方法論記事

DNA 染色、シアニン色素が消化される制限の酵素とかどうかを決定します。

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DOI：

10.3791/57141

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2018年2月2日

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1Department of Chemistry, University of Nebraska - Kearney

この記事について

サマリー

蛍光顕微鏡用 dna を染色科学者実験中にそれらを表示することができます。今回紹介した方法で DNA 分子は事前に蛍光染料で染色された、メチル化および非メチル化敏感な制限の酵素と消化されます。

要約

蛍光顕微鏡用 DNA の可視化は、さまざまなシアニン色素などの色素を利用しています。これらの染料は、DNA の彼らの親和性が高いと感度のため利用されます。DNA 分子実験の完了の後の完全な長さをかを決定するためには、ステンド グラスの分子が DNA の制限の酵素と消化によって完全な長さをあるかどうかをメソッドが必要です。しかし、ステンド グラスの DNA は酵素が阻害する可能性があるため、螢光色素の 1 つ使用できるどのような酵素は、DNA を染色する方法が必要です。このメソッドでは、DNA は染料と平衡に DNA を許可する一晩シアニン系感光色素と汚れます。次に、ステンド グラスの DNA は制限の酵素と消化され、ゲルに読み込まれ、electrophoresed。実験的 DNA ダイジェスト バンドは、制限酵素活性を決定するインシリコダイジェストと比較されます。期待どおりに、バンドの同じ数がある、反作用は完了です。部分消化を示す予想よりもより多くのバンドおよびより少ないバンド不完全な消化力を示します。この方法の利点は、そのシンプルさと科学者が制限の酵素の必要な機器を使用して試金およびゲルの電気泳動。このメソッドの制限はほとんどの科学者に利用可能な酵素が市販の酵素;ただし、任意の制限酵素を使用可能性があります。

概要

トト シリーズ (TOTO 1 ヨーヨー 1 ポポ 1、ボボ 1、トト 3、ヨーヨー 3、ポ-3、ボボ-3;表 1)さまざまな DNA の可視化が必要な1,2,3,4,5,6,7、の実験に利用されています。8,9,10,11,12,13,14,15,16,17. シアニン ダイマー家族はその量子収率、感度、および DNA 分子18,19,20の親和性が高いため広く使用されています。シアニン ダイマー色素蛍光21の 100 〜 1000 倍の増加を持っている偉大な選択インターカ レートしたとき、二本鎖 DNA があります。ピリジニウム染料 (ヨーヨー 1、TOTO 1、ヨーヨー-3、およびトト 3)、quinolium (ボボ 1、ポポ 1、ボボ-3、およびポポ 3) (表 1) のカウンター パート22よりも短い波長があります。また、DNA にインターカ レートしたシアニン ダイマー量子収率は高い (0.2 - 0.6)22。ただし、既に蛍光染料で染色、DNA の分子の23を拡大または DNA 分子2のメチル化プロファイルを決定する酵素を使用すると、どのような酵素はステンド グラスの DNA を消化を判断する方法が必要です。DNA に主体の染料の任意の型、または DNA 基板の識別可能なパターンを提供する酵素は、このメソッドを使用できます。

孟らはまず、さまざまな異なる染料24を使用してゲルの電気泳動による prestained DNA の消化率を決定します。Maschmannらに掘り下げたを染料のトト家族見て深い。両方には、DNA の特定の色素で染色でした25の制限の酵素と消化されるかどうかを参照してくださいに汚された DNA の消化率が決定されます。他の方法は、光ピンセット26または27NMR を用いた DNA にインターカ レートした色素の結合効果を検討します。どちらの方法でも特殊な装置が必要です。このメソッドを使用する場合は染料を判断しなければならないほとんどの分子生物学実験室機器に対し、制限酵素消化を妨げます。

また、任意の分子の長さを測定する他の方法で光マッピングは表面に無染色の dna を伸長、ストレッチとフラグメントのサイズを決定する DNA を消化します。輪郭の長さが異なる21染料のインターカレーションは DNA 分子の蛍光染色の使用染料によって輪郭の長さを増加する示されています。このメソッドは様々 なゲノム1,3,4,6,13,28,29,30,に利用されています。31します。 ただし、分子の色素と酵素によって、あらかじめ染色なら、酵素できないことがあります特定の色素に染まった DNA を切断します。したがって、このメソッドは、特定の色素に染まった DNA 酵素と消化できないかどうかを決定します。さらに、染料と染料の利用、DNA の移動度の濃度に応じてゲルのバンド移行されます32 の塩基対の間に挿入するための染料のための部屋を作る DNA のバックボーンの部分的なアンワインドのためネイティブ DNA よりもゆっくりと.

しかし、時々 これらの染料を部分的または完全にある特定の制限の酵素7,24の作用を抑制します。これは蛍光染料、酵素を特定の順序を認識できない場合がありますの添付ファイルによって引き起こされる DNA の構造変化が原因であると考えられます。これらの染料が制限の酵素にどのような影響を与えるかを理解することは、実験でメチル化プロファイルまたは汚された DNA のストレッチが必要です助けることができます。

手法では, DNA は興味の螢光色素で染色され制限の酵素と消化されます。DNA がゲル、イメージの electrophoresed だったし、制限の酵素の消化率を測定しました。制限酵素は、ゲルの切断面パターンに基づいて選ばれました。バンドが多すぎる原因 DNA バンドの重なりとあまりにもいくつかのバンドは DNA の分子の完全な画像を与えていません。消化の DNA 分子のプロファイルを決定することができるにスイート スポットがあります。したがって、それは使用される DNA や酵素に依存されます。この方法の利点はその単純さです。それだけ制限消化とゲルの電気泳動で使用する機器が必要です。

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プロトコル

1. 染料、バッファー、Agarose のゲルの準備

  1. DNA や染色の DNA の消化力の汚損のための次のソリューションを準備します。
    1. 1 x テ (酸トリス-HCl とエチレンジアミン; を準備します。10 mM メスシリンダーやメスフラスコでトリス-HCl と 1 mM EDTA を使用して EDTA) バッファー。常温 (18-25 ° C) で保存します。
    2. 各色素の因数を作る: TOTO 1、ヨーヨー 1、ポポ 1、ボボ 1、トト 3、ヨーヨー 3、ポ-3、ボーボボ 3 (表 1)。濃い黄色に 1 mM 染料の 4 μ L をピペットまたは 1.5 mL チューブを黒し 1 x テの 36 μ L を追加、ピペット; を使用してミックスこの濃度 100 μ M 染料液 (40 μ L 合計) になります。この手順では、各色素のため。4 ° C でのストア
      注: は、色素退色や色素の劣化を防ぐために光の露出を避けます。
    3. 10 mM ビス トリス プロパン塩酸、10 mM MgCl2、および 100 μ g/mL ウシ血清アルブミン (BSA) を使用して 1 のバッファーを準備します。2 50 mM NaCl を使用してバッファーを準備 10 mM トリス塩酸、10 mM MgCl2、および 100 μ g/mL BSA。3 50 mM 酢酸カリウム、20 mM トリス酢酸、酢酸マグネシウム 10 mM と 100 μ g/mL BSA を使用してバッファーを準備します。各酵素には、機能するこれらの特定のバッファーが必要です。
  2. 次の解決策をゲル電気泳動に備えます。
    1. 確認荷重 x 6 0.25% ブロモフェノールを組み合わせることによって染料の青、0.25% キシレンシアノール 15% dH2O. ストア常温で Ficoll。
    2. 0.7% の agarose のゲル、三角フラスコに高いゲル化 (先ず) か温度の agarose の 0.07 g を量り 100 mL の 1 x TAE バッファーを追加し、フラスコの上に倒立ビーカーを配置します。
      1. ホット プレート上にあるソリューションを熱泡はフラスコ、上にフロートの下部に形成し始めるまで。
      2. ホット プレートからソリューションを削除、フラスコは、素手で触れることでき、井戸を作成するゲル櫛で 24.5 cm x 21.8 cm ゲル鋳型にゲルを注ぎなさいまでソリューションを冷ます。
      3. ピペット チップでそれらを飛び出るで櫛の近くまたはゲルの表面の泡を削除し、ゲルを許可する、少なくとも 15 分間を固めます。これは、汚染やジェルの乾燥を防ぐために 1 週間のためのプラスチック製のラップに包んで冷蔵庫 (4 ° C) に格納できます。ゲルを実行する方法の詳細については李らを参照してください。33.
        注: は、30 個々 の井戸のゲル櫛を使用します。4.5 mm 幅 2 mm の深さでよくする必要があります。井戸の高さは、ボックスに注がれるゲルの量に依存します。
    3. 40 mM トリス-HCl、20 mM 酢酸と 1 mM EDTA を使用して 1 x TAE (トリス酢酸 EDTA) バッファーを準備します。常温 (18-25 ° C) で保存します。

2. ステンド グラス DNA の準備

  1. ラムダ DNA (300-800 ng) 染料の異なる因数を使用して染色します。各染料 (表 1) でお越しの際にもテスト、制限酵素あたり 48 反応の合計六つの異なる濃度。次のプロセスは、1 反応 (図 1) をセットをについて説明します。
    1. 100 に 1 x TE を使用してラムダ DNA を希釈 ng/μ L 4 ° c で保存。300 μ L の容量を持つソリューションを確認します。
    2. 非メチル化ラムダ DNA を染色します。ダイジェストから期待される各バンドの 75-100 ng/バンドを推定します。1.9 μ M、3.8 μ M、μ 19.4 M、32.2 μ M、48.3 μ M、63.5 μ M の濃度を生成する色素の適切な量を追加/100 ng の DNA の。
    3. 一晩インキュベート (15 18 h) 4 ° C で
    4. 1 つの反作用制御25として無染色のままします。
      注: は、消化反応の非メチル化 DNA を使用します。メチル化敏感な酵素は DNA のメチル化領域を切り取ることはできません、不完全な消化の外観を与えます。

3. 制限酵素試金の準備

  1. ダイジェストは、その酵素が prestained DNA (図 1) を消化できるかどうかを決定するための制限の酵素と DNA を染色します。
    1. 次の日は制限酵素、(表 2)、適切なバッファーの 3 μ L の 20 U を追加し、30 μ L の合計のために蒸留水オートクレーブおよびフィルター処理。それぞれの酵素反応では、製造元の web サイトで見つけることができます最高の切削効率とバッファーを選択します。
    2. 反応が、Maschmannらに使用される 6 酵素の表 2 に記載されている最適の酵素活性の温水浴。、2-4 h (表 2)25。
    3. 0.5 M EDTA pH 8.0 の 2 μ L の追加によって反作用を停止します。

4. Electroeluting Agarose のゲルの DNA を染色

  1. 24.5 cm x 21.8 cm ゲル型 (ステップ 1.2.2) から側面を削除し、ジェルをゲル電気泳動のボックスにします。ボックスに 1 x TAE バッファーの 2.5 L を注ぐ。井戸がアクセス可能な33を慎重に、ゲルからゲル櫛を取り外します。
  2. プラスチック フィルム上に制限酵素反応のピペットし、ローディングの染料 × 6 とそれぞれ反応を組み合わせます。各反応液 1 μ L の DNA 溶液 (1 x) の 5-6 μ L ごとに染料を読み込んで x 6 を追加します。その後、ピペットの反応 (読み込み色素を含む < 18 μ L) 井戸に。
  3. 1 kb のはしごの 1 μ L、1 x テ, 9 μ L とローディングの染料 × 6 の 2 μ L を混ぜます。井戸フランクの他のソリューションをソリューションに読み込みます。
  4. 濃い青や黒い紙や布でジェル ボックスをカバーします。ジェル ボックス電源 30 V、電源をセットして一晩実行 (15-20 h) に接続します。ラベル付けされた DNA の電子スピンダイナミクスを防ぐために、ゲルの実行中、ライトをオフにします。
  5. 次の朝は、電源をオフに。トレイを使用してゲルを取るし、45 臭化エチジウム μ L と 1 L 1 x TAE バッファーのコンテナーにそれを転送します。光への露出を防ぐために箔で暗闇の中で部屋の温度やカバーのコンテナーを格納します。部屋の温度の少なくとも 45 分の汚れをジェルができます。
    注意: 臭化エチジウムを使用し手袋と安全メガネを着用します。エチジウム ブロマイド溶液とゲルを捨てて容器をきれいにするとき使用エチジウム ブロマイド; に対処する方法を決定する状態破棄のガイドラインを参照してください。また、その他の汚れは、エチジウム ブロマイド代わりに利用されるかもしれない。

5. Agarose のゲルのイメージング

  1. 400-500 nm の間最大光出力を発する青い光の transilluminator の上にジェルを配置します。駅に接続されているカメラで写真を撮る。
    注意: 照明器具のカバーを使用し、光源の電源を入れる前に保護眼鏡をかけることを確認してください。
    注: この手順も完了するかもしれない紫外光源または標準的なゲルのスキャナーを使用しています。
  2. ImageJ ImageJ のステータスバーにファイルをドラッグすると、写真を表示、画像がポップアップ表示。
  3. 予想されるインシリコゲル パターンにゲルのバンドを比較することによって実験の消化率を決定します。消化率を確認するのに実験的なバンドの数は DNA バンド24,25の数で分けられます。実験的消化の DNA のバンド パターンが予想されるパターンは、消化率は 1 です。消化率が 1 より大きいパターンに予想よりもさらにフラグメントがあるか。パターンに予想よりも少ないのフラグメントがある場合、消化率が 1 より小さいです。

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結果

正しい順序で手順を実行する必要がありますデュアルインターカレーションの色素は DNA を消化制限の酵素に影響を与える場合を決定するために (図 1) に続いた。DNA を染色し、特定の酵素と消化され、一度は、フラグメントとサイズ (図 2) の数を決定するゲルの画像を取得できます。ために酵素の効率、予想される目に見えるバンド目に見えるバンドの数で割った値の合計数を決定します。バンドの数が予想される場合、団結に匹敵する酵素の効率と見た試合。次に予想されるゲルの他のバンドがある場合、値が 1 より大きいと部分的に消化反応を示します。予想以下のバンドが存在する場合、値が 1 より小さい、不完全な消化力を示すです。図 2 a3 と 4 の車線ショー バンドの可動性が減少している、井戸へのシフトがバンドの原因。1 と 2 の車線、バンド コントロールに一致するので色素の量は、モビリティを著しく、影響としま...

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ディスカッション

蛍光に分類された DNA (図 1)を消化するために一連の手順が必要です。最初に、DNA は染色、螢光色素の一夜。DNA は、時間の短い期間のためシアニン ダイマーで培養できます。しかし、カールソンらは DNA が不完全な染色20による DNA サイズごとに二重のバンドを作成することを発見しました。この問題を解決するため、DNA は二重バンドが発生するを防ぐために一晩汚すことができます。これは、プロトコルの重要なステップです。染料が十分に長い時間の培養されていない色素 DNA は平衡でできないし、ダブル バンディング パターンを与えます。これが発生した場合は、時間の長い期間の平衡に DNA 染料混合物を許可します。

次に、制限酵素は DNA 色素混合物に追加し、各酵素の特定の温度で 2-4 時間消化します。DNA がメチル化敏感な酵素のメチル化である必要があります。そうでない場合、メチル化された DNA は切断 DNA メチ...

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開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

この研究は国立研究所の一般的な医療科学 (日の出) (5605100122001)、ネブラスカ大学カーニー (UNK) 夏学生研究プログラム (SSRP) と UNK と同様、国民衛生の健康 (NIH)、コンポーネントによって資金を供給学部研究員 (ウルフ)。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
非メチル化ラムダDNANEBN3013S
YOYO-1サーモフィッシャー・サイエンティフィックY3601
TOTO-1サーモフィッシャー・サイエンティフィックT3600
POPO-1サーモフィッシャー・サイエンティフィP3580
BOBO-1サーモフィッシャー・サイエンティフィックB3582
YOYO-3サーモフィッシャー・サイエンティフィックY3606
TOTO-3サーモフィッシャーサイエンティフィックT3604
POPO-3サーモフィッシャーサイエンティフィックP3584
BamHINEBR0136S
PmlINEBR0532S
ScaINEBR3122S
EcoRI NEBR0101S
HindIIINEBR0104S
SmaINEBR0141S
トリスフィッシャーBP152-1刺激性
EDTAフィッシャーS316-212有毒
なHClフィッシャーS25358腐食性および刺激性
バッファー1NEBB7201SNEB 1.1
バッファー 2NEBB7202SNEB 2.1
バッファー 3NEBB7204SNEB Cutsmart
高ゲル化温度アガロース ゲルロンザ50041
酢酸フィッシャーS25118危険な
青色光トランスイルミネーターダークリーダーDR196正しい眼鏡を着用してください 
エチジウムブロマイドフィッシャー15585011発がん性物質;他の代替品はナンシー520、ジェルレッドなどです。
キャノン EOS Rebel T3I カメラキャノン
アポジー モデル H4バイオラッド1704510
パワーパック ベーシック電源バイオラッド1645050 
フィコールフィッシャーサイエンティフィックBP525-25
ブロモフェノールブルーフィッシャーサイエンティフィックB-392
キシレンシアノールイーストメンT1579
ック

参考文献

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