Method Article

高速銀染色プロトコルを有効にする簡単なと非変化のポリアクリルアミドゲルを用いた SSR マーカーの効率的な検出

DOI:

10.3791/57192

⸱

April 20th, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1College of Life Sciences, Guangzhou University, 2Hard Winter Wheat Genetics Research Unit, United States Department of Agriculture - Agricultural Research Service, 3The UWA Institute of Agriculture, University of Western Australia

In This Article

Summary

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ここで、シンプルかつ低コストのシルバーのみ 3 つの試薬および処理の 7 分を必要とし、遺伝子解析で高品質な SSR データの高速生成に適したプロトコルを汚すを報告します。

Abstract

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簡単なシーケンスを繰り返します (SSR) は、植物や動物の遺伝学的研究と分子育種プログラムで使用する最も効果的なマーカーの 1 つです。銀染色、電気泳動法における SSR マーカーの検出のため広く使用されている方法です。ただし、銀製の汚損のプロトコルを従来は技術的にデマンドが高い、時間がかかるです。他の多くの生物学研究所のようなプロトコルを汚す銀の技術を着実に検出効率を改善するために最適化されています。ここでは、簡略化された銀染色法大幅試薬コストを削減し、検出の解像度と画像の透明度を高めることを報告します。新しいメソッドは非変化のポリアクリルアミドゲルの処理のわずか 7 分と 3 つの試薬 (銀硝酸、水酸化ナトリウム、ホルムアルデヒド) (含浸および開発) 2 つの主要な手順が必要です。以前に報告されたプロトコルと比較して、この新しい方法はより速く、簡単ですし、SSR 検出のため少ない化学試薬を使用します。したがって、このシンプル、低コストで効果的な銀の汚損のプロトコルは遺伝のマップおよび SSR マーカー データの迅速な生成によるマーカー育種法を役立ちます。

Introduction

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Pcr マーカーの開発植物遺伝学、繁殖1の科学革命をもたらしました。単純なシーケンス繰り返し (SSR) マーカーは最も一般的に使用される、最も多目的な DNA マーカーの一つです。彼らのゲノム広いカバレッジ、豊かさ、ゲノムの特異性と再現性は、ヘテロ接合体の遺伝子型2の検出のための優性遺伝に加えて SSR マーカーのメリットの一部です。いくつかの研究は、遺伝的多様性を調査、家系を追跡、遺伝的連鎖地図の構築、経済的に重要な形質の3,の4遺伝子をマップする SSR マーカーを使用しています。

アガロース、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、エチジウム ブロマイドで染色後銀製の汚損または UV 光の下での可視化、SSR マーカーの PCR の製品は通常区切られます。ポリアクリルアミドゲルの DNA のフラグメントの銀製の汚損はその他染色方法5,6より敏感と SSR マーカー7などの DNA 断片を検出するため広く使用されています。

多くの生物学研究所技....

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Protocol

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1. SSR マーカーの PCR の製品の準備

  1. テンプレート DNA を含む PCR の反作用のすべての化学薬品および試薬の準備 (30 ng/μ L)、2 × PCR マスター ミックス (2 × PCR バッファー、各 dNTP、MgCl2、Taq DNA ポリメラーゼと染料の 0.1 U/μ L の 3 mM の 0.4 mM を含む)、それぞれの 10 μ M 前方およびプライマーを逆引き、、蒸留水または脱イオン水 (dH2O)。
    注: 本研究で使用される SSR マーカーだった PT51333 (プライマー シーケンスを転送: 5 '- GCACCTTTGGTTATCCGACA - 3' と逆プライマー シーケンス: 5'- TGCTTTAAGTCATGTACCAAATTGA - 3') と PT50903 (プライマー シーケンスを転送: 5 ' - AAATTTCTTTCGGTGTGATAACTG - 3' と逆プライマー シーケンス: 5'-AGAGACTGCCGTTTGATTTGA-3') タバコと CX 43 (プライマー シーケンスを転送: 5'-TGGGGATGTGAGCTTCTTCT-3' と逆プライマー シーケンス: 5' - AGGGTTCCTTTGGGGTGATA-3') と CX 157 (プライマー シーケンスを転送: 5 '-TCGACGCTGACTTCACTGAC-3 'と逆プライマー シーケンス: 5'- GGACAGC....

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Results

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PCR 産物は、開花白菜とタバコで対応する SSR プライマーのペアを使用して作り出されました。後電気泳動ポリアクリルアミドのゲルは、SSR マーカー (図 1) のバンド パターンを明確に検出のプロトコルを汚す上銀を使用して染色された.

異なる銀の汚損のプロトコルの検出効率を比較するためタバコと開花白菜の SSR マーカーの PCR 産物ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分離し、5 公開銀染色などによる可視化プロトコル9,11,12,13,14新しいプロトコル。六つの.......

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Discussion

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含浸後ゲルの洗浄は重要なステップです。不十分な洗浄時間と水の量がプレートと、ゲルの表面に含浸液の不完全な除去を引き起こす、暗い背景に 。適切な現像時間は別の重要なステップは、過剰開発 DNA のフラグメントの低コントラストの画像で暗いブラウン バック グラウンドで結果することができます。さらに、受精のステップは DNA のフラグメントの染色効率を大きく影響します。含浸時間 5 分以上を拡張または含浸液アグノ3量を増やすことでは染色の精度が大きく改善されないがより小さい 3 分か、アグノ3 (の量を減少する時間の削減、含浸< 1 g) 灰色または浅い黒 DNA のフラグメントで結果することができます。

銀染色法の効率的な DNA 検出のための迅速かつ簡単な操作お勧めします。本研究で開発された新しいプロトコルを回避修正、停止していくつかの洗浄のステップ他プロトコル6,9,

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Disclosures

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著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

Acknowledgements

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自然科学基礎の中国広東 (2015A030313500)、地方キー国際協同組合研究プラットフォームと主要な科学研究プロジェクトの広東高等教育 (2015KGJHZ015)、科学によって資金が供給されたこの作品、広東省タバコの独占管理 (201403, 201705)、科学技術学部学生 (201711078001) のためのナショナル ・ イノベーション ・ トレーニング プロジェクト (2016B020201001)、中国の広東省の計画の技術計画。商号またはこの文書での商用製品の言及は固有の情報を提供する目的は、勧告または米国農務省によって承認とは限りません。米国農務省は、機会均等のプロバイダーと雇用者です。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
PCR master mix (Green Taq Mix)Vazyme Biotech Co. Ltd, China#P131-03
50-2000 bp DNA LadderBio-Rad, USA#170-8200
DL500 DNA markerTakara Bio Inc., Japan#3590A
Tris baseSangon Biotech Shanghai, China#77-86-1
Boric acidSangon Biotech Shanghai, China#10043-35-3
EDTA-NA2広州化学試薬工場、中国#6381-92-6
アクリルアミドSangon Biotech 上海、中国#79-06-1
N,N'-メチレン-ビスアクリルアミドSangon Biotech 上海、中国#110-26-9
N,N,N',N'-テトラメチルエチレンジアミンSangon Biotech 上海、中国#110-18-9
過硫酸アンモニウム州化学試薬工場、中国#7727-54-0
Bind-silaneSolarbio 北京、中国#B8150
AgNO3sub>Sinopharm化学試薬北京有限公司、中国#7761-88-8
ホルムアルデヒド天津DaMao化学試薬工場、中国#50-00-0
NaOH広州化学試薬工場、中国#1310-73-2
酢酸広州化学試薬工場、中国#64-19-7
Na2CO3天津大茂化学試薬工場、中国#497-19-8
エタノール広州化学試薬工場、中国#64-17-5
HNO3広州化学試薬工場、中国#7697-37-2
Na2S2O3.5H2OSinopharm化学試薬北京有限公司、中国#10102-17-7
リオクロムブラックT(EBT)天津DaMao化学試薬工場、 中国#1787-61-7
プラスチックトレイ上海Yi Chenプラスチック有限公司、中国TS-1
シェーカーQilinbeter江蘇省、中国-
BenQ M800スキャナーBenQ、中国-
DYY-6C電源北京Liuyi楽器工場、中国-
垂直ゲルシステム全体、JY-SCZFBeijing Tunyi Electrophoresis Co., Ltd, 中国-
広エ

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jiang, G. L. Molecular markers and marker-assisted breeding in plants. Plant breeding from laboratories to fields. Anderson, S. B. , InTech Press. Croatia. 45-83 (2013).
  2. Powell, W., Machray, G. C., Provan, J. Polymorphism revealed by simple sequence repeats. Trend Plant Sci. 1, 215-222 (1996).
  3. Varshney, R. K., Graner, A., Sorrells, M. E.

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