発芽アッセイ回転楕円体を使用して推定される芽新生体外パフォーマンスを評価する包括的な手順

Summary

In vitro血管芽腫 (HBs) と HBs におけるその役割の古典的な腫瘍血管新生が存在するかどうかを評価する包括的な手順を提案します。結果は、HB 血管新生の複雑さを強調表示し、血管新生のこの共通の形態の HB 血管新生における補完機構のみが示唆されました。

Abstract

・ フォン ・ ヒッペル-リンダウ (VHL) 癌抑制遺伝子の不活化は、人間の中枢神経系 (CNS) 内血管芽腫 (HBs) の開発で重要な役割を果たしています。しかし、細胞の起源と HBs (新生血管を含む) の進化の過程の両方残る物議を醸す、VHL HBs、古典的な HB 新生に基づいての抗血管新生が臨床試験で残念な結果を生成しました。抗血管内治療の臨床成功の翻訳 1 つの主要な障害は、この血管豊富な腫瘍血管新生の徹底的な理解の欠如です。この記事では体外でHBs に於いての役割と同様、HBs、古典的な腫瘍血管新生が存在するかどうかを評価する包括的な手順を提案する.この手順で研究者は正確に HB 血管新生の複雑さを理解し、HBs で血管新生のこの一般的な形式の関数を識別できます。これらのプロトコルは、腫瘍の治療のため、または HBs 抗血管新生治療の最適化で将来の翻訳を支援する並進可能性が高い腫瘍については、最も有望な抗血管治療の評価に使用できます。結果は、HB の血管新生の複雑さを強調表示し、この一般的なフォームの血管新生が HB 血管新生の補完機構のみであることを示唆します。

Introduction

血管芽腫 (HBs) は、人間の中枢神経系 (CNS) にのみ見られる血管腫です。フォン ・ ヒッペル-リンダウ (VHL) 病や散発的な病変の患者で開発します。VHL HBs は頻繁に再発のため外科的治療によって治癒が困難とこれに起因する遺伝的多発障害¹。VHL 癌抑制遺伝子の不活化は、VHL HBs の腫瘍の根本的な原因と考えられている、(新生血管を含む) 細胞の起源と HBs の進化プロセスのまま大きく物議を醸す²です。したがって、HB 新生血管生物学的メカニズムの理解は、VHL HBs の最も有望な抗血管戦略に有用な洞察を提供可能性があります。

最近の研究では、HB 新生血管が発生学的血管^3,4、5と似ていることを示唆しています。古典的な血管内皮増殖因子 (VEGF)-を介した血管新生血管の内皮細胞に由来する、関数の VHL の損失によって牽引されて増殖し、新生血管形成されている⁶に挑戦します。1965 年 Cancilla とジマーマンは、HBs の由来内皮⁷電子顕微鏡を使用してください。その後、間質細胞由来 vasoformative エレメント⁸それが見つかりました。1982 年、Jurcoらは間質細胞が内皮細胞起源⁹あることを発見しました。したがって、我々 の仮説ひと血管内皮細胞が HB 血管新生¹⁰の元の細胞であります。VHL 患者手術から派生した HB 細胞の初代培養を使用することをお勧め、HB からプライマリ カルチャが、安定しない、細胞株の確立された³できませんでした私たちの以前の研究が示されます。また、HB 血管成分^10,11の前駆細胞が含まれているために、3 D 環境で初代培養は HB 新生血管の細胞起源を識別できませんでした。したがって、プリミティブと古典的な血管内皮細胞のモデルとしてひと血管内皮細胞 (株) は、HBs の細胞の代替モデルとして役立つことができます。

回転楕円体の発芽アッセイは、組織工学^12,13の新しいモデルです。本稿で、3 D コラーゲン ベース共システムの in vitroアッセイを発芽回転楕円体を使用して、開発された HBs に於いての役割と同様、HBs、古典的な腫瘍血管新生が存在するかどうかを評価するための全体的な目標を持つ。

Protocol

このメソッドは、承認されたガイドラインや研究倫理委員会の華山病院、復旦大学の規則に従い行った。対応する標準的な安全対策は、各ステップで続いていた。図式、図 1を参照してください。

1. 細胞培養とプラスミド構築

1. 定期的に管理ダルベッコでひと臍帯静脈内皮細胞 (株) のイーグル培地 (DMEM) 10% 牛胎児血清 (FBS)、100 単位/ml ペニシリン、ストレプトマイシン加湿の 5% の 100 μ g/mL と補われる、変更された CO₂インキュベーター37 ° C で
2. ShRNA フラグメントの合成の ApaI と EcoRI PLKO.1 プラスミドを消化します。VHL shRNA ベクターのオリゴヌクレオチドのシーケンスが CCGGGATCTGGAAGACCACCCAAATCTCGAGA TTTGGGTGGTCTTCCAGATCTTTTTG¹⁴であることを確認します。
3. オリゴ、逆オリゴの 5 μ L、NEB バッファー x 10 の 5 μ L、ddH₂O 一緒に (総容積は 50 μ L) の 35 μ L の 5 μ L 前方で、20 の µΜ システムを混ぜます。数時間で 4 分、ゆっくりと室温まで冷却 98 ° C で混合物を加熱します。
4. 一晩焼なまし oligos と一緒に 4 ° C で T4 リガーゼ PLKO.1 プラスミドを縛る。16 時間後、25 μ L の有能な DH5α セルに結紮ミックスの 5 μ L を追加します。正常に結紮プラスミドをスクリーンし、シーケンスによって挿入されたフラグメントを確認します。

2. レンチ ウイルス パッケージと感染症

1. 合計では、PLKO.1 shVHL または PLKO.1 shScramble のベクトルの 10 μ g、プラスミド psPAX2 のパッキングの 7.5 μ g、500 μ L の 25 分のためのウシ胎児血清 (FBS) なし DMEM メディアで封筒プラスミド pMD2.G の 2.5 μ g を混ぜます。
2. FBS なし 7 mLDMEM を上記準備ソリューションに追加します。
3. 直径 10 cm のティッシュの培養皿で FBS なし DMEM 293 FT 細胞。293 FT 細胞数が 1 × 10⁷セルのカウンターを使用してであることを確認します。
4. 293 FT 細胞の培地に transfection のため上記準備溶液 1 mL を追加します。
   注:293 FT 細胞ラインは、293 f 細胞ラインから派生し、安定 SV40 大きい T の抗原を表現します。そのため、レンチ ウイルスの生産のための適したホストです。
5. 10% を含む DMEM 培に置き換える 6 h 後 FBS。
6. トランスフェクション後 48 h でピペットを使用してメディアを収集します。
   注:10% を含む DMEM にウイルスが存在する政府短期証券。死んだ細胞は、培地を浮遊します。0.45 μ m の無菌膜を使用すると、死んだ細胞や不純物をフィルター処理します。一般的に、感染症 (MOI) の多様性をチェックする必要はありません。これは、安定した細胞ラインを確立することです。最後のステップで成功の感染なしすべての生きている細胞は、ピューロマイシンによって死んでしまいます。ShScramble グループと血管内皮細胞は、コントロール グループです。すべての血管内皮細胞が 72 h で使用されるピューロマイシン濃度と死ぬことを確認します。同じ数のセルをすべてきちんと備えています。
7. 72 h のレンチ ウイルスのメディアで血管内皮細胞を培養します。ピューロマイシンを対照群として治療なし 24 時間使用血管内皮細胞の 2 μ G/ml の濃度で血管内皮細胞のメディアに追加します。この時点でセルは死に、コントロールを確認します。
   注:生きている細胞は、VHL ノックダウン細胞と shSramble 細胞の安定したセルラインを表します。メッキ密度で 5,000/ウェルの 96 ウェル プレートであります。

3. 血管内皮細胞スフェロイドの世代

1. Huvec 細胞を trypsinize し、10 %dmem 培地で再懸濁します FBS。10 cm 培養皿の細胞の中程度で、typsin EDTA の 1 mL を追加します。
2. 1 × 10³細胞/ウェルの細胞密度で、3 D の丸底 96 ウェル プレートで細胞を播きます。まあ回転楕円体を停止する 0.50 μ L の回転楕円体を収容することができますそれを使用します。製造元の指示に従って細胞カウンター システムを用いた細胞を数えます。
3. 37 ° C で 5% CO₂連続 72 時間のセルを孵化させなさい。これらの条件の下で浮遊細胞は自動的に細胞スフェロイドを形成することを確認します。36 時間後培地の半分を交換してください。

4.体外血管新生アッセイ

1. 4 ° C でゲル溶液を解凍し、減らされた血清培地で希釈比が 1:5 で割りますと。
2. マイクロ ピペットを DMEM 培地から回転楕円体を吸います。減少血清培地 5 mL の回転楕円体を洗浄した後希釈のゲルで、ゆっくりと慎重に、回転楕円体を中止すること。空気の泡がないことを確認します。
3. 15 ウェル プレートに 300 μ L の混合液を埋め込みます。37 ° C と 1 h の 5% CO₂で潜伏後 400 μ L 減少血清培地を各ウェルに追加します。滅菌水を蒸発を妨げる加湿環境を生成する井戸の周りをご記入ください。
4. その後、文化で 37 ° C 1 時間の湿度 100% で 5% CO₂プレート。
5. 慎重に古い培地を吸引し、各ウェルで内皮細胞成長サプリメントで 1% 減少血清中の 600 μ L で置き換えます。
6. 倒立顕微鏡下で撮影後 12 h、24 h (40 *)。

5. データの解析

1. スプラウト長さデータ (資材表) を取得するオンライン画像解析プラットフォームに画像をアップロードします。
2. Web ページ、メールでアカウントを作成します。
3. [アップロード] ボタンをクリックして画像をアップロードします。
4. ダウンロード ボタンをクリックして結果をダウンロードします。
   注:ソフトウェアは、処理後の画像とデータが生成されます。データに 5 つの部分が含まれている: 累積的な芽の長さ、平均スプラウト長さスプラウト長さ、スプラウト領域と回転楕円体領域の標準偏差。処理後の画像の識別を容易にする別の色では、処理後の画像の各パラメーターの輪郭が表示されたら: 赤い表すもやしスケルトン、芽数を黄色、青い芽構造、白芽エンドとオレンジ回転楕円体。

Results

元の画像は倒立顕微鏡で撮影しました。コントロール グループと VHL グループの典型的なイメージは、図 2に示す-A1および図 2-A2。コントロール グループの発芽の長さは VHL グループのより短いです。

画像をアップロードした後は、オンラインのプラットフォームは、分析結果を直接提供します。出力は、2 つの部分で構成されています: 処理された画像と対応する解析結果。コントロール グループと VHL 遺伝子の沈黙グループの加工画像が異なる色でマークされます (図 2-A3と図 2-A4

Discussion

最近では、血管生物学の研究の複数のフィールドが血管内皮¹⁵の研究によって刺激されました。この記事での新規候補分子を識別するために操作の血管内皮細胞における機能の VHL 遺伝子の損失に起因する血管の形成を研究する実験モデルとして技術を発芽内皮細胞スフェロイドを開発した、血管新生のカスケード。我々 の知る限り、これは天体の変更された血管内皮細胞の血管新生効果を検討する最初の報告です。

組織 (腫瘍組織を含む) の血管新生は開発時にだけでなく、両方の生理学的および病理学的条件^12,15 を介して血管新生と vasculogenic メカニズムで発生する複雑な過程^,16. 発芽アッセイ回転楕円体、イベント^17,18、発芽の...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ヒト臍帯静脈内皮細胞	復旦IBS細胞	センターFDCC-HXN180
ダルベッコ'修正されたイーグル」s ミディアム	ギブコ	11995040
ウシ胎児血清	ギブコ
PLKO.1-puroベクター	Addgene	#8453
充填プラスミド psPAX2	Addgene	#12260
エンベローププラスミド pMD2.G	Addgene	#12259
3D 丸底 96 ウェルプレート	S-Bio	MS-9096M
matrigel	BD Biosciences	354234
Opti-MEM medium	Gibco	31985-070	reduced serum medium
15ウェルプレート	Ibidi	81501	ゲル内の気泡は、μ–インキュベーター内で使用する前に血管新生をスライドさせる オーバーナイト
内皮細胞増殖サプリメント	Sciencell	#1052
10-cm 培養皿	Corning	Scipu000813
ピュロマイシン	Gibco	A1113802
typsin-EDTA	Gibco	25200056
Automated Cell Counter System	BioTech
画像解析ソフトウェア	ウィンマシス		http://mywim.wimasis.com