In vitro血管芽腫 (HBs) と HBs におけるその役割の古典的な腫瘍血管新生が存在するかどうかを評価する包括的な手順を提案します。結果は、HB 血管新生の複雑さを強調表示し、血管新生のこの共通の形態の HB 血管新生における補完機構のみが示唆されました。
このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。
この記事について
サマリー
要約
・ フォン ・ ヒッペル-リンダウ (VHL) 癌抑制遺伝子の不活化は、人間の中枢神経系 (CNS) 内血管芽腫 (HBs) の開発で重要な役割を果たしています。しかし、細胞の起源と HBs (新生血管を含む) の進化の過程の両方残る物議を醸す、VHL HBs、古典的な HB 新生に基づいての抗血管新生が臨床試験で残念な結果を生成しました。抗血管内治療の臨床成功の翻訳 1 つの主要な障害は、この血管豊富な腫瘍血管新生の徹底的な理解の欠如です。この記事では体外でHBs に於いての役割と同様、HBs、古典的な腫瘍血管新生が存在するかどうかを評価する包括的な手順を提案する.この手順で研究者は正確に HB 血管新生の複雑さを理解し、HBs で血管新生のこの一般的な形式の関数を識別できます。これらのプロトコルは、腫瘍の治療のため、または HBs 抗血管新生治療の最適化で将来の翻訳を支援する並進可能性が高い腫瘍については、最も有望な抗血管治療の評価に使用できます。結果は、HB の血管新生の複雑さを強調表示し、この一般的なフォームの血管新生が HB 血管新生の補完機構のみであることを示唆します。
概要
血管芽腫 (HBs) は、人間の中枢神経系 (CNS) にのみ見られる血管腫です。フォン ・ ヒッペル-リンダウ (VHL) 病や散発的な病変の患者で開発します。VHL HBs は頻繁に再発のため外科的治療によって治癒が困難とこれに起因する遺伝的多発障害1。VHL 癌抑制遺伝子の不活化は、VHL HBs の腫瘍の根本的な原因と考えられている、(新生血管を含む) 細胞の起源と HBs の進化プロセスのまま大きく物議を醸す2です。したがって、HB 新生血管生物学的メカニズムの理解は、VHL HBs の最も有望な抗血管戦略に有用な洞察を提供可能性があります。
最近の研究では、HB 新生血管が発生学的血管3,4、5と似ていることを示唆しています。古典的な血管内皮増殖因子 (VEGF)-を介した血管新生血管の内皮細胞に由来する、関数の VHL の損失によって牽引されて増殖し、新生血管形成されている6に挑戦します。1965 年 Cancilla とジマーマンは、HBs の由来内皮7電子顕微鏡を使用してください。その....
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
プロトコル
このメソッドは、承認されたガイドラインや研究倫理委員会の華山病院、復旦大学の規則に従い行った。対応する標準的な安全対策は、各ステップで続いていた。図式、図 1を参照してください。
1. 細胞培養とプラスミド構築
- 定期的に管理ダルベッコでひと臍帯静脈内皮細胞 (株) のイーグル培地 (DMEM) 10% 牛胎児血清 (FBS)、100 単位/ml ペニシリン、ストレプトマイシン加湿の 5% の 100 μ g/mL と補われる、変更された CO2インキュベーター37 ° C で
- ShRNA フラグメントの合成の ApaI と EcoRI PLKO.1 プラスミドを消化します。VHL shRNA ベクターのオリゴヌクレオチドのシーケンスが CCGGGATCTGGAAGACCACCCAAATCTCGAGA TTTGGGTGGTCTTCCAGATCTTTTTG14であることを確認します。
- オリゴ、逆オリゴの 5 μ L、NEB バッファー x 10 の 5 μ L、ddH2O 一緒に (総容積は 50 μ L) の 35 μ L の 5 μ L 前方で、20 の µΜ システムを混ぜます。数時間で 4 分、ゆっくりと室温まで冷却 98 ° C で混合物を加熱します。
- 一晩焼なまし ....
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
結果
元の画像は倒立顕微鏡で撮影しました。コントロール グループと VHL グループの典型的なイメージは、図 2に示す-A1および図 2-A2。コントロール グループの発芽の長さは VHL グループのより短いです。
画像をアップロードした後は、オンラインのプラットフォームは、分析結果を直接提供します。出力は、2 つの部分で構成されています: 処理された画像と対応する解析結果。コントロール グループと VHL 遺伝子の沈黙グループの加工画像が異なる色でマークされます (図 2-A3と図 2-A4
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
ディスカッション
最近では、血管生物学の研究の複数のフィールドが血管内皮15の研究によって刺激されました。この記事での新規候補分子を識別するために操作の血管内皮細胞における機能の VHL 遺伝子の損失に起因する血管の形成を研究する実験モデルとして技術を発芽内皮細胞スフェロイドを開発した、血管新生のカスケード。我々 の知る限り、これは天体の変更された血管内皮細胞の血管新生効果を検討する最初の報告です。
組織 (腫瘍組織を含む) の血管新生は開発時にだけでなく、両方の生理学的および病理学的条件12,15 を介して血管新生と vasculogenic メカニズムで発生する複雑な過程,16. 発芽アッセイ回転楕円体、イベント17,18、発芽の.......
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
開示事項
著者が明らかに何もありません。
謝辞
この作品は、上海科学委員会、技術 (15411951800、15410723200) からの助成金によって支えられました。著者教授 YuMei 温とその技術支援復旦の病原微生物部大学教授・ チャオ趙を感謝したいです。
....アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| ヒト臍帯静脈内皮細胞 | 復旦IBS細胞 | センターFDCC-HXN180 | |
| ダルベッコ'修正されたイーグル」s ミディアム | ギブコ | 11995040 | |
| ウシ胎児血清 | ギブコ | ||
| PLKO.1-puroベクター | Addgene | #8453 | |
| 充填プラスミド psPAX2 | Addgene | #12260 | |
| エンベローププラスミド pMD2.G | Addgene | #12259 | |
| 3D 丸底 96 ウェルプレート | S-Bio | MS-9096M | |
| matrigel | BD Biosciences | 354234 | |
| Opti-MEM medium | Gibco | 31985-070 | reduced serum medium |
| 15ウェルプレート | Ibidi | 81501 | ゲル内の気泡は、μ–インキュベーター内で使用する前に血管新生をスライドさせる オーバーナイト |
| 内皮細胞増殖サプリメント | Sciencell | #1052 | |
| 10-cm 培養皿 | Corning | Scipu000813 | |
| ピュロマイシン | Gibco | A1113802 | |
| typsin-EDTA | Gibco | 25200056 | |
| Automated Cell Counter System | BioTech | ||
| 画像解析ソフトウェア | ウィンマシス | http://mywim.wimasis.com |
参考文献
- Lonser, R. R., et al. von Hippel-Lindau disease. Lancet. 361 (9374), 2059-2067 (2003).
- Hussein, M. R. Central nervous system capillary haemangioblastoma: the pathologist's viewpoint. Int J Exp Pathol. 88 (5), 311-324 (2007).
- Ma, D., et al.
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
再版と許可
