マウス単球由来樹状細胞とその後続の in Vitro活性化腫瘍免疫複合体との隔離のプロトコル

Summary

単球由来 DC (研) は危険性関連分子のマイナーな量を感じることができるし、簡単にプライミング、したがって。血液、腫瘍、彼らの早期活性化を避けるために考慮すべき重要注意事項を強調しながら免疫複合体とその活性化から研の隔離のための詳しいプロトコルを提供します。

Abstract

樹状細胞 (DC) が、細胞膜マーカー、移行パターン分布と抗原提示、T 細胞活性化能力で異なる異種細胞集団です。実験腫瘍モデルのほとんどの予防接種は、DC の数百万人を必要とするので、彼らは広く骨髄や脾臓から分離されます。ただし、これらの DC は免疫複合体 (IC) に、おそらく他の Syk 結合レクチン受容体に血および腫瘍 DC の応答から大きく異なります。重要なは、危険準の分子に DC の感度を与え、また内毒素や手順を特定の 1 つの架橋活性化受容体抗体の存在が DC のプライミングにおける結果し、パラメーター影響を及ぼします少なくとも投与量は、それらをアクティブにする必要があります。したがって、ここでは血液・腫瘍からの早期活性化を回避しながら研を分離するための詳しいプロトコルを記述します。さらに、腫瘍 IC、研の活性化とそれに続く分析のためのプロトコルが提供されます。

Introduction

彼らの発見以来、樹状細胞 (DC) は、T 細胞分化¹をスキューするユニークな能力のための広範な研究の焦点をされています。過去数十年にわたって広範な研究努力は腫瘍の進行および免疫²中様々 な DC サブセットとその機能の定義を求めています。パターン認識受容体、組織分布の異なる異種細胞集団から成る Dc や渡り鳥と抗原提示機能^3,4,5。他の DC サブセットに比べると、単球由来 DC (研) がはるかに多い腫瘍で、循環から簡単に生成することができますまたは腫瘍浸潤単球^6,7。したがって、彼らの相対的な感染率の活用を求めている多くの臨床試験は、T 細胞免疫^8,9を引き出す自己研の体内と体外の操作に基づいています。

同様に、実験的腫瘍モデルの DC ベースの予防接種が必要です 2-3 シリアル注射、離れて 1-2 × 10 の 5-7 日間⁶アクティブ DC パルスと腫瘍抗原。したがって、DC のこの大規模な数を達成するためにほとんどのマウスの研究が主に研 (IL-4 マウスの設定不要) 7-9 日間 GM-CSF の骨髄 (BM) 前駆体から培養を使用^10,11。それにもかかわらず、全体的に通常 DC コンパートメント^12,13マウスが GM-CSF knockout を与えられ、その文化から得られた混合集団を与えられた¹⁴これらの DC の生理学的な関連性を質問に呼ばれてきた。

また、DC は、脾臓細胞から日常的に分離することが。ただし、DC 構成は約 0.3 0.8% (約 7 × 10⁵ DC/脾臓の結果)、合計の脾細胞と CD103 のみ、これらの細胞の⁺ DC と研戻るリンパ器官に移行できます。MoDCs 脾 DC 集団^15,16の約 10-15% を構成する、のでほとんどの隔離のプロトコルは約 1 × 10⁵研脾臓あたりをもたらします。研の拡大は、GM-CSF、脾研¹⁷100 増加を分泌する transfected の B16 細胞を注入することにより実現できます。しかし、研の DC ワクチンを開発するための使用は限られた人間で得られたこの手順が行われることはできませんので研は既に高度に活性化します。

DC の十分な番号を取得、に加えて自家癌細胞に対して効果的な DC ワクチンの開発の別の課題は、完全に DC をアクティブに腫瘍の設定で十分な危険信号の不足を含みます。共刺激シグナルの誘導は通常パターン認識受容体 (PRR)、または c 型レクチン シグナリング細道^18,19,20,21の活性化を介して実現されます。DC の活性化のためのさらなるアプローチは、表面 Fcγ 受容体 (FcγR) との相互作用によって抗原を取る能力を悪用します。確かに、重要な写本の多くを示している予防的設定で、腫瘍の増殖を防ぐことができます BM 前駆体の活性化から研の注入腫瘍-IgG ・ IC と確立された腫瘍^22,23の撲滅につながることができます.

2 つの最近の論文で、 Carmi らは、腎不全、脾 DC とは対照的血と腫瘍から研に応答できません IgG IC 追加刺激のないを発見しました。FcγR^24,25をシグナル伝達を調節するチロシン脱燐酸化酵素の高い細胞内レベルの存在に起因するとこれが見つかりました。、DC の重要なチェックポイントの定義によっては、この作品は成功した DC ベースの予防接種についての重要な洞察を提供しました。FcγR シグナル伝達とおそらく同様のリン酸化カスケードを利用した他のレクチン受容体から信号を有効にする追加の刺激のための要件はこうして分離中に DC のプライミングを回避する必要性を強調します。

したがって、この議定書は研の血および骨髄および脾臓 DC から著しく異なる、腫瘍からの隔離を記述する、プロセス中に検討に値するの注意を強調します。

Protocol

以下のプロトコル、マウス、研の分離を参照してください、まだ DC サブセット、他の細胞と同様に全体的な原則があります。12-16 週齢の c57bl/6 j マウスは実験動物ケアの認定-認定動物施設協会で維持されました。すべてのプロトコルは、スタンフォード大学、テルアビブ大学機関動物ケアおよび使用委員会によって承認されました。

1. 腫瘍の分離は、単球由来の DC を関連付けられています。

1. 層流フードの CO₂安楽死させたマウスから腫瘍を取り外し、ウシ胎児血清 (FBS) なし RPMI 培地で腫瘍。
   注: マウスを剃るし、毛皮からの潜在的な汚染を最小限に抑えるため、腫瘍を削除する前にそれらの 70% エタノール スプレーそれ勧めします。大きい腫瘍が壊れ、細胞死を受けることになりやすい傾向がありますが少ない DC を持っているので、腫瘍が 25-40 mm²を超えていないことを確信します。DC の大きな数字が必要な場合各マウスは複数のサイトでの腫瘍細胞を注入することができます。
2. 滅菌の層流フードの下で小さな断片 (約 1 × 1 mm²) に外科はさみを使用して腫瘍を切る。
   1. 追加 30 mL 滅菌平底チューブに電磁攪拌バーとハンクの 5 mL が含まれている 1 つのマウスからのすべての腫瘍片平衡塩溶液 (HBSS)、2 mg/mL コラゲナーゼ IV、および 0.01 mg/mL DNase 私。
      注意: 骨髄細胞は定常状態下でも、糖鎖を通してエネルギーを作り出します。したがって、10-15 分ほどのグルコース飢餓として (例えば HBSS、RPMI、および DMEM)、グルコースが含まれているメディアだけを使用は細胞死と 24 時間使用のみ低エンドトキシン コラゲナーゼ IV コラゲナーゼとしてグラム陽性によって生成される内アポトーシスになります細菌 (クロストリジウム histolyticum)。
3. 20-30 分のマグネチックスターラー 37 ^oC のインキュベーターで約 200-400 rpm で攪拌します。
4. 完全なメディアの 5 mL を追加し、精力的に再停止します。
5. 70 μ m 携帯こし器を通って細胞をフィルターします。細胞のペレットを 5-10 分の 4 の^oC 400 rcf の遠心分離機します。
   注意: いくつかの腫瘍は壊死、細胞の残骸や細胞外マトリックスの比較的大量を含めると、消化酵素の直後のセルを隔離しようとしないでください。セルのみを取得する 15% 密度勾配媒体にセルを適用します。
6. 1 mL の 10 の x PBS、浸透圧を調整し、100 %percoll 原液を入手すると密度勾配媒体の 9 mL を中断します。ミックス 1.5 mL 密度勾配媒体は 8.5 ml HBSS ソリューションをストックし、腫瘍細胞ペレットを精力的にまぜます。軽くレイヤーの 15% 密度勾配媒体と 400 メーカで室温で 20 分間遠心する上に DMEM の 2 mL。チューブの下部にペレットを形成、細胞培養上清を破棄します。
   1. 10 mL 2 %fbs、1% ペニシリン/ストレプトマイシン、10 mM EDTA (分離バッファー) と 4 ^oC 400 rcf 5-10 分間遠心分離細胞のペレットを含む HBSS に再懸濁し、2 回小球形にされた細胞を洗浄します。
   2. トリパン光学顕微鏡の下で青色を使用して検定上のセルをカウントします。
7. 1 mL 単独で 1 x 10 の⁸セルを再停止バッファーし、4 ^oC を CD11b 30 μ l インキュベートそれら⁺共役 15 分用の磁気ビーズ。
   注意: これは DC をアクティブ化し、細胞死を誘導、CD11c 共役ビーズの使用を避けます。抗 CD16/32 抗体と FcγRII と FcγRIII をブロックしないでください。遮断抗体 FcγR を縛ると MAP キナーゼの強力なリン酸化を誘導して、DC をプライムします。
   1. 4^oc 以上で 5-10 分のための 400 のメーカで分離バッファーと遠心分離細胞の 9 つの mL を追加することによって余分な非連結ビーズを削除します。
8. 上清を吸引し、再 1 mL 分離バッファー内セルを中断します。洗ってある磁気列にセルを適用します。3 mL の分離バッファーで 2 回コラムを洗浄します。
   1. 磁石から列を削除します。分離バッファー列に 6 mL のピペット、プランジャーを押すことにより滅菌採取管に磁気標識細胞を洗い流します。4 ^oc 以上で 5-10 分のための 400 の rcf の遠心分離機セル
   2. 再 1 x 10 の⁷セルあたり 100 μ L でセルを中断し、次の蛍光色素標識された抗体で染色: Ly-6 C、MHCII 家系の負 (TCRb、シグ F、B220、CD19、FceRI、Ly6G)。
9. ゲート側方散乱 (SSC) を使用して、小さなセルでセルを並べ替えるし、散布 (FSC) と完全な培 5 ng/ml の GM-CSF の文化を転送します。3 7 1 時間インキュベート細胞^oC プレートを遵守するマクロファージを可能にするため。その後、転送、疎と新しい培養皿に非付着性のセル。
   注: マウス研 CD11b として定義されます⁺/CD11c⁺/MHCII^こんにちは/Ly6C^{lo/int 7,26,27}。腫瘍モデルとは一部のモデル (例えば LMP) で Ly6C の表現が大幅に異なる場合があります MoDCs は、完全に Ly6C 式を欠いています。全体的に、1 つ 100 mm³ B16F10 腫瘍が 5 x 10⁴ 10⁶合計セル x 約 4-5 の結果、DC の通常含まれています。これらの細胞の 10-15% が免疫細胞と 8-10%、研。DC の数の増加は、複数のサイトでの腫瘍マウスを注入することにより実現できます。並べ替えのみ小型の SSC/FCS の細胞、その他の骨髄性細胞として CD11c や Ly6C などのマーカーを表現できます。
   オプション: 並べ替えエクスプレス Ly6C^{こんにちは}MHCII の否定的な小型の SSC/FSC 細胞として腫瘍浸潤単球。その後、単球の in vitro DC を取得する 50 ng/mL GM-CSF と文化します。

2. 末梢血単球由来の DC の分離

注: 成熟した MoDCs マウス血液中比較的まれであるので、以下のプロトコルはその派生の in vitro並べ替えられた単球からです。

1. 血の単球の増加、4% イソフルランとマウスを麻酔し、それらを皮下注入 (サウスカロライナ) 50 μ L の PBS の GM-CSF の 1 μ g とします。
2. 1-2 時間後 CO₂を用いたマウスを犠牲に。
   注意: を犠牲にしないマウス頚部転位によって内部の出血の原因になります。
3. Euthanization の直後にマウスを 70% エタノール スプレーし、滅菌の層流フードの下の外科はさみを使用して心臓を覆う皮膚を削除します。エタノールが付いているはさみをきれいにし、心臓の右心房を切る。ゆっくりと、20 mm EDTA HBSS 10 mL のシリンジ、25 G 針を使用して右心室を介して心をフラッシュします。
   1. ヘパラン硫酸と EDTA を含む生殖不能の管に胸腔内から滅菌注射器で血液を収集します。肝臓と肺になるピンクや白まで心をフラッシュし続けます。
4. 低いブレーキで 15 分間室温で 400 メーカで密度勾配中程遠心分離機に血液を適用します。
   注意: 使用エンドトキシン密度勾配媒体 (通常より小さい 0.12 mL あたり EU)。
   1. 新しい管に単核細胞を収集します。10 mL 2 %fbs、1% ペニシリン/ストレプトマイシンと 10 mM EDTA (分離バッファー)、および 4 ^oで、遠心分離を含む HBSS で再懸濁細胞ペレットに 5-10 分の C 400 メーカによってセルを洗浄してください。
      注意: は、少なくとも 1 g/L ブドウ糖にはが含まれているメディアだけを使用します。
5. CD11b 肯定的な選択のため再中断 1 mL 分離バッファーに 1 x 10 の⁸セルと 4 ^oc 以上での CD11b 共役の磁性体ビーズを 50 μ l 15 分間インキュベートします。
   1. 9 mL の分離バッファーを追加し、培養上清 4 ^oC. 吸引で 5-10 分のための 400 の rcf の遠心分離によって余分なビーズを洗浄し、再 1 mL 分離バッファー内セルを中断します。製造元の指示に従って清ら磁気列にセルを適用します。
   2. 磁石から列を削除、列に分離バッファーの 6 mL のピペット、プランジャーを押すことにより滅菌採取管に磁気標識細胞を洗い流します。3 mL の分離バッファーで 2 回列 4 ^oc. 洗浄で 5-10 分のための 400 のメーカで細胞を遠心分離機します。
   3. 1 x 10⁷セル/100 μ L 分離バッファーと次の蛍光色素標識された抗体で染色の細胞を再停止: 0.1 μ g CD115、0.25 μ g MHCII、および 0.1 μ g Ly-6 C/1 x 10 の⁶セル。
6. 小さな側方散乱 (SSC) および小さい前方散乱 (FSC) 細胞のゲーティング セルを並べ替えます。
   注: マウス炎症性単球は一般的に CD115 として定義⁺/MHCII^{lo/指定、総额}/Ly6C^こんにちはとパトロール中の単球は CD115 として定義されて⁺/MHCII^{lo/指定、総额}/Ly6C^{neg 4, 5}。2 つのサブセットの間の分離が不要の場合、合計 SSC^lo/FCS^lo/CD115⁺/MHCII^loセルを並べ替えることができます。世間知らずと担癌マウスの両方を含む約 5-8 x 10 まで血液 1 mL あたり⁴研 4-5 10⁵研次 x GM-CSF の注入。うち、約 70% の炎症性単球、30% をパトロールしている単球。
7. 20 ng/mL GM-CSF と補われる完全なメディアの 1 x 10⁶セル/ml の濃度で細胞をプレートします。1 日後さらに 4-5 日間新しいプレートと文化に非付着と緩く付着性のセルを転送します。
   注意: DC メディアは、ピルビン酸と補われないする必要があります。

3. 腫瘍 IgG 免疫複合体の作製

1. 完全な DMEM メディアで 70% コンフルエントまでに 75 cm²培養用フラスコで培養腫瘍細胞。
   1. 0.25% トリプシン/過剰 trypsinization を避けるために顕微鏡下で培養フラスコとモニター細胞の形態から細胞をデタッチする EDTA の 2 mL を追加します。
   2. トリプシンの消化力を阻害し、4 ^oC、セルをペレットに 5-10 分の 400 の rcf の遠心分離機に 8 mL の完全培 (トリプシン 2 mL) あたりを追加します。
      注:マイコ プラズマ市販 PCR キットを使用して腫瘍細胞を確認するを確認します。グラム陰性菌とカブトガニ含まライセート(ラル) を使用して菌のエンドトキシンの存在をテスト分析²⁸)。血清を 0.22 μ M で濾過し、9 の連邦規制のコード ウイルスをテストする必要があります。さらに、37 ^oc 以上で 2 日間の文化やスープ、LB 寒天培地に 100-200 μ L をドロップすることによって、培養培地および血清をテストします。
   3. もう一度セルを洗浄再 10 mL の PBS で 400 メーカで 5 ~ 10 分間遠心するそれらを停止することによってトリプシンと血清の遺跡から上清を吸引し、洗浄を 2 回繰り返します。
2. 室温で 10 分間バッファリング 1.8% パラホルムアルデヒドでセルを修正します。
   1. セルを洗浄して再 10 mL の PBS で 4 ^oC 400 メーカで 5-10 分間遠心するそれらを停止することによって。
   2. 吸引清と繰り返し、さらに 2 回を洗ってください。
      オプション: 腫瘍取り込みアッセイ用細胞ラベル付けできますがそれらを 37 ^oC 1 μ M carboxyfluorescein サクシニミジルエステル (CFSE) を含む PBS 中で 5 分間インキュベートし。CFSE は氷で 10 分間の完全なメディアとしてクエンチしました。セルは、残留色素を削除する 2% 血清を含む PBS で広範囲洗浄する必要があります。
3. 再潜在的な非特異的タンパク質間相互作用をブロックするために FACS バッファー (2% の FCS + 5 mM EDTA を添加した PBS) と抗 CD16/32 の 0.5 μ g/mL のセルを中断します。100 μ L あたり 1 x 10 の⁵セルの濃度で U 字型 96年穴/プレートのプレート。
   1. 腫瘍-結合の抗体は 5 μ g ・ 10 の⁵セル × 5 ng/1 からまでの異なる希釈率を追加します。15 〜 20 分のための氷の板を孵化させなさい。
      注: IgG 抗体が説明²⁴としてプロテイン A 列に素朴な 20-24 週齢の雌マウスの血清から分離されました。
4. 150 μ L の PBS を追加し、5-10 分の 4 の^oC 400 メーカでプレートを遠心分離によって細胞を洗浄します。
   1. 培養上清を破棄し、洗濯を 2 回繰り返します。蛍光標識二次抗体を含む 100 μ L FACS バッファー内セルを再停止します。20 分間氷の上プレートを孵化させなさい。
   2. FACS バッファーの 200 μ L を追加し、5 ~ 10 分 400 メーカでプレートを遠心分離によって洗浄細胞培養上清を破棄し、洗浄を繰り返します。
   3. フローサイトメトリーによる腫瘍バインディングを分析し、セルを塗るに必要な最低限の濃度を決定します。
      注: 以降の機能アッセイに増加しない平均蛍光強度 (MFI) による腫瘍細胞の少なくとも 5 倍アイソタイプ コントロール上の抗体を使用しないでください。

4. 腫瘍 IgG IC と研の活性化

1. 3.1 3.4.3 ~ のセクションで説明するように最小の IgG 濃度と腫瘍細胞をコートします。
   1. 腫瘍 IC、研を起動する前に 1 日交換研文化メディアは、GM-CSF が含まれています。これを行うには、優しくメディアを吸引、予め温めておいた完全培地で細胞を洗浄します。
      注: 少なくとも 2-3 時間 (またはも一晩) 並べ替え後完全なメディアの GM-CSF なしと IC でそれらをアクティブ化する前に、隔離された成熟した腫瘍関連研を培養する必要があります。
   2. 腫瘍の取り込み解析 1:5 (IC:MoDC) の割合で研に CFSE 分類腫瘍 IC を追加し、12-16 h 1 × 10⁶ DC あたり完全なメディアの 1 つの mL で一晩インキュベートします。
   3. FACS 解析研活性化実験では、1:1 (IC:MoDC) 比で腫瘍 IC を追加し、12-16 h 一晩インキュベートします。
      注: 強くお勧めも、肯定的な制御を含めるどの研では 1 μ g/ml の LPS または他 TLR アゴニストの刺激。
   4. 次の一晩活性化培養上清を吸引、洗浄細胞 3 回優しく分離バッファーまたは 10 ミリメートルの EDTA HBSS。
   5. プレートから DC を外す、1 mL 10 mM EDTA を含む HBSS で 2 〜 3 分のための細胞を孵化させなさい、積極的なピペッティングにより細胞をデタッチします。
   6. 400 メーカで細胞を遠心し、再 1 × 10⁶ 2% の FCS、5 mM EDTA (FACS バッファー) および遮断抗体の 0.5 μ g を添加した 90 μ L の PBS DC を中断します。氷上で 5-10 分間インキュベートします。
   7. 細胞に抗体の混合物を染色の 10 μ L を追加し、15 分間氷の上を孵化させなさい。
   8. 2 mL FACS バッファーを追加すると、セルと 4 ^oC 400 メーカで 5-10 分間遠心します。
2. 200 μ L FACS バッファー内セルを再停止します。
   1. 追加 0.5 ~ 1 μ g/mL DAPI の解析から死んだ細胞を除外するのには、サンプルを実行する前に 1-2 分。過剰を孵化しないで DAPI、研は 10-15 分以内を取ること。

Results

当初、腫瘍細胞に結合する世間知らずと同種同系マウスからの抗体能力を比較しました。このため、B16F10 LMP 腫瘍細胞はパラホルムアルデヒドで固定され広範囲洗浄します。B16F10 はもともと c57bl/6 マウス肺転移から分離された悪性黒色腫のセルラインです。LMP は KrasG12D から分離した膵腫瘍細胞/+、LSL-Trp53R172H/+、および Pdx 1 Cre マウスと 129F1 マウスで着実に成長します。IC を得るためには、腫瘍細胞あたり 1 x 10⁵腫瘍細胞の同系または同種 IgG の 2 μ g を氷の上に 20 分間培養します。IgG し、IgM 抗体が世間知らずの循環から分離されたタンパク質としてサイズ排除クロマトグラフィーに続いて、20-24 週齢マウスに²⁴が記載されています。細胞が、そこで洗浄・ PE 共役ラット抗マウス IgG 抗体、染色、平均蛍光強度は流れの cytometer で分析しました。図 1 a

Discussion

マウスを予防接種に必要な DC の数が多いを与えられた (10 x 約 2-4⁶ DC ごとに 1 つのマウス)、マウスの戦略は BM とex vivo活性化に続いて脾臓から DC の分離に基づく予防接種のほとんど。ただしアクティブ化腫瘍 DC生体内で、活性化する脾臓と BM DC の同じ条件を使用して、多くの場合、効果的な免疫の生産に成功したとされているしようとします。2 つのそれに続く出版物の Carmiら。チロシン脱燐酸化酵素の自然に高い組み込みレベルの負担及び IC^24,25ライセンス認証前にプライミングを必要とすることを考えるで脾臓と BM DC から血と腫瘍研が大幅異なるを発見しました。また、これらの結果さらにストレス良い活性化状態の DC を維持するために余分な予防措置を講じる必要は、彼らの生理学的状態を反映しています。したがって、腫瘍、循環から研の分離プロセスの詳細な説明を提供して可能性があります彼らの早期活性化の手順を強調する議...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ficoll-Paque PREMIUM	GE-Healthcare	17-5442-02
OptiPrep	StemCell Technologies	07820
CD45 MicroBeads	Miltenyi	130-052-301
EasySep Monocyte Isolation Kit	StemCell Technologies	19861
コラゲナーゼIV	Sigma	C9697-50MG	エンドトキシンの各ロットを検査する
DNase I	Σ	DN25-10MG
HBSS	ThermoFisher	14025092
FBS	ThermoFisher	16140071	エンドトキシンの各ロットを検査
PE-CD11c	バイオレジェンド	117307
APC-CD11b	バイオレジェンド	101211
ブリリアントバイオレット 650 MHCII	バイオレジェンド	107641
AF48- CD86	バイオレジェンド	105017
APC/Cy7-Ly-C6	バイオレジェンド	108423
PE/Cy7-CD15	バイオレジェンド	135523