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方法論記事

高速銀染色プロトコルを有効にする簡単なと非変化のポリアクリルアミドゲルを用いた SSR マーカーの効率的な検出

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DOI：

10.3791/57192

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2018年4月20日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1College of Life Sciences, Guangzhou University, 2Hard Winter Wheat Genetics Research Unit, United States Department of Agriculture - Agricultural Research Service, 3The UWA Institute of Agriculture, University of Western Australia

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

ここで、シンプルかつ低コストのシルバーのみ 3 つの試薬および処理の 7 分を必要とし、遺伝子解析で高品質な SSR データの高速生成に適したプロトコルを汚すを報告します。

要約

簡単なシーケンスを繰り返します (SSR) は、植物や動物の遺伝学的研究と分子育種プログラムで使用する最も効果的なマーカーの 1 つです。銀染色、電気泳動法における SSR マーカーの検出のため広く使用されている方法です。ただし、銀製の汚損のプロトコルを従来は技術的にデマンドが高い、時間がかかるです。他の多くの生物学研究所のようなプロトコルを汚す銀の技術を着実に検出効率を改善するために最適化されています。ここでは、簡略化された銀染色法大幅試薬コストを削減し、検出の解像度と画像の透明度を高めることを報告します。新しいメソッドは非変化のポリアクリルアミドゲルの処理のわずか 7 分と 3 つの試薬 (銀硝酸、水酸化ナトリウム、ホルムアルデヒド) (含浸および開発) 2 つの主要な手順が必要です。以前に報告されたプロトコルと比較して、この新しい方法はより速く、簡単ですし、SSR 検出のため少ない化学試薬を使用します。したがって、このシンプル、低コストで効果的な銀の汚損のプロトコルは遺伝のマップおよび SSR マーカー データの迅速な生成によるマーカー育種法を役立ちます。

概要

Pcr マーカーの開発植物遺伝学、繁殖1の科学革命をもたらしました。単純なシーケンス繰り返し (SSR) マーカーは最も一般的に使用される、最も多目的な DNA マーカーの一つです。彼らのゲノム広いカバレッジ、豊かさ、ゲノムの特異性と再現性は、ヘテロ接合体の遺伝子型2の検出のための優性遺伝に加えて SSR マーカーのメリットの一部です。いくつかの研究は、遺伝的多様性を調査、家系を追跡、遺伝的連鎖地図の構築、経済的に重要な形質の3,の4遺伝子をマップする SSR マーカーを使用しています。

アガロース、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、エチジウム ブロマイドで染色後銀製の汚損または UV 光の下での可視化、SSR マーカーの PCR の製品は通常区切られます。ポリアクリルアミドゲルの DNA のフラグメントの銀製の汚損はその他染色方法5,6より敏感と SSR マーカー7などの DNA 断片を検出するため広く使用されています。

多くの生物学研究所技術のようなポリアクリルアミドゲルの銀製の汚損は着実にその最初されて報告 1979年8のフラグメントの可視化技術として改善します。手法は当初バッサムらによって DNA のフラグメントの検出のために変更されました。6 1991 年 1994 年サングイネッティと同僚9改良と。メソッドは、最後数十年6,7,9,10、11,12,13,の14にさらに最適化されています,15しますただし、これらの更新されたバージョンのプロトコルのほとんどまだこれらのプロトコルの7のアプリケーションを制限するなど技術の需要が高いと長い処理時間固定用マウント6、いくつかの欠点がある。 11。DNA フラグメントの検出の高効率と低コストを組み合わせた最適なプロトコルは、生物学の研究を汚す銀のルーチン用が急務します。

さらに、電気泳動法は、変性と非変性ポリアクリルアミドゲルに分けることが、銀染色法を用いる SSR マーカーの検出のため両方使用できます。効果と解決策は大きく違いはありません、しかし、非変性ポリアクリルアミドゲル処理しやすい少ない時間16。

以前の研究15, に基づいて現在の研究の目的は、最適化された銀の汚損のプロトコルの非変化のポリアクリルアミドゲルの SSR マーカーの検出を迅速、簡単かつ低コストの詳細を記述するためです。

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プロトコル

1. SSR マーカーの PCR の製品の準備

  1. テンプレート DNA を含む PCR の反作用のすべての化学薬品および試薬の準備 (30 ng/μ L)、2 × PCR マスター ミックス (2 × PCR バッファー、各 dNTP、MgCl2、Taq DNA ポリメラーゼと染料の 0.1 U/μ L の 3 mM の 0.4 mM を含む)、それぞれの 10 μ M 前方およびプライマーを逆引き、、蒸留水または脱イオン水 (dH2O)。
    注: 本研究で使用される SSR マーカーだった PT51333 (プライマー シーケンスを転送: 5 '- GCACCTTTGGTTATCCGACA - 3' と逆プライマー シーケンス: 5'- TGCTTTAAGTCATGTACCAAATTGA - 3') と PT50903 (プライマー シーケンスを転送: 5 ' - AAATTTCTTTCGGTGTGATAACTG - 3' と逆プライマー シーケンス: 5'-AGAGACTGCCGTTTGATTTGA-3') タバコと CX 43 (プライマー シーケンスを転送: 5'-TGGGGATGTGAGCTTCTTCT-3' と逆プライマー シーケンス: 5' - AGGGTTCCTTTGGGGTGATA-3') と CX 157 (プライマー シーケンスを転送: 5 '-TCGACGCTGACTTCACTGAC-3 'と逆プライマー シーケンス: 5'- GGACAGCTTCACACATTTGC - 3') 開花白菜の。
  2. テンプレート DNA、dH2O. 2.6 μ L、それぞれ前方のプライマーおよび逆プライマーの 0.2 μ L 2 × PCR マスター ミックスの 5 μ L の 2 μ L の追加によって増幅 PCR ミックスの 10 μ L を準備します。
  3. 94 ° C、5 分の最初のステップとたちの PCR 増幅反応を実行、以下の 45 の 38 サイクル 45 変性 94 ° c s s プライマーのアニーリングのための 55 の ° c との拡張のための 72 ° c 1 分、72 ° で 10 分間の最終拡張ステップC;後で使用のための 4 ° C で PCR の製品を保管してください。

2. 溶液の調製のポリアクリルアミドのゲルの鋳造

  1. 基本トリスと dH2O で 27.5 g ホウ酸の 54 g 溶解、0.5 M の EDTA (pH 8.0) 20 mL を追加して 1, 000 mL dH2o. の最終的なボリュームにソリューションを調整する 5 × TBE バッファーの 1 L を準備します。
    注: TBE バッファーは、ヶ月室温で保存することができます。
  2. DH2O 2 L の最終巻に 200 mL の 5 × TBE バッファーを追加することで 0.5 × TBE バッファーの 2 L を準備し、常温で保存します。
  3. 29 g 分子生物学グレード アクリルアミドと分子生物学グレード N、N 1 g を溶解することにより 6% 非変性ポリアクリルアミド ゲル溶液の準備 '-0.5 × TBE バッファー 500 mL の最終巻に methylenebisacrylamide。アルミ箔と後で使用のための 4 ° C でのストア ソリューション ボトルをカバーします。
    注意: アクリルアミドは強力な神経毒を考慮され、注意して処理する必要があります。粉末とそれを含む処理ソリューションの重量を量るとき常に手袋を着用します。
  4. DH2O 10 mL の最終巻に AP の 2 g を溶解することにより 20% アンモニウムの過硫酸 (APS) 溶液を準備します。ヶ月の-20 ° C で保存できます。
    注: 利便性のため 20 %aps 溶液 10 mL、1.5 mL や 2 mL 遠沈管-20 ° C で保存用検体解凍、使用前によく混ぜます。
  5. 3 μ L の 95% エタノール, 酢酸の 0.5% の 0.997 mL でバインド シランを溶解することにより希釈バインド シラン溶液を調製します。週間の 4 ° C で保存できます。
    注意: バインド シランは有毒である、ソリューションを取り扱うときに手袋を着用する、部屋の換気をしてください。

3. 電気泳動ポリアクリルアミド ゲルの調製

  1. ガラス板と dH2方面の空気と完全な洗浄によって続かれる水道水で洗剤とスペーサーの洗浄セット乾燥プレート物干しラック プレートでそれらを設定します。
  2. 長方形のガラス板で 5 分乾燥の内側の面にバインド シラン溶液 1 mL を分散させます。
    注: バインドしらん溶液がプレートの表面に均一に広がらない、ゲルが戸建染色中になり、不満足な染色効果が発生します。
  3. 綿棒で切欠きを有するガラス板の内側の面に撃退するシランの 1 mL を分散、過剰を撃退するシラン ティッシュ ペーパーでふき取るし、エアーで 5 分間乾燥させます。
    注: 反発シラン処理剤では、ガラス板の表面を均一に塗らない場合、それ部分的ストリッピングによってゲルを損傷があります。
  4. 上では、スペーサーで切欠き平板のガラス板を組み立てる、クランプを鋳造とアセンブリの両方の側面をクランプします。
  5. 1.5 mm 幅 33 センチ × 高さ 10 センチ ・ スペーサー厚さのプレート セットのビーカーに 6% の非変化のポリアクリルアミドゲル ソリューションの適切な量 (40 mL) を注ぎ、テトラメチルエチレンジアミン (TEMED) の 20 μ L と 200 µLfresh 20% 追加 AP、軽く混ぜます。
    注: ゲル溶液の適量 (40 mL) は、スペーサー (30 cm × 8.5 cm × 0.15 センチメートル) の厚さで 2 枚の板の内容積から計算しました。ゲル重合 TEMED と AP の量、TEMED と参照17に基づく AP にゲル溶液の標準的な比率はあります。上記で説明したゲル溶液は 4 ° C で保存されています。ゲル溶液は室温、TEMED の 20 μ L、100 μ L の AP を使用する必要があります 20% に格納されているかどうか。優しくソリューション内の空気の泡を避けるためにガラス棒でゲル溶液の混合物をかき混ぜなさい。
  6. すぐに溶液を注ぐと慎重に切欠き平板の縁に沿って組み立てられたガラス板に上にほとんどスペースを埋める、櫛を挿入します。櫛上ゲル溶液の少量を追加します。
    注: は、ガラス板をゲルの漏れを防ぐために水平に保ちます。必要に応じては、バブルのフックで任意の気泡を削除します。
  7. 室温で 30 分に設定するゲルを許可します。
    注意: 重合のための時間は、ゲル溶液と環境の温度を使って変更できます。
  8. ゲルが完全に重合、鋳造クランプを削除し上部バッファー貯水池へ向いている切欠き平板の電気泳動のタンク ユニットのプレート セットの位置し、タンク ユニットにセットするプレートを取り付けるに鉗子を使用します。
  9. 上部の各 0.5 × TBE バッファーと下側の部屋の 1 L を注ぎなさい。櫛を取り外して、ピペットやスポイトを使用してバッファーのすべての井戸を洗い流してください。
    注意: 必ずゲル サンドイッチ プレートの下部には、任意の気泡なしバッファーでずぶ濡れ。

4. 実行ゲルします。

  1. ポリアクリルアミド ゲルのウェルに PCR の製品の約 1 μ L をロードします。PCR の製品のサンプルと一緒にゲルの両側に DNA のサイズの梯子をロードします。上部バッファー区域に安全カバーを固定します。
  2. 赤は赤と黒を黒に、色分けされた一致する電源にリード線を接続します。染料 〜 70 分の普通の定義された位置に到達するまで、110 V の定電圧でゲルを実行します。
    注: PCR の製品のサイズに応じて電圧と実行時間を調整できます。

5. 銀の汚損のポリアクリルアミド ゲルの SSR マーカーを検出するため

  1. 電気泳動後、大きなビーカー経由でバルブに参院からバッファーを抜きます。デタッチ側クランプし、装置からプレートを削除、慎重にへらで、片側切欠きを有するガラス板を分離、ゲルのまま他のガラス プレートに取り付けがバインド シラン コーティングことを確認します。
  2. DH2O の 900 mL の NaOH の 10 g を溶解してアグノ3 dH2O. 準備 1 L 新鮮な開発ソリューションの 1 l の 1.5 g を溶解することにより新鮮な含浸液の 1 L を作る、37% ホルムアルデヒドの 1 mL を追加、し、dH2o. を使用して 1 L の最終的なボリュームに調整
    注: は、手袋を着用し、上記の化学薬品と注意してソリューションを処理します。暗闇の中、ソリューションおよびソリューションで対応する手順を保持する必要はありません。
  3. 慎重に十分な dH2O 電気泳動バッファーを削除し、プラスチック トレイの上に直面しているゲルでプレートを置き、含浸液の 1 L のゲルが水没するとゲル、ガラス プレートをすすいでください。シェーカーにトレイを置きます。
  4. 3 〜 4 分の 60 r/分でトレイを軽く振る。
    注: 場合によっては、ゲルの厚み、硝酸銀含浸液の濃度によると、揺れ時間調整できます。
  5. 含浸ソリューションからプレートを移動し、別のトレイにそれを置きます。プレートと 3-5 秒ごとに 2 回十分な dH2O を使用してゲルの表面からオフの残留含浸ソリューションをすすいでください。
  6. ゲルの別のトレイの上に上向きでプレートを置き、開発ソリューションの 1 L でプレートが水没し、50 r/分 〜 3 分 DNA のフラグメントのモニターでトレイを軽く振る、DNA の信号の最も高い比率の断片と開発を停止 背景のノイズが観察される (このステップは 〜 3 分かかります)。
  7. プレートと十分な dH2O のゲルを 2 回、リンス、ティッシュ ペーパーでゲル板を乾燥します。
  8. 適切なスキャナーを使用してゲルをスキャンします。300 dpi の解像度では、DNA のフラグメントを明確に可視化を提供します。ゲルは、カメラを使用して撮影することができますも。
  9. SSR マーカーのバンディング パターンは、イメージで DNA のフラグメントに基づいて獲得できます。

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結果

PCR 産物は、開花白菜とタバコで対応する SSR プライマーのペアを使用して作り出されました。後電気泳動ポリアクリルアミドのゲルは、SSR マーカー (図 1) のバンド パターンを明確に検出のプロトコルを汚す上銀を使用して染色された.

異なる銀の汚損のプロトコルの検出効率を比較するためタバコと開花白菜の SSR マーカーの PCR 産物ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分離し、5 公開銀染色などによる可視化プロトコル9,11,12,13,14新しいプロトコル。六つの...

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ディスカッション

含浸後ゲルの洗浄は重要なステップです。不十分な洗浄時間と水の量がプレートと、ゲルの表面に含浸液の不完全な除去を引き起こす、暗い背景に 。適切な現像時間は別の重要なステップは、過剰開発 DNA のフラグメントの低コントラストの画像で暗いブラウン バック グラウンドで結果することができます。さらに、受精のステップは DNA のフラグメントの染色効率を大きく影響します。含浸時間 5 分以上を拡張または含浸液アグノ3量を増やすことでは染色の精度が大きく改善されないがより小さい 3 分か、アグノ3 (の量を減少する時間の削減、含浸< 1 g) 灰色または浅い黒 DNA のフラグメントで結果することができます。

銀染色法の効率的な DNA 検出のための迅速かつ簡単な操作お勧めします。本研究で開発された新しいプロトコルを回避修正、停止していくつかの洗浄のステップ他プロトコル6,9,

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開示事項

著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

謝辞

自然科学基礎の中国広東 (2015A030313500)、地方キー国際協同組合研究プラットフォームと主要な科学研究プロジェクトの広東高等教育 (2015KGJHZ015)、科学によって資金が供給されたこの作品、広東省タバコの独占管理 (201403, 201705)、科学技術学部学生 (201711078001) のためのナショナル ・ イノベーション ・ トレーニング プロジェクト (2016B020201001)、中国の広東省の計画の技術計画。商号またはこの文書での商用製品の言及は固有の情報を提供する目的は、勧告または米国農務省によって承認とは限りません。米国農務省は、機会均等のプロバイダーと雇用者です。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
PCR master mix (Green Taq Mix)Vazyme Biotech Co. Ltd, China#P131-03
50-2000 bp DNA LadderBio-Rad, USA#170-8200
DL500 DNA markerTakara Bio Inc., Japan#3590A
Tris baseSangon Biotech Shanghai, China#77-86-1
Boric acidSangon Biotech Shanghai, China#10043-35-3
EDTA-NA2広州化学試薬工場、中国#6381-92-6
アクリルアミドSangon Biotech 上海、中国#79-06-1
N,N'-メチレン-ビスアクリルアミドSangon Biotech 上海、中国#110-26-9
N,N,N',N'-テトラメチルエチレンジアミンSangon Biotech 上海、中国#110-18-9
過硫酸アンモニウム州化学試薬工場、中国#7727-54-0
Bind-silaneSolarbio 北京、中国#B8150
AgNO3sub>Sinopharm化学試薬北京有限公司、中国#7761-88-8
ホルムアルデヒド天津DaMao化学試薬工場、中国#50-00-0
NaOH広州化学試薬工場、中国#1310-73-2
酢酸広州化学試薬工場、中国#64-19-7
Na2CO3天津大茂化学試薬工場、中国#497-19-8
エタノール広州化学試薬工場、中国#64-17-5
HNO3広州化学試薬工場、中国#7697-37-2
Na2S2O3.5H2OSinopharm化学試薬北京有限公司、中国#10102-17-7
リオクロムブラックT(EBT)天津DaMao化学試薬工場、 中国#1787-61-7
プラスチックトレイ上海Yi Chenプラスチック有限公司、中国TS-1
シェーカーQilinbeter江蘇省、中国-
BenQ M800スキャナーBenQ、中国-
DYY-6C電源北京Liuyi楽器工場、中国-
垂直ゲルシステム全体、JY-SCZFBeijing Tunyi Electrophoresis Co., Ltd, 中国-
広エ

参考文献

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