動的なを促進するために齧歯動物のミクログリアの分離と培養分岐無血清培地の形態

サマリー

ミクログリアの機能の詳細を理解するための努力は、生体内で成熟したミクログリアの特性を要約ミクログリア培養モデルの欠如によって妨げられています。このプロトコルは定義されている培地条件下で高度分岐し成熟ラット ミクログリアの堅牢な生存を維持するために設計された分離と培養手法を指します。

要約

ミクログリアは、中枢神経系 (CNS) のすべてのセルの 5-10% を表し、開発、恒常性と病の間に彼らの貢献のための注目に高まっています。マクロファージは、数十年、ミクログリアの特殊な機能、中枢神経系の組織に常駐マクロファージの詳細研究されてきたが大きく神秘的な成熟したミクログリアを要約する能力の制限により一部に残っています。文化のプロパティ。ここでは、私たちは成熟した齧歯動物の脳から純粋なミクログリアの急速な隔離のための簡単な手順を示しています。時間をかけてミクログリア生存率の高レベルをサポートする無血清培養条件についても述べる。これら定義培地条件下で培養したミクログリア精巧な区分されたプロセスと動的監視行動を表わします。我々 は議論するどのミクログリアの生体内と同様、両方の文化の血清露出に比較してこれらの無血清培養および培養マイクログリアに及ぼす血清露出を示しています。

概要

中枢神経系の柔組織のマクロファージ、ミクログリア神経回路とグリア細胞のシグナリング ネットワークの広大な配列と通信します。彼らは開発およびシナプスの刈り込み、アポトーシス細胞のクリアランスと神経突起^1,2で一時的な相互作用を介して脳の恒常性の重要な役割を果たします。ミクログリアは、病変部に炎症性応答を調整し出血の^3、4を制限する彼らの長い、細いプロセスを拡張する神経学的な傷害に初期応答です。ミクログリアの形態と機能の変化は、急性および慢性の両方の中枢神経系傷害、ユビキタス、ミクログリア展示変更形態、ローカリゼーション、および多様な疾患状態¹中の炎症メディエーターの発現。人間の遺伝学的研究を示す神経変性疾患のための危険を変える突然変異は、病気の発症や進行^{5 におけるミクログリアの重要な役割を指して、そのまま中枢神経系におけるミクログリアによって表現頻繁に主にまたは専らこと}.けがや病気の彼らの卓越性を与えられた、新しい治療上のアプローチを開発するための高い優先度は、ミクログリアの生物学の理解を促進します。

ミクログリアの生物学の理解には多くの重要な進歩はテクニックとメカニズム他マクロファージを培養、遺伝子発現プロファイル、および機能の定義を含む集団の研究で発見された推定することによって生じています。形態/状態。マクロファージ機能しばしば中枢神経系ランドス ケープ内で意外な方法で再生を一般化、ミクログリアは自分自身、専門性の高い、分岐された形態および他の組織から離れてそれらを設定するユニークな遺伝子発現シグネチャを出展マクロファージ⁶。ミクログリアは他のほとんどのティッシュの大食細胞の異なる系統があります。彼らは原始造血の初期胚性波の中に中枢神経系を植民地化し、自己決定的な造血⁷からの貢献の独立した、生涯更新します。大人マイクログリアの完全に成熟した遺伝子発現シグネチャは、第 2 の⁸の生後週まで達成されていません。周囲の組織から環境の手がかりは、組織固有のマクロファージ機能⁶、中枢神経系血液脳関門⁹によって与えられた血液媒介要因への限られた露出を含むを口述筆記で主要な役割を果たします。

完全にミクログリアへの中枢神経の恒常性や病気を理解するための 1 つの障害が見られる成熟したミクログリア体内浄化された細胞の特殊なプロパティをさたの難しさ体外。分離する多くの方法が開発されている、文化そのままミクログリアがほとんどアプローチ細胞生存率をサポートするための血清に依存します。生理活性分子の広大な配列を含む本質的に変数の試薬は、ミクログリアの操作それはアメーバの形態を促進するため増加増殖は、特に問題となる、血清を加えている示されていると貪食亢進⁹は、ミクログリアが血液血液-脳関門の破壊後の要素にさらされる生体内でよく見かけます。これらのメトリックによって血清曝露細胞は、けがや病気の状態、ミクログリアを似ていますが、このような変化を減少しているミクログリアを亜セレン酸、コレステロール、TGF-β 髄液 1 (または IL-34) を含む定義された成長培地で培養すると。

このプロトコルは、最近出版された仕事⁹に関連する無血清条件下で幼若ラット ミクログリアを培養するための詳細を提供します。このプロトコルは、ラット生後 21-30 (P21 - P30) より合理化されていますが、収量および全体的な生存率は種および動物の年齢によって異なりますがラットおよびあらゆる年齢のマウスのミクログリアの分離に適応することができます。最大利回りし、若干未熟なミクログリアを使用するときに最適な生存を達成 (~ P9)、利回りと徐々 に先を細くやや大人動物の下位レベルの生存率。ミクログリアはマウスから分離することができますが、我々 はラットの細胞を示す有意に高い利回り、実行可能性、および分岐された形態の複雑さ無血清培養マウス細胞と比較して発見しました。動物が P50 より大きい高齢者このプロトコルで評価されていません。この immunopanning の分離のプロシージャは分離中ミクログリア転写プロファイルの変化を最小限にしてセルの下流の可能性を最大化する最適化されています。これらの技術とメディアの製剤を使用して、週間高生存率初代培養を維持できます。これらの条件下で培養したミクログリアは急速な拡張とプロセスの撤回を含む高度分岐し形態を展示し、増殖率が比較的低い。これらのプロパティの血清露出の意義を強調し、他のアプローチと比較してこの方法の長所と短所を話し合います。

プロトコル

齧歯動物を含むすべてのプロシージャは、国立と州法およびポリシーに準拠したスタンフォード大学のガイドラインに適合。動物のすべてのプロシージャは、スタンフォード大学の研究所動物愛護管理パネルによって承認されました。

注: すべてのソリューションとバッファー組成材料のテーブルで提供されます。

1. 準備ペトリ皿 CD11b Immunopanning (0 日)

注: は、すべての 1-2 の幼若ラット脳の 1 immunopanning 料理を準備します。

1. 15 cm のシャーレに 50 mm Tris pH 9.5 液 25 mL を追加します。
2. 6 μ G/ml の最終的な集中のための料理にヤギ抗マウス IgG (H + L 鎖) を追加します。均等に板を旋回します。
3. 37 ° C で 1-3 h の皿を孵化させなさい
4. DPBS +⁺ (リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) Ca^{2 +}と Mg^{2 +}) と 3 回リンス料理パン 1 μ G/ml OX42 抗体を含むバッファーのソリューションに置き換えます。平らな面に室温で一晩料理を残します。

2. 組織コレクション (1 日目)

注: このプロトコルは、3 〜 4 時間を取る必要があります。

1. 始める前に、すべてのソリューションは、滅菌、冷たい氷の上を確認します。氷の上のすべての機器を冷やすし、使用前にエタノールで消毒します。
2. 次の適切な規制制定手続、二酸化炭素の窒息によって少年の実験用ラットを犠牲に。
   注: また、若い動物が犠牲になるケタミン ・ キシラジン (24 mg/mL ケタミン、2.4 mg/mL キシラジンの 100-200 μ L) の致命的な線量を持つ。動物は年齢の 14 日以内である場合、ケタミン ・ キシラジンを使用する必要があります。複数の動物を使用している場合 1 つの動物から組織を抽出し、その後動物に進む前に氷の上あらかじめ冷やした DPBS^{+ +}に配置。
3. 続行する前に動物から完全な応答がないを確保して、後足をピンチします。
4. Transcardially は、10-30 mL の冷たい血流バッファー バッファー クリアを実行するまでに 27 G の針を使用して動物を灌流します。
   注: 灌流バッファーの量は、動物のサイズ/年齢によって異なります。
5. 灌流後すぐに動物の頭を削除します。両側後頭顆を解剖ハサミで切って脊髄から来て、脳を損傷しないように注意します。慎重にそれぞれの側を切り、頭頂に向かって鼻の骨の前面の骨に沿って片側をカットします。鉗子で慎重に頭蓋骨の上部を引いて、すぐに取り外し脳 (または興味の中枢神経系の構造)、中古冷蔵 DPBS^{+ +}に氷の上。
6. 残りのすべての動物に対して繰り返します。
   注: 適切な無菌条件の下で層流フードの手続のすべての手順を実行必要があります。

3. 機械的解離 (1 日目)

1. すべての脳が収集された後冷たいメス刃で氷の上のシャーレに 1 mm³チャンクに一つの脳をチョップし、5-7 mL 冷たい douncing バッファーと冷たい dounce ホモジナイザー転送します。一度に 1 つの脳を切り離します。
2. ゆったりした dounce ホモジナイザーを用いた 10-20 穏やかで不完全なストロークを使用して組織を切り離して考えます。直接粉砕、ホモジナイザーの下部組織ではなく、代わりにピストンの側面と、ホモジナイザー間の空間を通じて組織をインペル世話をします。
3. 気泡の導入を防ぐためにピストンを慎重に取り外します。ホモジナイザーの底に沈殿する不十分な解離組織塊を許可し、上清を新しい冷蔵 50 mL コニカル チューブに転送します。
4. 新鮮な douncing のバッファー、削除されたボリュームに置き換え、3-4 ラウンド、またはすべての組織が関連付けが解除されるまで合計 3.2 と 3.3 の手順を繰り返します。それぞれの脳の手順を繰り返します。

4. ミエリン除去 (1 日目)

注: ミエリン除去は、ミクログリア P12 より古い動物からの分離に使用されます。

1. 25 mL のピペットを使用して 50 mL コニカル チューブに細胞懸濁液の体積を測定し、33.5 mL に容量を調整する冷たい douncing バッファーを追加します。
2. 数回チューブの反転によって徹底的に細胞懸濁液とミックスに 10 mL の髄分離バッファー (MSB) を追加します。これは 43.5 mL の容積の MSB の 23% の最終濃度になります。
3. ゆっくりブレーキを 4 ° C で 500 × g で 15 分の細胞を遠心します。
   注: 遠心分離機は、減速する約 1.5-2 分を取る必要があります。これはミエリンと死んだ細胞の残骸、やや濁った上澄み、生きた細胞の濃縮は小さいペレットの上位層が生成されます。
4. ミエリン/破片やピペットで上澄みの最上位のレイヤーを削除します。それの多くは可能な限り削除されますを確保するための最上位のレイヤーを削除するとき注意してください。
5. バッファーをパンの 12 mL の細胞ペレットを再懸濁します。残っているかもしれない細胞の任意の塊を破るに細胞懸濁液をそっとカップ刻んだ。

5. Immunopanning (1 日目)

1. 細胞懸濁液の大きい残骸または細胞塊を削除する 70 μ m セル ストレーナーに通過します。
2. 3 回 DPBS^{+ +}と OX42 コーティングのパン皿をすすいでください。プレートを許可しない洗浄の間完全に乾燥。
3. 最後の DPBS^{+ +}洗浄を離れて注ぎ、フィルター処理された細胞懸濁液をパン皿に適用します。優しく細胞を配布するプレートを旋回し、付着する細胞を許可する 20 分間室温で平らな面にプレートを孵化させなさい。20 分以上インキュベートはないまたは細胞がお皿から復旧が非常に困難になります。
4. 非付着性のセルを削除する DPBS^{+ +}とパン皿 10 倍をすすいでください。ミクログリアとなりますので他の非付着性のセルの除去を確保するため各リンス版は渦巻きプレートにしっかりと取り付け。
5. 最後の DPBS^{+ +}洗浄を離れて注ぎ、15 mL DPBS^{+ +}と 200 μ L トリプシン (1.25% 原液) で置き換えます。
6. 10% CO₂ trypsinize 37 ° C で ≤10 分の皿を孵化させなさい。
   注: が 10 分以上続行しないでくださいまたはミクログリアは除去が困難になります。
7. Trypsinization の 10 分後に、ミクログリアがプレートにまだ立ち往生しているが。トリプシン/DPBS^{+ +}を注ぎ、水洗いしてトリプシンを削除、冷たいミクログリア培 (MGM) 12 mL に置き換えます DPBS^{+ +}で 2 倍。
8. セル/基板相互作用を弱めるし、料理を確認できる場所を 2 分間氷の上の皿をパンはパン皿の分野の乾燥を防ぐためにフラットです。
9. 積極的のピペット 10 mL ピペット、ピペット コント ローラーと高速パン皿から細胞を回復します。すべてのセルを削除しようとするピペットから液の流れに 16 × 16 のグリッドを描画します。
10. 細胞をプレートからデタッチを確認する 20 倍の倍率の顕微鏡下の細胞をチェックしてください。細胞がまだ立ち往生している皿の上にスポットをマークとこれらの分野でピペッティング繰り返し。
11. 細胞懸濁液上清 15 mL の円錐管あたりの分注 3-4 mL を収集します。ゆっくりブレーキを 4 ° C で 500 × g で 15 分間スピンします。
    注: セルの最大復旧できます少量によるミクログリアを回転します。
12. 細胞ペレットに MGM の 0.5 mL を残して上清を吸引します。
13. 残りの MGM でペレットを再懸濁し、すべての管から細胞のプールします。
14. 検定でのセルをカウントします。
15. 手順 6 - アプリケーションに応じて 7 で説明したように細胞をプレート。
16. 10% の CO₂と 37 ° C で培養細胞。
    注: 正規メディア変更で最大 3-4 週間またはメディア変更なしで 1 週間の文化は、細胞がすることができます。

6. スポット コーティング組織培養プレート/Coverslips (1 日目)

1. 24 ウェル アニオン ・ カチオン コート培養皿の中央に直接コラーゲン IV コーティングの 15 μ L をプレート (詳細については材料の表を参照) と 10% の CO₂と 37 ° C で 15 分間インキュベートします。
2. 検定とセル数を計数後 MGM の 10⁵/mL × 2.3 に細胞を希釈します。コラーゲン IV スポット、すぐにこの場所; に細胞懸濁液の板 15 μ L を吸引します。これは 10 の³セル/スポット x 3.5 を与えます。井戸の中に優しく付着、500 μ L の CO_{2 -}平衡 TGF-β 2/IL-34/コレステロール含んでいる成長媒体 (TIC) を追加するセルを許可する 10% CO₂と 37 ° C で 5-10 分間インキュベートします。
3. めっき 10 μ G/ml の策略-D-リジン (PDL) H₂O の場合は常温では、1 h での最初のコート滅菌ガラス coverslips coverslips 場合 H₂O、3 回を洗浄し、紫外線の下でフードに乾燥させます。Coverslips 乾燥されたら、続行、coverslips スポットめっきステップ 6.2 で説明するよう。

7. RNA ・ タンパク質分離用めっき

1. 日 1、コート全域、24 ウェル アニオン ・ カチオンのコラーゲン IV コーティングと組織培養プレートのコーティングし 10% CO₂、37 ° C で 10 分-1 時間のためのインキュベートを削除し、すぐにプレートの 3 ~ 5 倍の CO₂の 10 の⁴細胞/ウェル平衡TIC メディア。
2. 2 日目、それぞれの準備の翌日も 50% メディアの変更を実行します。死んだ細胞で、井戸の中心クラスター、だからそこからメディアを取りがちであります。
3. 文化を維持するために 50% メディア変更ごとに 2-3 日間を実行します。メディアの変更は、文化の不要な変数を導入、細胞は定期的なメンテナンスで 3 週間以上のではなく、メディア変更せず約 1 週間生き残ることができます。

結果

このプロトコルは、幼若ラットから文化分岐高純度ミクログリアにメソッドを説明します。同様の結果は、後述するように未熟な周産期および大人の動物を使用して取得できます。細胞分離には微妙なニュアンスや細胞を死の多くの機会があります、ので、さまざまな段階での成功を決定するため品質管理のチェックポイントを使いました。我々 は通常の隔離のプロトコル (図 1 a) 複数のステップで、検定を用いた細胞懸濁液を監視しました。成功した分離は、2.5-5 10⁵セル/少年動物 x を得られるはず。P7 - P15 から動物は、P30 より古い動物から分離した細胞を示す動物⁵セル/10 x 2.5 に近い利回りに対し 5 10⁵セル/動物、x に近い利回りを表示します。合計セルを監視を超えて、プロトコル全体カウントそれは難しいことができますこの方法で分離したミクログリア文化の最初の数日中に丸みを帯びたまたはバイポーラの形態を持っているので隔離されたセルの全体的な稼働状態を...

ディスカッション

ミクログリアは、sentinel 中枢神経系の免疫担当細胞として機能するため、環境の変化に非常に敏感したがって、分離、文化⁸時に細胞内での炎症反応を最小限に抑えるため細心の注意が必要です。これは、速度と温度をこのプロトコルで実現されます。動物は冷たい血流バッファーと灌流し、組織の間の時間を最小限に抑えるために合理化されましたプロトコルまたは 4 ° C で氷の上のセルを維持可能な大幅活性化、ので 4 ° C で遠心分離のすべての手順を実行するたびに、抽出、細胞培養します。単離細胞の遺伝子発現パターンを評価し場合、は、分離による変化を最小限にとどめるための trypsinization 前 CD11b immunopanning 皿から直接のセル lysates を収穫します。注意すべきことも慎重に分離されたミクログリアおそらく本質的に分離のプロシージャに関連付けられている被害関連シグナルの認識のための暖かい温度に置かれている時にすぐに炎症性応答を実行します。プロトコルが正常に実行された場合は、2.5-5 10⁵セル/幼若ラット x が期待されています。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ラット: Sprague-Dawley	Charles River	Cat# 400
マウス アンチラット CD11b モノクローナル (クローン OX42)	Bio-Rad	Cat# MCA275R	パンニング: 1:1,000;染色: 1:500
ヤギ polycolonal anti-Iba1	Abcam	Cat# AB5076	染色: 1:500
ウサギ polyclonal anti-Ki67	Abcam	Cat# AB15580	染色: 1:500
Alexa Fluor Donkey 抗マウス 594	Invitrogen	Cat# 11055	染色: 1:500
Alexa Fluor Donkey 抗ヤギ 488	Invitrogen	Cat# A-21203	染色: 1:500
AlexaFluor Donkey anti-Rabbit 647	Invitrogen	Cat# A-31573	染色: 1:500
Triton-X (ICC染色の界面活性剤)	Thermo Fisher	Cat# 28313
ヘパラン硫酸ガ	レン研究所用品	Cat# GAG-HS01
ヘパリン	シグマ	Cat# M3149
乳固形物からのペプトン	Sigma	Cat# P6838
TGF-β2	Peprotech	Cat#100-35B
マウスIL-34	R&D Systems	Cat# 5195-ML/CF
Ovine wool cholesterol	Avanti Polar Lipids	Cat# 700000P
コラーゲン IV	コーニング	Cat# 354233
オレイン酸	ケイマンケミカルズ	Cat# 90260
11(Z)Eicosadienoic (Gondoic) Acid	Cayman Chemicals	Cat# 20606
Calcein AM dye	Invitrogen	Cat# C3100MP
Ethidium homodimer-1	Invitrogen	Cat# E1169
DNaseI	Worthington	Cat# DPRFS
Percoll PLUS	GE Healthcare	Cat# 17-5445-02
Trypsin	Sigma	Cat# T9935
DMEM/F12	Gibco	Cat# 21041-02
ペニシリン/ストレプトマイシン	Gibco	Cat# 15140-122
Glutamine	Gibco	Cat# 25030-081
N-アセチルシステイン	シグマ	Cat# A9165
インスリン	Sigma	Cat# 16634
アポトランスフェリン	Sigma	Cat# T1147
亜セレン酸ナトリウム	Sigma	Cat# S-5261
DMEM (高グルコース)	Gibco	Cat# 11960-044
Dapi Fluoromount-G	Southern Biotech	Cat# 0100-20
ポリ-D-リジン	シグマ	キャット# A-003-E
プリマリアプレート	VWR	Cat# 62406-456
Name	会社	カタログ番号	コメント
Stock試薬
Apo-transferrin			再構成:PBS 中の10mg / mL使用濃度:1:100 保存:-20°C;C
N-アセチルシステイン			再構成:H2O 中の5 mg/mL 使用濃度:1:1,000 保存:-20°C;C
亜セレン酸			再構成: H2O で 2.5 mg/mL 使用濃度: 1:25,000 保存: -20°C;C
コラーゲン IV			再構成: 200 μPBS 中のg / mL 使用濃度:1:100 保存:-80°C;C
TGF-b2			:PBS で2mg / mL使用濃度:1:1,000 保存:-20°C;C
IL-34			再構成:200 μPBS の g/mL 使用濃度: 1:1,000 保存: -80°C;C
ヒツジウールコレステロール			再構成:100%エタノール で1.5mg / mL 使用濃度:1:1,000 保存:-20°C;C
ヘパラン硫酸			再構成:H2O 中の1mg/mL 使用濃度:1:1,000 保存方法:-20°C;C
オレイン酸/ゴンド酸			再構成:ゴンド酸:0.001mg / mL;オレイン酸:100%エタノール 中の0.1mg / mL 使用濃度:1:1,000 貯蔵:-20°C;C
ヘパリン			再構成:PBS 中の50mg / mL使用濃度:1:100 貯蔵:-20°C;C
名前	会社	カタログ番号	コメント
ソリューション
灌流バッファー			レシピ:50 μDPBS++のg / mLヘパリン(Ca++およびMg + +を含むPBS) コメント:氷冷時に使用
Douncing Buffer			レシピ:200 μ50 mLのDPBS++ コメント:氷冷時に使用
パニングバッファー
			:100ユニット/ mLペニシリン、100 & μ;g/mL ストレプトマイシン、2 mM グルタミン、5 μg/mL N-アセチルシステイン、5 μg/mL インスリン、100 μg/mL アポトランスフェリン、および 100 ng/mL 亜セレン酸ナトリウム コメント: 氷冷した MGM を使用して、イムノパニング皿からミクログリアをパンします。
コラーゲンIVコーティング			レシピ:MGM2μg/mL コラーゲン IV
ミエリン分離バッファー			レシピ: 9 mL Percoll PLUS、1 mL 10x PBS (Ca++ および Mg++、9 μL 1 M CaCl2, 5 &μ;L 1 M MgCl2 コメント: を添加した後、よく混ぜてください。CaCl2およびMgCl2
TGF-b2/IL-34/コレステロール含有増殖培地(TIC)			レシピ:ヒト 2 ng/mL TGF-b2、100 ng/mL マウス IL-34、1.5 μg / mLヒツジウールコレステロール、10 μg/mL ヘパラン硫酸、0.1 μg/ml オレイン酸、および 0.001 μg / mlゴン酸 コメント:37°Cに温めた培地にコレステロールを追加してください。C で、1.5 &mu を超えないようにします。g / mLまたは沈殿します。コレステロール含有媒体をろ過しないでください。TIC培地を10%CO2で30分間1時間平衡化してから、細胞に添加して最適なpHを確保します。

ナトリウム 再構成レシピ:DPBS ++ミクログリア増殖培地(MGM)中の乳固形物からの2 mg / mLペプトンレシピ