッドの成功のための重要な側面は、ニワトリおよびウズラの両方の品質の卵。Ovoアッセイ、鶏の卵の質の良い、特に中に、長い潜伏期間の向上を考慮した生存率はプロシージャの最後で (90% 以下)。これを達成するために、別の業者から卵をテストします。長時間非操作の卵を孵化させなさい (最大 16-17 日) とその開発をチェックします。質の良いバッチを考えられる胚の 80% 以上は、正常な発達を提示しなければなりません。また、各インキュベーション ステップは信頼性を保証する再現性のある同期の発達段階および最後に本当に代表的な結果を提供することが重要です。卵シェル気孔率のためすべてのタマゴ孵化歩数のインキュベーターで加湿雰囲気を維持します。環境汚染を避けるためには、抗生物質は、(オプションの手順) の手順で PBS のソリューションに追加できます。

このメソッドは、ウズラ オルガン初歩を分離し、48 h の器官システムのそれらの成長によって開始します。この最初のステップ、胸腺、副甲状腺の初期開発5を勉強する既に使用され...

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開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

著者は原稿、ビデオ ナレーションのパドマ Akkapeddi の批判的アントニオ Cidadão、イザベル Alcobia レオノル パレイラし感謝しているし、セルバンテス ・ デ ・ Histologia e の組織サービスからビトー プロアに Biologia を行うDesenvolvimento、Faculdade ・ デ ・ メディチーナ ・ デ ・ リスボア、パラナ ・ デ ・ リスボア、テクニカル サポートのため。Faculdade ・ デ ・ Unidade ・ デ ・ audiovisuais (視聴覚ユニット) からサンパウロ Caeiro とヒューゴ ・ シルバに特にお世話になっておりますメディチーナ ・ デ ・ リスボア、このビデオの生産への顕著なコミットメントのパラナ ・ デ ・ リスボア。我々 は親切提供するビデオ システムと Interaves を装備した堅実ライカマイクロシス テムズ株式会社を認める - Sociedade 農業 Pecuária、ウズラに貢献してくれて S.A 受精卵。この作品は、Faculdade ・ デ ・によって支えられたメディチーナ ・ デ ・ リスボア、パラナ de Lisboa (FMUL)。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
鶏の受精卵(Gallus gallus)ポルトガル、鶏場 
ウズラの受精卵 (Coturnix coturnix)、インタラーブスバードファーム 
15 mL PP遠心分離管Corning430052
50 mL PP遠心分離管Corning430290
60 x 20 mmパイレックス皿デュラングループ21 755 41
100 x 20 mmパイレックス皿デュラングループ21 755 48
ポリカーボネートメンブレンインサート Corning341224 mm トランズウェル 0.4 mm ポアポリカーボネート製メンブレンインサート付き 
メンブレンフィルターミリポアDTTP013000.6 mm イソポア メンブレンフィルター
6 ウェル培養プレートNunc, Thermo Fisher Scientific140675
ペトリ皿, 35 x 10 mmSigma-AldrichP5112 
パイレックスボウル 
トランスファーピペットSamco Scientific, Thermo Fisher Scientific2041S2 mL プラスチックピペット
ガラスパスツールピペットnormax5426015
Whatman 定性的な濾紙Sigma-AldrichWHA1001090濾紙
透明なプラスチックテープ 
サイトケラチン(汎、酸性および塩基性、I型およびII型サイトケラチン)、クローンLu-5BMA BiomedicalsT-1302
シクロパミン水和物Sigma-AldrichC4116Hhシグナルの薬理学的阻害剤
Fetal Bovine SerumInvitrogen、サーモフィッシャーサイエンティフィックStandart FBS
パラホルムアルデヒドSigma-AldrichP6148
ペニシリン-ストレプトマイシンInvitrogen、サーモフィッシャーサイエンティフィック15140-122
リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)GIBCO、サーモフィッシャーサイエンティフィック10010023
QCPN 抗体Developmental Studies ハイブリドーマバンクQCPN
RPMI 1640 ミディアム、GlutaMAX サプリメント GIBCO, Thermo Fisher Scientific61870010
Bluesil RTV141A/B シリコーンエラストマー 1.1Kg キットELKEM/SilmidRH141001KGペトリ皿の背部を調製するには
Stemolecule LY411575Stemgent04-0054Notch シグナル伝達の薬理学的阻害剤
TRIzol 試薬Invitrogen, Thermo Fisher Scientific15596026全RNA単離用試薬
デュモン#5鉗子ファインサイエンスツール11251-30 細い鉗子
極細ボンハサミ、湾曲ファインサイエンスツール14085-08湾曲ハサミ
昆虫ピン ファインサイエンスツール26001-30
マイクロスパチュラ ファインサイエンスツール10087-12スプーン
ミニューティアンピンファインサイエンスツール26002-20マイクロメス
モリアニッケルメッキピンホルダーファインサイエンスツール26016-12ホルダー
モリア穴あきスプーンファインサイエンスツール10370-17スキマー
ウェッカーアイシザーファインサイエンスツール15010-11
カメラライカマイクロシステムズ MC170 HD
ステレオスコープライカマイクロシステムズ ライカM80
顕微鏡ライカマイクロシステムズ DM2500
ピントバール養ポルトガルスーパーマーケットのスーパーマーケットの移植シリーズ

参考文献

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