共焦点顕微鏡を明らかに細胞表面受容体画像相関分光法による凝集

サマリー

ターゲット細胞表面受容体に結合する抗体は、コンフォメーションとクラスタ リングの変化を与えることができます。これらの動的な変更には、標的細胞で医薬品開発を特徴付けるための含意があります。このプロトコルは、共焦点顕微鏡、細胞表面の受容体の程度を定量化する ImageJ/フィジーから画像相関分光法を利用しています。

要約

共焦点顕微鏡は、特性評価および蛍光プローブの付いた前臨床のエージェントの更なる発展の重要な細胞内の対話をキャプチャにアクセス可能な方法論を提供します。抗体による細胞毒性薬の最近の進歩と配信システム、受容体の集約と内面のレルム内でこれらの剤によって誘発された変化を理解することは非常に重要です。このプロトコルは蛍光免疫細胞化学の確立された方法論と作り付け自己相関とイメージ数学関数、空間イメージの相関を実行する ImageJ、オープン ソースのフィジー分布を活用します。分光 (ICS)。このプロトコルは、共焦点顕微鏡のビーム領域の関数としてラベル付けされた受容体の蛍光強度を quantitates します。これは細胞表面上のターゲット分子の凝集状態の定量的測定を提供します。この方法論は受容体集合の時間調査に拡大する可能性を持つ静的セルの特性評価に焦点を当てた。このプロトコルは、技術と非専門イメージング装置に確立よく利用した細胞表面で発生するイベントをクラスタ リングの定量化を提供するアクセス可能な方法論を提示します。

概要

抗体医薬の開発は、複数の腫瘍のタイプ¹の治療で顕著な成功を示しています。抗体薬物複合体 (ADC) の最近の進歩、細胞毒性物質の配信メカニズムは、細胞での抗体: 受容体相互作用のダイナミクスを理解するための要件を拡大している^{2 を}表面します。次の細胞表面受容体に対する抗体が成功したターゲット、これらの複合体はリガンド: 抗体の相互作用³で観察された同じような集計パターンを引き起こすことができます。受容体の凝集の変化が細胞表面から膜、受容体とその除去の内面化の結果への変更を誘発します。抗体薬物複合体においては、このプロセスはその後内面エンドソームとその後効果的な細胞の殺害の結果、細胞質に細胞毒性のペイロードを解放します。

共焦点顕微鏡は、抗体とそのターゲット受容体⁴のこれらの重要な相互作用を可視化する効果的な手段を提供しています。細胞表面のターゲット分子の集合の変更を検討するには、このプロトコル利用空間イメージ相関分光法 (ICS) テクニック^{5,6,7 を介して共焦点顕微鏡画像の後処理}.

画像相関分光法の基礎は、空間の蛍光強度のゆらぎを共有ラベルの構造の密度と凝集状態に関係すること観察です。この関係を確立するには、次の画像⁵の空間的自己相関関数の計算。

画像相関分光法のすべての亜種は、画像相関の計算を必要とします。画像内に含まれる定量凝集状態パラメーターの抽出のための二次元ガウス曲線にはこの関数をフィッティングが続きます。簡単な言葉でイメージ自己相関の計算を含むすべての画像内に含まれる可能性を計算可能なピクセル ペアを比較する両方均等に互いのように明るい。これはピクセル分離⁸の方向と距離の関数として可視化します。

画像相関分光法の理論的枠組みは、ペーターゼンとワイズマンらによって定義および設立されました。^5,6。 このプロトコルで自己相関計算はスプレッドシート アプリケーションと同様に、フィジー/ImageJ で行われます、 (式 1)として強度変動の空間的自己相関関数のための基礎を記述できます。

     

Fがフーリエ変換を表しますF^{− 1}逆フーリエ変換;F *その複素共役;空間のラグ変数εとη。空間の ICS でこのプロトコルで説明するよう自己相関関数で計算できます 2次元高速フーリエ変換アルゴリズム^7,9。ゼロ ゼロ遅延、 g₁₁(0, 0) として知られている空間的な分離で自己相関は、粒子ビーム顕微鏡の面積あたりの逆の平均数を提供します。二次元ガウス関数(Eq 2)空間的自己相関関数のあてはめによる取得できます。

     

キャプチャ イメージ内のピクセルは設定エリア内で含まれているし、これらの測定値が無限大に拡張しない用語 g∞ は、イメージ内に含まれている長距離の空間相関を考慮してオフセットとして使用されます。分子サイズ集計、ω は顕微鏡の点広がり関数と空間的自己相関関数の最大値の半分で全角で記述。サブ解像度蛍光ビーズを使用して器械の点広がり関数内にある領域を適合できます。

記載画像相関分光法によるプロトコルの自己相関および ICS を完了するために必要な数学の関数を使用して実行、ImageJ の分布、フィジー¹⁰オープン ソース画像処理プラットフォームプログラム^11,12。フィジー/ImageJ は、プレインストールされた高速フーリエ変換 FFT 数学関数を利用しています。この関数は、各寸法¹³の 2 つの要因によってデータの範囲を減らすことによってこの計算の計算時間を短縮します。2次元自己相関関数は x 軸と y 軸で対称で約自己相関イメージを介して一行プロフィール プロットは空間のラグの関数として生の自己相関を測定する使用できます。計算の前にさらに、自己相関振幅 (ピーク値、 g(0)_T) と式(式 3)背景を補正したゼロ遅延物音が削除されます。

     

どこ私_bはセルを除く背景領域からの平均強度。クラスター密度または蛍光物体の密度は、 (Eq 4)によって定義されます。

    

記載プロトコル値に近づいた空間の遅れに伴い 1.0 に正規化自己相関関数が崩壊観測に基づく仮定単にクラスター密度 (CD) の計算が更に。最大空間遅れで相関があるもはや蛍光の強度値とこうして相関なしこの地域で計算、この強度で割ってその後掛けた強度の値の計算、1.0 に等しくは、定義によって、その強度の正方形。したがって、正規化自己相関関数からクラスター密度はその相互(Eq 5)を撮影する前に正規化自己相関関数から 1.0 を減算することによって計算できます。

     

ビーム領域のさらなる校正は、計測器の点拡がり関数の領域内に含まれるクラスターの数を量的に実行できます。このキャリブレーションは、画像相関分光解析中に使用される同じ光の条件を使用して行われなければなりません。

プロトコル

1. イメージング実験のため付着性のセルラインの播種

1. よく一晩 (O/N) 10% 含有ダルベッコ変更イーグル培地/栄養混合物 F-12 (DMEM/F-12) メディアの 300 μ L あたり 10,000 A431 類表皮癌細胞を播く、8 で GlutaMAX がイメージングを腔症牛胎児血清、1% ペニシリン-ストレプトマイシンおよび 1%高解像度油浸対物レンズに適したスライド (例えば、 NuncTM ラボ TekTM coverglass を腔症)。
2. 10 分間室温 (RT) のメディアで 100 ng/mL の EGF 配位子を添加した A431 細胞受容体集計を刺激します。

2. 一次抗体の孵化

1. メディアを取り出し、室温 (RT) リン酸緩衝生理食塩水 (1 x PBS) 300 μ L でセルを 2 回洗います。
2. 200 μ L の PBS で室温 10 分 4% パラホルムアルデヒドとセルを修復します。
   注: ターゲット集計の経時変化を調べるには、この固定の手順を省略する必要があります。
3. PFA を削除し、300 μ L 常温 PBS のセルを 2 回洗浄します。
4. 200 μ L の PBS の 4 ° C で 2 時間、少なくとも 10 μ G/ml の濃度で一次抗体を含むセルを孵化させなさい
   注: 有効な ICS の計算、すべて受容器細胞の表面に存在は一次抗体と分類する必要があります。これは各一次抗体の希釈系列で予備実験を必要とする (1:10、1:50、1: 100、1: 200 000、1:1、1: 500など) を実行します。最適な一次抗体の濃度は、クラスター密度と蛍光強度の解析によって決定されます。選択したプライマリ濃度は、クラスター密度が非特異抗体の結合の結果としてクラスター密度でさらに増加する前に一次抗体濃度の増加と高原とに発生します。経時的イメージング実験を実行している場合、血清無料メディアの一次抗体を希釈ことができます。
5. 目的のインキュベーション時間が完了した後、300 μ L RT PBS のセルを 2 回洗います。
6. 5% ウシ血清アルブミン (BSA) PBS の 4 ° C で少なくとも 2 時間でサンプルをブロックします。
   注: 固定サンプルがブロックされて定期的に 4 ° C で一晩 (O/N)

3. 二次抗体の孵化

1. 蛍光標識二次抗体 (例えばAlexa Fluor 488 IgG) PBS での 10 μ g/mL のストックを準備します。2 μ G/ml ヘキスト 33342 の顕微鏡でサンプルの検出を許可するこの希釈に含まれます。
   注: タイムラプス実験のため PBS は血清無料メディアを交換できます。
2. 5% 除去 BSA/細胞からの PBS と周囲の光からサンプルを保護しながら 4 ° C で 2 時間二次抗体溶液とインキュベートします。
3. 二次抗体の培養時間を修了すると、300 μ L の PBS (2 回) と細胞を洗浄し、周囲の光から保護する、4 ° C で保存します。
4. 蒸発を防ぐためには、パラフィルムでチェンバー スライドのエッジをラップします。

4 サンプルの共焦点顕微鏡

注: 共焦点の分析に使用する設定は装置および個々 の実験で使用される蛍光物質によって異なります。モダンな共焦点計測器は、実験では、計測器のネイティブ イメージ ファイル形式で使用されるすべての撮像パラメーターを保存するためのメカニズムを提供します。データ集録の異なる期間にまたがる実験条件の適切なレプリケーションを提供するためにこれらの設定が記録されていることが重要です。

1. 蛍光信号のイメージング、中に白とびを避けるため。ピクセルの彩度の偽色表現を提供するテーブルをイメージ検索を使用し検出器ゲインを削減し、電力をそれに応じてレーザーします。共焦点楽器最もこの集録ソフトウェアの「範囲インジケーター」設定または類似したオプションがあります。
2. レーザー出力に関心の蛍光体の露出を最小化します。ヘキスト 33342 など DNA ラベリングの汚れの使用を検出し、コレクションの前にビューのフィールドのサンプルを配置する簡単なメカニズムを提供します。
3. 低解像度でサンプルの初期スキャンを実行ソフトウェア許可高速スキャン速度。これはサンプルの可能な退色が制限されます。
4. キャプチャ解像度を上げるし、画像データを収集する準備ができたら、スキャン速度が遅い。
5. 共焦点計測器を許可する場合は、フォトンカウンティング モードを使用してデータを収集します。
   注: フォトンカウンティングが計測器を使用できない場合: な灰色レベルが画像取り込み時に線形。
6. 各行 1 風通しの良い単位 (AU) に使用されるレーザーのピンホールを設定します。
7. 使用行またはフレーム検出器を減らすために画像集録 (x4) 中平均は、ノイズを関連付けられています。
   メモ: ICS のこの亜種のみ 1 つの時点をキャプチャするとき取得時間は実験的制限要因。
8. イメージ コレクション選択高倍率最大解像度と (例またはを含むプラン ・ アポクロマート 100 X 63 X/1.40 球状と色収差の収差補正を提供するために、計画アポクロマート目的などの高開口数目標油の目的)。
9. 画像に含まれるキャプチャされたピクセルのサイズをオーバーします。各ピクセルをキャプチャ 50 x 50 nm 領域をお勧めします。効果的な ic で、ピクセル サイズはピクセルあたり 0.1 μ m² × 0.1 未満をする必要があります。これは比較的小さい区域をスキャンするズームインと比較的大きなイメージ形式 (例: 1024 x 1024 または 2048 x 2048 ピクセル) の選択の組み合わせによって実現されます。
10. できるだけ平坦地域で細胞の頂端または基底の表面に焦点を当てます。複数のセルを 1 つのイメージと ICS 分析中に個別に処理対象領域で収集できます。
11. サンプルの正規化に使用する同じ機器の設定を使用してセルの無料背景領域をキャプチャします。

5. 画像相関分光法の計算

注: 自己相関および ICS に不可欠な数学関数を実行するオープン ソース画像処理プラットフォーム、フィジー、ImageJ プログラムの配布が必要です。その多数の事前インストールされているプラグインと複数の撮像実験で演算を実行することができます簡単に更新建築は、ImageJ のこの配布をお勧めします。

1. フィジー プログラム (http://fiji.sc/Downloads) をインストールします。
2. 得られたデータセットを読み込みます。
3. 関心と 2ⁿ (256 x 256、128 × 128、64 × 64) のピクセル サイズに複製の頂または基底細胞膜表面領域を識別します。「メニュー: イメージ > 複製...」
4. 関心のあるトリミング領域の平均強度を計算」メニュー: 分析 > 測定」。
5. 背景領域を識別し、キャプチャの細胞表面膜の同じピクセル サイズに複製し、(2ⁿ: 256 x 256、128 × 128、64 × 64)。「メニュー: イメージ > 複製...」
6. 関心のある領域をトリミング バック グラウンドの平均強度を計算します。「メニュー: 分析 > 測定。」
7. 関心の領域を含む画像からバック グラウンドの平均強度を減算します。「プロセス > 電卓をイメージ > 減算します"。
8. 自己相関計算を行います。この計算は、メニュー構造に含まれている:「プロセス > 融 > FD 数学」。
   1. FD 数学] ダイアログ ボックス選択: 画像 1: トリミング イメージ名、イメージ 2 相関として操作: トリミング イメージ名の逆変換。
9. 結果の画像をピクセルの合計数で割ることによって正規化します。「メニュー: プロセス > 数学 > 分割...」(すなわち: 64 x 64 ピクセル = 4096)
10. クロップ エリア乗、正規化の平均強度で除して再度正規化します。「メニュー: プロセス > 数学 > 分割...」
    注: これは照度の平均値で 2 回イメージを割ることによって達成することができます。
11. 点広がり関数の直線を描きます。
12. ピーク値を計算する行のプロファイルをプロットします。「メニュー: 分析 > プロファイルを印刷します"。
13. ピーク値 (5.12 の結果) をスプレッドシートに転送することによってビーム領域あたりのクラスターを計算し、次の計算 (Eq 6)。
    

6. ICS データセットの処理をバッチ処理します。

注: 上記のプロトコルで説明する手順を複製するには、フィジー/ImageJ マクロの確立の使用をお勧めします。複数の画像ファイルの一貫性のある迅速分析法画像相関分光分析中に可能になります。

1. ICS プロトコルの各メニュー コマンドを記録することによってマクロ ICS ワークフローを確立します。
   「メニュー: プラグイン > マクロ > レコード..."。
2. マクロを生成する「作成」を選択します。
3. 選択"言語 > IJ1 マクロです"。
4. マクロを保存します。
5. 各関数の演算子にアラームを提供する、マクロのさまざまなステップにダイアログ ボックスを追加します。さらなる処理 (すなわち、トリミングする領域) の前に行われるための適切な選択を可能にするために分析プロセスを一時停止する方法としてもダイアログ ボックス
   1. ダイアログ ボックスのマクロ コード
      タイトル =「ダイアログ ボックスのタイトル」;
      msg =「ダイアログ ボックス/プロトコル手順メッセージ」;
      waitForUser (タイトル、msg);
      注: 追加の効率はフィジー アップデーター (指示 https://imagej.net/BAR) 内バーの更新サイトにサブスクライブすることによって確立できます。これは、「広範に適用されるルーチンのコレクション」 ¹⁴フィジーを提供します。このようなルーチンを 1 つは、検索のピークです。メニュー構造:「バー > データ分析 > 検索ピーク。」このスクリプトは、簡単なポイントのプロファイルのピーク値分布関数の計算の意味を提供します。

7. プロトコル拡張機能: 顕微鏡のビーム領域の計算

注: 顕微鏡の光学的伝達関数により、半径約イメージとしても分子サイズのオブジェクトが表示されます x y 平面で 200-300 nm。ICS プロトコルは、サブの解像度蛍光ビーズに 4-5 の手順に従って、点広がり関数の決定をことができます。具体的には：

1. マウント部分の解像度 (すなわち< 直径 100 nm)、8 に蛍光ビーズの部屋の画像スライド。
2. ICS 実験利用共焦点顕微鏡を用いた説明プロトコルに従ってイメージのビーズ。
3. プロトコル手順 5.1 5.13 に従って結果のイメージから ICS 関数を計算します。
4. 印刷のプロファイルから全幅は ICS 機能の半分の最大値としてビーム半径 (r) を計算します。
5. (Eq 7) としてビーム領域 (BA) を計算します。

8 単位面積あたりのクラスター数のプロトコル拡張機能: 計算

1. (Eq 8) として単位面積あたりクラスター密度 (CD) を計算します。
   
   
2. ビーム (7.5 の結果) の面積でビーム面積 (5.13 の結果) クラスターを分割します。

結果

成功画像相関分光実験は治療コントロールの適切なアプリケーションに依存です。これらの試験治療グループにはない一次抗体、二次抗体治療グループはありません、蛍光性の検討。共焦点レーザーの最適な設定は実験のために、一度は、イメージを非特異蛍光サンプル内の欠如を確認するこれらのコントロール グループのキャプチャします。多く付着性がん細胞株の ICS に適した領域の同定は、平らな面の不足によって制限されます。これは、1 つの共焦点画像の複数の癌細胞の広い視野をキャプチャする能力によって補償されています。これは、試験治療グループ間の統計上の比較を実行する必要なサンプリングを生成する機能を提供します。

代表的な実験の結果, A431 EGFR 陽性表皮細胞、100ng/ml egfr 遺伝子のクラスタ リングを誘導するために室温で 10 分間の EGF を配位子と刺激を受けました。ICS の分析の両方の EGF 刺激 (図 1...

ディスカッション

このプロトコルで説明されている画像相関分光法 (ICS) の技術は、特殊な検出器を必要とせず標準的な共焦点顕微鏡を使用します。記載されている ICS 技術は、増加の統計分析のために複数の治療条件の急速なサンプリングを提供する老舗の各種メソッドを利用しています。この方法論は、蛍光などの共焦点ボリュームを介して拡散モバイル分子蛍光揺らぎの相関に基づく代替単一分子技術と比較して絶対的な精度のわずかな減少で相関分光法 (FCS)¹⁵。専門的な FCS アプローチも高感度フォトンカウンティング アバランシェ フォト ダイオード (APD) などの検出器または標準共器で日常的に利用可能ではない専用の特殊なソフトウェアと共に GaAsP 探知機が必要です。ICS の精度の包括的な分析は、この手法はクラスターの数を正確に測定できます決定、> 1 の粒子ビーム焦点レーザースキャニング顕微鏡⁷の内にあります。

適切な蛍光画像のコレクションは成功した ICS 分析のため非常に重要です。関心領域必要がありますレ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Nunc Lab-Tek II チャンバーカバーグラス - 8 ウェル	ThermoFisher Scientific	155409
DPBS、カルシウム、マグネシウムなし	ThermoFisher Scientific	14190144
TrypLE Express Enzyme (1x)、フェノールレッドなし	ThermoFisher Scientific	12604021
ペニシリン-ストレプトマイシン (10,000 U/mL)	ThermoFisher Scientific	15140122
GlutaMAX Supplement	ThermoFisher Scientific	35050061
ヤギ抗ヒトIgG(H + L)交差吸着二次抗体、Alexa Fluor 488	ThermoFisher Scientific	A11013
TetraSpeck Fluorescent Microsphere Standards 0.1µm	サーモフィッシャーサイエンティフィック	T7279
セツキシマブ	メルク セローノ	3023715501
パラフィルム M 38mx100mm	メルク ミリポア	BRND701605
16% パラホルムアルデヒド (ホルムアルデヒド) 水溶液	ProSciTech	C004
組換えヒト EGF	R&Dシステム	236-EG