コレクションと RNA 解析のための大型動物からリンパ節の処理: リンパ節トランスクリプトーム研究大型動物種のための準備

サマリー

このプロトコルは、大型動物の同定と家畜、野生動物、アプローチをサンプリングからリンパ節の切除の手順を含むリンパ節組織のトランスクリプトームのプロファイルの RNA の隔離のための手順の概要を提供します回収後保存と RNA 解析の処理のため、複数の動物と考慮事項プラス代表の結果に一貫性を提供します。

要約

大動物 (家畜と野生動物の両方)ブルセラ、ウシ結核菌、サルモネラ菌、大腸菌を含む、人獣共通感染病原体の重要な貯水池として、機序の解明に便利です/または自然宿主の細菌の広がり。宿主の免疫応答におけるリンパ節のキー機能により、リンパ節組織は感染の過程で細胞における遺伝子発現の変化を評価するために下流のトランスクリプトーム解析のための RNA の潜在的なソースとして機能します。本稿ではリンパ節のコレクション、組織サンプリング、および下流の RNA、家畜処理モデルとしてウシ (Bos のトーラス) を用いた (バイソン バイソンのバイソンから提供されるその他の例のプロセスの概要).プロトコルには体内場所、識別、および複数の主要サイトからリンパ節の除去に関する情報が含まれます。また、生検の方法論が表示によりサンプリングの一貫性を保つのため、複数の動物の間でされます。RNA シーケンスと RT-PCR のような下流の手法に適した RNA の生成を含む、サンプル保存に関するいくつかの考慮事項を説明します。大動物対マウス時間コース研究に固有の長時間の遅延によりバイソンおよび牛リンパ節組織からの代表的な結果を表示してのレビューのコンテキストでこの組織型の劣化の経過を記述するには他の組織の RNA の分解の前の方法論的仕事。全体的に、このプロトコルは両方獣医研究者の大きな動物試料のトランスクリプトーム プロジェクトを開始し、分子生物学者組織サンプリング体内及び体外処理テクニックを学習に興味があるに役に立つでしょう。

概要

リンパ節のトランスクリプトームの RNA シーケンス解析は、様々 な病原体に動物の免疫応答を特徴付けるため機会を提供します。この方法は、マウスで広く利用されている、しながら解析最近大きい哺乳類^1,2に拡大しています。ワクチンや遺伝的感受性の研究での使用、医薬品開発、人間の研究のモデル系としてもターゲットの同定だけでなく、感染する宿主反応を特徴付ける家畜・大型動物リンパ節を使用できます。人獣共通感染症。たとえば、ブルセラ症 (人畜共通細菌性疾患、影響 50万の人々 世界中毎年)、場合にもかかわらず大幅コスト、羊の研究の増加やヤギ、ヒトへの感染とワクチンに関連します。動物実験よりも開発。マウス感染モデル要約細網内皮のシステム感染がないの特徴的な臨床症状³_.

実験動物学と比較して大規模な動物実験、必ずしも収穫組織のプロセスは、安楽死と保全の課題と潜在的な組織のコレクションとの間の遅延が長くなります高品質の RNA。そのまま RNA は生物学的に関連するトランスクリプトーム データの生成に不可欠です。組織サンプルからの高品質の RNA の生成は特に大きな動物病原体研究の重要で実施封じ込め設備。このような研究は施設を承認、高度訓練を受けた技術者を必要とするだけでなく、また、これは、作業に応じて、数百数千ドルの数十から範囲することができます重要な金融費用を運ぶように本質的により困難です。この種の研究は、分野横断的なコラボレーションと、完了すると、その複雑さに追加するための横断的知識もあります。したがって、トレーニングの開発とサンプル収集・保存のための合理化されたシステムへの付着大きなメリットをもたらします組織の下流の分子研究のため感染している動物から。

大きなリンパ節のコレクションは、マウスのリンパ節のようなサンプリングと比較して組織コレクションの追加課題を提示します。サンプルの切除のための準備は、関連する内部構造を含むリンパ節の解剖学の基本的な理解を必要とします。リンパ節の構造は、満ちているリンパ洞に囲まれたリンパ性小葉で構成されます。これらの構造は、堅い、繊維状のカプセルに含まれています。⁴リンパ性小葉は、「基本的な解剖学的および機能的な単位リンパ節」包、皮質深部ユニットと髄コードと副鼻腔⁴ (図 1 a) で構成されます。B および T リンパ球は、それぞれ卵胞と皮質深部の単位に家します。これらの構造は、3 D 足場を提供し、リンパ球と抗原抗原提示細胞の相互作用を容易にします。

肉眼的に, 卵胞と皮質深部単位上識別できること切断面と高密度細網の網目を含む副鼻腔はより繊細な細網網目から成るし、ライターが表示よりも暗く見えます (図 1 b)。慣例では、病理学者は浅野 (包), (皮質深部単位) 皮質髄質 (髄コードや副鼻腔) とリンパ節の領域を参照してください。すべての 3 つの地域の適切な検査はルーチン検査、病理組織学的リンパ節⁵指針の実践として最高と判断がされています。一貫性、サイズ、および 1 つの動物の中でも、リンパ節の色でかなり変動があることに注意してください。動物の年齢、サイズが小さくなり、若い動物のものより硬くなり、通常構造の結合組織と正常リンパ球の減少の増加のための^6,7がちで、リンパ節。

図 1.リンパ節の解剖学。(A) この漫画のイメージは、キー構造を描いたリンパ節の構造を示します。(B) この画像は、断面カット牛リンパ節を示しています。関連する構造/レイヤーは肉眼に目に見えるが強調表示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

実験的質問によって収集および分析のための興味の別のリンパ節になります。末梢のリンパ節は、皮下の組織に深くあります。牛は臨床的および実験的練習でよく使用されます周辺機器または表在性のリンパ節、耳下腺、顎下腺、咽頭、prescapular、prefemoral (precrural) と浅鼠径 (女性、男性の陰嚢に supramammary) (図 2)。テーブル 1、キーの表在リンパ節のプロパティ牛のシステム⁸に示すとおりです。以下、牛の伝染性の細菌性疾患のいくつかの潜在的なリンパ節のコレクションの計画が、調査の出発点として掲載されています。

ブルセラ abortus/ブルセラ melitensis:菌の標準 necropsies-感染牛およびB. melitensis-国立動物病センターで感染した山羊 supramammary、prescapular、耳下腺リンパ節組織を回復、研磨細菌の列挙とホスト RNA 発現プロファイリングのための RNA の準備のための両方。実験感染牛⁹_.でこれらのリンパ節のそれぞれで菌を定期的にリカバリできます。B. melitensisでこれらのリンパ節の種類ごとの細菌の存在を検出できる-私たちの研究 (Boggiattoら、未発表) から RNA ベースの方法を使用して、少なくとも 9 ヶ月後感染までヤギを感染しています。サルモネラsp: prescapular、subiliac (prefemoral)、腸間膜リンパ節は、プロファイリングのサルモネラの有病率^10、11,12の家畜の死骸の中に有用されていると、トランスクリプトーム研究の潜在的な利益のでしょう。エシェリヒア属大腸菌 o157: h7: (中間の小腸と遠位側小腸場所) で腸間膜のリンパ節が細菌感染牛 (ただし感染の成牛ではなく)¹³の時折回復のサイトをすることができます。レプトスピラ症 (レプトスピラ sp.): 乳腺¹⁴リンパ節で細菌の慢性持続性が観察されています。ウシ結核菌: 細菌は牛、子牛¹⁵縦隔や気管気管支リンパ節から回復した後実験感染をされています。さらに、リンパ節の RNA はウイルス、豚繁殖・呼吸障害症候群ウイルス²のように大きな動物宿主反応を調べるため利用されています。図 2は、牛の体のこれらの主要なリンパ節のサブセットの場所を示しています。

図 2:漫画で描いた内の選択したリンパ節の場所オオツノウシ. リンパ節の番号が付きます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

本稿および関連のビデオ、大型動物感染症のトランスクリプトーム研究に関与する分子生物学者のために有益であること、RNA 研究の大きな動物リンパ節の隔離のためのプロトコルを提案する.まず、我々 はリンパ節の例として牛、バイソンの組織からのサンプリングを使用して分離のプロシージャの概要を示します。ビデオに表示されるのこのデモでは、ペアになって、RNA の隔離のための再現可能な組織採取のワークフローです。次に、我々 は安全性、一貫性、および RNA の品質重視で、感染したリンパ節の処理のための重要な考慮事項をについて説明します。

酸性フェノール グアニジン イソチオ シアン酸性試薬による組織からの RNA の準備は、元 Chomczynski とサッキ^16,17の存在下でのシリカ系スピン列浄化法に基づいてください。カオトロ Vogelstein、ガレスピーの¹⁸の原作に基づきます。トランスクリプトミクスの代替方式と保存牛リンパ節からのリカバリーの可能性も検討します。最後に、私たちは安楽死とバイソンから回復された RNA プロファイルのサンプリング時間の増加の影響を描いた代表的な実験を含む大規模な動物の魚で RNA の品質の時間変数の影響を探索し、牛のリンパ節。この記事は分子生物トランスクリプトーム研究を開始また、獣医学の研究にだけ役に立つでしょう。

プロトコル

ここに描かれた動物の剖検手順 Ames、アイオワ国立動物病センターで承認された IACUC プロトコルの下で覆われています。動物のケアや福祉の承認されたガイドラインに従ってすべての実験を行った。

1. 事前に計画死体解剖前に

1. 、死体解剖前に剖検スイートへの輸送、以下の資料を準備します。
   1. 1.5 または 2 mL の遠心管に満ちて 〜 ラックまたは輸送コンテナー内の RNA 保存液 1.0 mL。組織のボリュームに保存液量の比率の製造元のガイドラインに従ってください。
   2. 使い捨てメスときれいで、オートクレーブ鉗子: 1 つは皮膚とリンパ節 (動物あたりのリンパ ノードごとに 1 つ) を収集するための別のセットを解剖するため設定皮膚やリンパ節環境植物のクロス汚染を防ぐ組織。
   3. 使用されるメスおよび生検ツールとまな板のシャープス コンテナーまたはリンパ節郭清で使用する使い捨てトレー 3 mm ツール生検、剖検ナイフをパンチします。
   4. 含む PPE システムの適切な BSL レベルでの作業に必要な保護具を使用します。
   5. オートクレーブ再利用可能な金属のツール設定用品/ドライ商品を使って死体解剖前に金属の鍋で、鉗子などを含みます。

2. 身分証明書と牛、バイソンのリンパ節のサンプリング

図 3.牛の頭と首のリンパ節です。(A) この漫画のイメージを示しています選択したリンパ節オオツノウシの頭頸部の。(B) この画像は、(右) 断面の断面 (左) と比較すると耳下腺の唾液腺の耳下腺リンパ節を示します。2 つの組織の種類のテクスチャの違いに注意してください。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

1. Prescapular リンパ節牛、バイソンの分離
   1. ローカル IACUC プロトコルに基づく動物 (牛や実験に応じて、あらゆる年齢層のバイソン) を安楽死させます。ハートビートの欠如や呼吸の欠如、角膜反射の不在を含む制度の IACUC プロトコルで説明されている方法で死を確認します。剖検床に動物を移動します。
      注: 大型の動物の実験室の練習で使用される人道的な安楽死の様々 な方法があります。ただし、ペントバルビ タール ナトリウム、フェニトイン ナトリウム溶液の静脈内投与が一般的に承認し、フォームを活用です。動物の安楽死の AVMA のガイドラインを参照してください。¹⁹
      注意: パンク防止コンテナー、および再利用可能な金属製のナイフや鉗子の除染にシャープの安全な処分のためのガイドラインを含む、ホスト機関で剖検のためのすべての関連するバイオ プロトコルに従います。このプロトコルは、使い捨てメスの使用から鋭利物廃棄物を生成します。ブーツ、つなぎ服、手袋、眼の保護など制度のガイドラインに従い、保護具を着用します。
   2. 動物の組織で作業する 3 参加者を識別します。
      注: ここでは、切開 1 がする大規模担当区分目的動物組織の解剖 2 は別の動物のセクションからリンパ節を回復、凝固切開装置 3 は、各リンパ節からのセクションを分離する別のテーブルで動作して防腐剤の溶液でチューブにそれらを転送します。
   3. 横の臥床に動物を配置することによって開始します。
   4. (手根骨); 膝のレベルに戻って前肢を動かすことによって肩を拡張します。この運動は肩を戻すとリンパ節の容易に触診できます。リンパ節「しこり」の存在を感じる。
      注: 病気の条件の中にリンパ節腫脹があります現在、リンパ節の同定が容易になっているが、このプロセスも一貫性、組成、およびリンパ節のアーキテクチャに影響を与えることができます。
   5. 見つかったら、まだ拡張肩と肩の輪郭に沿って皮膚切開をするのにメスや剖検ナイフを使用します。
      注: は、リンパ節の位置による触診をされている場合でも、切開のサイズを制限しません。大きな切開は深部組織に簡単にアクセスを提供し、切開、リンパ節の切除を容易に。
   6. ピンセットのペアを使用して、肩のポイントを明らかにし、首の筋肉の皮膚を撤回します。
      注: prescapular のリンパ節は皮下脂肪、特に overconditioned 動物に多い。
   7. もう一度、リンパ節 (図 3 a) の位置を触診します。
      注意: 皮下脂肪とは違ってリンパ節は触診する際にその図形が格納されます。さらに、薄い線維性被膜に囲まれていると、リンパ節が、周囲の組織と連続していません。
   8. Prescapular リンパ節が見つかったら、慎重にメスや鉗子を使用して、皮下脂肪を解剖し、リンパ節を分離します。
      1. リンパ節や脂肪組織を区別する図 1 bで示されている、薄い線維性被膜の有無を見てください。リンパ節が、周囲の組織と連続していません。
   9. リンパ節をさらに区分のため組織移行のプラスチック トレイを使用してリンパ節郭清テーブルに転送します。
      注: バイソンでこれらのリンパ節の外観は似ています。関連するビデオは、アメリカバイソンの右の肩の解剖と prescapular リンパ節の外観を示しています。
2. 牛、バイソンの耳下腺リンパ節の単離
   1. 剖検階横の臥床に動物を配置することによって開始します。顎の関節 (顎関節) を探します。
      1. これは見つけるが難しい場合、顎をゆっくりと移動し、で下顎骨は頭蓋骨; アタッチ位置を決定します。これは顎関節です。
   2. 皮膚の切開をするメスや剖検のナイフを使用して、慎重に。関節の背側切開を開始し、腹/垂直方向に下顎の輪郭に沿ってそれを拡張します。
   3. 皮下組織を明らかにする皮膚を切り裂きます。耳下腺唾液腺が表示されます最初に、その大きさ、葉状の表面外観と赤い着色のため。
   4. Move を使用鉗子、メス、耳下腺唾液腺脇にちょうど頭蓋と唾液腺 (図 3 a) の内側に座っている耳下腺リンパ節を見つけます。さらに処理前にテクスチャの耳下腺リンパ節組織を調べます。
      注: (耳下腺・顎下腺) 顔のリンパ節は、リンパ節の分離を混同することができます唾液腺に関連付けられます。リンパ節と比較して唾液腺は、はるかに大きいと葉状の表面外観を持っています。また、切断面に唾液腺は本質的に同種し、リンパ節 (図 3 b) の古典的な皮質・髄質アーキテクチャ パターンを示さない。
   5. メスを持つ腺を切除します。さらに断面の組織移行のプラスチック トレイを使用してリンパ節郭清テーブルに転送します。
3. 雌牛、バイソンの supramammary リンパ節の単離
   1. 横の臥床に動物を配置します。
   2. 鼠径部を公開し、乳房に後ろ足を昇格させます。
      注: 健康、非泌乳動物でこれらのリンパ節の触診できない場合があります。泌乳動物でこれらのリンパ節は乳房の底辺の尾側の国境で明白なかもしれません。
   3. メスを使って切開を行いますだけ背 supramammary 腺を公開する、上の脚に沿って実行している、乳房に。
   4. 皮下組織を解剖し、皮下脂肪の薄い層に埋め込まれた supramammary リンパ節を見つけます。視覚的に区別されない場合、は、皮下脂肪内でしっかりした構造の存在を露出した組織を触診します。
   5. 脂肪からリンパ節を解剖鉗子やメスを使用して、慎重に。さらに断面の組織移行のプラスチック トレイを使用してリンパ節郭清テーブルに転送します。

3. 断面・ リンパ節の

1. Dissector メイン剖検スペースに隣接する解剖テーブルで 3 に解剖 2 から分離されたリンパ節を渡します。各リンパ節をまな板の新鮮なセクションに配置します。連続で複数のリンパ節の受信を容易にするために、リンパ節のセクションでまな板済みラベルします。感染性サンプル、使い捨てのトレーを使用します。
2. リンパ節のセクションを削除する鉗子と使い捨てメスまたは剖検のナイフを使用する。鋭いナイフを使用して、リンパ節を開く矢状切口を作る。
3. 感染している動物から標本を中心に、リンパ節の内部を確認、非対称性を探して、病変、色の違い等、観察を記録します。
4. (オプション 1)小さな切片
   1. 使い捨てメスを使用して、厚さ 5 ミリメートル未満のものは、きれいな鉗子で RNA 保全ソリューションを管に各部分を転送する各リンパ節の部分を切除します。
5. (オプション 2)リンパ節の生検または区分の方法論
   注: 生検や断面の方法論は、異なるノードおよび動物間で並列節のセクションに適用すると一括 RNA 解析のサンプル組織の整合性を提供します。
   1. ウェッジ切断法
      1. リンパ節のプロファイル全体のセルをキャプチャする矢状断面を調査して、外側のカプセルにセンターからのリンパ節から扇形を切除します。ノード 2 cm 幅 (標準サイズ;テーブル 1を参照)、くさびの外側の弧の長さ 4 mm センター カット、厚さ 5 mm の湿重量 ~ 100 mg。
      2. メスを使用すると、細かく、5 mm と約 50-100 mg の各ウェットティッシュ重量でより厚くウェッジをカットします。
         注: 一貫性を保つのため、RNA の関心のリンパ節から代表的な RNA プロファイルを提供するためにプールの 1 つのバッチまたは個別のチューブで続いて単一のリンパ節からすべてのくさびの部分を処理します。
      3. RNA の保存液、組織のボリュームと比較して、少なくとも 10 巻を含む管に鉗子で組織の部分を配置します。
   2. パンチ生検法
      1. 目標ノードから特定の包など、特定のセクションを収集することだ場合は、パンチ生検のツールを選択します。コレクションに必要なサンプルのサイズと一貫性のあるツールを選択します。パンチ生検ツールは、直径 8 mm に 1 からのサイズの範囲で利用できます。
      2. 視覚的にリンパ節のサンプルに興味の領域を探します。
      3. パンチ生検ツールを使用して、関心の押すとコアを作成する組織化ツール セクションを切除します。RNA 保存液の少なくとも 10 ボリュームを含む管に鉗子で組織の一部を転送します。場合は 5 mm より厚く、さらに組織をより小さな部分に分割する鉗子やメスを使用します。
6. 一度サンプルを保存液に移管されている (e.g。、RNALater)、室温で研究室に戻ってそれらを輸送。
7. 組織浸透を可能に 4 ° C は一晩でサンプルを格納します。
8. 次の日、余分な RNA 防腐剤溶液を捨て、-80 ° C で組織サンプルを格納サンプルを凍結する前にできるだけ多くの防腐剤を削除します。効率的の RNA 防腐剤ソリューション除去 P1000 および/または P200 ピペット チップを使用します。
   注意: は、安全データ シートに指定されている防腐剤の溶液の化学的および環境危険だけでなく、利用されている病原体の感染のプロパティに基づいて、デカントし保存液を適切に破棄します。
   注: ここに示すガイドラインは、材料の表に記載されている RNA 保存液の提供されます。代替保存ソリューションを使用している場合は、製造元のガイドラインを参照してください。

4. RNA リンパ節から処理

注意: は、白衣、手袋、および処理手順の適切な眼の保護を着用します。

注: ここで使用されるフェノール ベースの試薬、材料表の説明 (とプロトコルは、製造元のガイドラインに基づいて)²⁰。代替フェノール ベースの試薬の使用を購入した特定の製品の製造元の推奨事項に基づく手続きの変更が生じます。

1. 前因数均質化チューブ (1.5 mL/チューブ)、冷蔵 (4 ° C) フェノール系試薬、サンプルにアクセスする前に、ピペットを使用してください。
   注意: フェノールは毒性、腐食性、および保健上の危険です。クロロホルムは有毒であり、健康を害するです。化学の発煙のフード、処理手順 4.1 4.9 と化学物質との接触を防ぐために手袋を着用します。アメリカ合衆国では、クロロホルムは有害廃棄物;ローカルおよび制度のガイドラインに従って有害廃棄物を含む管の処分します。プロセス対応する BSL 2、BSL-3、または BSL 4 ガイドラインの下で病原体に感染した動物から採取。
2. サンプルは、きれいな鉗子でマイクロ遠心チューブ用から緩めることができる、一度すぐにフェノール系試薬を含む均質化管に保存された組織の約 50-100 mg を転送します。
   1. フェノール系試薬を添加する前に解凍を制限します。複数のサンプル処理のため冷凍庫から削除されるとドライアイスのストレージを使用します。
3. しっかりとチューブのキャップ、ホモジナイザー、上に配置し、フェノール系試薬のロータ ・ ステータ組織ホモジナイザーを用いたサンプルをホモジナイズしてください。室温で処理を完了します。完了すると、確認してください正常にホモジナイズ時; ように曇った出現のため組織は、曇った懸濁液中に分散する必要があります。
   注: 2 分 RNA 抽出設定を使用 (、ホモジナイザーの事前に設定 RNA_02_1 設定表の資料に記載されている; 凍結組織用に設計された)。このプロトコルで指定されたロータ ・ ステータ (材料の表を参照)、大きい歯および繊維状物質を含む種類の組織の範囲の均質化に適応。(新鮮な) ではなく凍結のために特別に設計された RNA_02_01 設定です組織。リンパ節は線維性結合組織のコンポーネントを持って、同様に最適化されたロータ ・ ステータ ホモジナイザーは効果的な分離を達成するためにお勧めします。国立研究所の環境健康科学²¹均質化の推奨事項の詳細についてを参照してください。
   1. 均質化した組織の大きな塊が残っている場合は、均質化の手順を繰り返します。RNA を効率的に回復するために組織する必要がありますよく分離されます。
   2. 線維性リンパ節部分事前均質化管への転送前にいくつかのより小さな部分にリンパ節部分をチョップするのに鉗子、はさみを使用します。導入に記載されているより古い動物からリンパ節組織より線維性かもしれません。
      メモ: ホストと病原体 RNA の二重解析が必要な場合 (ビーズの均質化) などの追加治療がグラム陽性の病原体の組織に存在している場合は特に細菌の RNA の回復に必要なあります。
4. すぐにチューブから均質化のサンプルを削除し、P1000 マイクロ ピペットで遠心管 (サイズ 2.0 mL) の RNase フリーにそれを転送します。
5. 任意のサンプルの残骸を削除する 4 ° C、12,000 × g で 5 分間のサンプルを遠心します。P1000 マイクロ ピペット チップを使用して、新鮮な遠心管、ペレットを残して上清を転送します。
6. 室温で 5 分間上清を孵化させなさい。2 つの 1.5 遠心チューブ間の各サンプルを分割します。
7. クロロホルム (すなわち、0.3 mL 1.5 mL サンプル); フェノール ベースの試薬の 1 mL あたりの 0.2 mL を追加します。手でフェーズをミックスはない渦のサンプルに 1-2 分間、それを反転します。それを常温で 2 分間インキュベートします。
8. 4 ° C で 12,000 × g で 15 分間遠心します。
9. 中間期または赤いフェノール クロロホルム層を中断させることがなく、上層を形成するマイクロ ピペット チップ (P1000 または P200) と上、水性相を慎重に取り外します。新しい微量遠心チューブに転送します。
10. 100% エタノールの等量を混ぜてください。徹底的に 4-5 回チューブを反転でそれをミックスします。チューブの曇りしばしば現れます。
11. マイクロ ピペット チップでさらに浄化し、RNA、次の製造元の手順²²を溶出のシリカ系商業スピン列に液体を転送します。生成された RNA 溶出 〜 50 mg を水の RNase フリーの 50-100 μ l に組織。
    注: フェノール ベースの試薬抽出 qRT PCR および RNA シーケンス アプリケーションで RNA の下流用、有機相中の DNA を削除しますと DNase の RNA のサンプルの追加治療はお勧め。
12. 因数溶離された RNA、凍結融解のメインの RNA サンプルを減らすため、数量と品質評価用チューブを分離します。チューブを-80 ° C、ストレージに転送します。
13. BSL 3 封じ込めのレベルで特に人獣共通の病原体に感染した動物から派生したリンパ節のサンプルの場合低いバイオ セーフティ レベル封じ込めエリアにサンプルを移動する場合に病原体の有無を調べるのため結果 RNA サンプルを検証します。品質分析、RT-PCR および RNA シーケンス ライブラリの準備。
    注: それは現地の規制を考慮する重要なと [エージェントと仕事のため CDC (疾病管理・予防センター) 不活化ガイドラインの場合研究者のローカル サイトですべて不活化の手順を検証する必要があります。
    1. 1/10^thボリューム ステップ 4.12 から各溶出の RNA サンプルの (すなわち、総 RNA の 50 μ l から 5 μ l) を削除します。生殖不能の技術を使用して、滅菌 1.5 mL 遠心チューブに細菌の増殖液 100 μ l のサンプルをミックスします。滅菌プラスチック スプレッダーを使用して RNA スープ混合物を寒天プレートの表面に 。
       注: は、動物が挑戦した病原体の成長と一貫性のあるスープの種類および寒天培地プレートを選択します。
    2. 挑戦された動物と病原体の成長に特定の条件下で寒天を孵化させなさい。BSL 3 封じ込めからサンプルを削除する前に復元された細菌の有無を確認します。
       注: 生じる溶離された RNA 定量化と整合性のテスト後は RNA シーケンスと RT-PCR 解析を含む下流のアプリケーションに適しています。
14. RNA の回復および純度分光光度計を使用して評価します。RNA の品質を評価するには、分析用分光光度計に溶出の RNA のサンプルの 1-2 μ l をロードします。紫外線 (UV) 領域で、試料のスペクトルを記録します。
    1. UV スペクトルから記録 A₂₆₀/A₂₈₀比率、A₂₆₀/A₂₃₀比とサンプルの A₂₆₀値 (A 吸光度を =)。
    2. 40 μ G/ml の濃度で単一座礁させた RNA は 260 で 1.0 の吸光度を nm、A₂₆₀ x 40 精製サンプルを乗じて RNA 濃度 (μ g/mL) を計算します。
15. RNA の整合性の評価の迅速な方法としてさらに分析から、劣化したサンプルを除外するミックス 2 μ l 各 RNA サンプルの 1.5 x formamide ロード染料 [純水 95% ホルムアミド、0.025% (w/v) ブロモフェノール ブルー、0.025% (w/v) キシレンシアノール、5 mM EDTA (pH の 4 μ l で8.0)、0.025% (w/v) SDS] 1.5 ml 容マイクロ チューブ^23,24。
16. 1 分 70 ° C でチューブを熱し、1 分間氷にチューブを転送します。
17. 1 で準備 1% の agarose のゲルにサンプルを読み込む x TBE (RNA のネイティブ agarose ゲル電気泳動法の完全な説明、リオ、アレス jr.、グリーンウェー、ニルセンを参照してください)²⁴。標準的なゲル電気泳動法によって、試料を分離し、28 s、18 s リボソーム RNA のバンドの存在を確認します。
18. 代表結果やミューラー修[例えばバイオアナライザーと凛 (RNA 整合性番号) 分析] RNA の整合性定量定量分析方法でゲルの電気泳動フォローら。 ²⁵とシュレーダー、A.ら²⁶。

5 ホルマリン固定から代替抽出法 (FFPE) パラフィン包埋組織

注: FFPE 組織保全は最も堅牢な核酸保存法を表さないが以下に示すプロトコルは他の保存の組織が利用できない場合、いくつかの転写の変化を研究する方法をすることができます。

1. ティッシュの保存のためホルマリン試薬を準備するには、プラスチックの容器にホルマリンを調剤します。組織は、それぞれ比 20:1 ホルマリン: 組織容積/重量、ホルマリン漬けになった必要があります。
   注意: ホルマリンは知られている人間の発癌物質、ない急性毒性が (通常を通じて吸入ガス) 慢性露出は重要な保健上の危険を表すことができます。適切な換気と PPE (すなわち、最初の暴露後 15 分以内に変更する、ニトリル手袋の使用) は、健康上のリスクを最小限に抑える必要があります。OSHA ホルムアルデヒド標準を参照してください (29 CFR 1910.1048) 曝露モニタリングとリスク評価の詳細について。
   注: あまりホルマリンを使用して防腐剤に浸漬するとき完全に保存され、組織の能力に影響を与えることができます。
2. 興味の組織の分離後、厚さ 5 mm より小さい組織を慎重に切り落とします。
   1. ホルマリン、飛散を最小限に抑えるためにトリミングされた組織を水没鉗子を使用して、慎重に。
      注: の組織は、完全な固定のためにホルマリンに完全に水没する必要があります。組織のすべての面がホルマリンで完全に覆われていることが重要です。
3. 組織は、ホルマリンで水没している、少なくとも 24 時間室温で発生する組織固定用を許可します。
   注: ホルマリンはすべて表面^27,28から 1 時間あたり 1 mm の割合でゆっくりと、組織浸透します。したがって、組織切片の厚さ 5 mm の結果よりも小さいの維持全体組織の急速な固定。
4. 固定後パラフィン包埋用の適切な試薬に組織を転送します。
   注: たとえば、本稿で検討組織は、埋め込み前に 70% エタノールに移されました。
5. 組織をパラフィンに埋め込みます。²⁹
6. 厚さ (使用 10-20 μ m の miRNA が抽出する必要な場合) の 10-80 μ m の組織のセクション²⁹。
7. メスや鉗子を使用して、各サンプルを処理し、滅菌、ヌクレアーゼ フリーおよび microfuge の管に配置から 40 mg の組織部分を削除します。
8. Deparaffinization と核酸回復 FFPE 組織サンプルの保存サンプルから RNA を抽出するために設計、市販キットを利用します。
   注:テーブルの資料で参照されているキットを利用してキシレンとエタノール洗浄パラフィン、プロテアーゼ処理ステップ、および RNA を浄化するためにガラス繊維フィルターを削除します。

結果

(プロトコルの手順 1-4) この記事で紹介した注意事項の使用は、下流におけるホスト遺伝子発現研究に適している大規模な動物サンプルからの RNA の回復に役立ちます。下流用 RNA の品質は、複数の標準的な措置によって評価されます。吸光光度法、A₂₆₀/A₂₈₀の比率は、蛋白質の汚染の測定を提供し、A₂₆₀/A₂₃₀比は、フェノールなどの化学汚染物質を検出する純度評価の別の手段を提供します。それぞれのケースの比率で 〜 高品質 RNA の証拠であり、低下の比率は、汚染の証拠 2.0。重要なは、これらの比率は質的評価される RNA の劣化に関する情報は提供されません (4.15 4.17 のステップ) と定量的 (ステップで 4.18、RNA を介して整合性番号または鈴スコアなど)。

リンパ節組織切片から回復した RNA の期待される品質レベルは、平均で、ウシ白血球細胞サンプルから RNA よりも低くことが重要です。牛組織および培養細胞からの RNA 抽出の包括的なシリーズで Fleige と P...

ディスカッション

トランスクリプトーム研究と関連プロトコルの大部分はマウス、ラット、または事後ひと試料に焦点を当てます。しかし、家畜や野生動物の調査は人間の公衆衛生獣医・人獣共通感染症については必要に応じて、両方の病気に免疫応答の評価の機会の広い範囲を提供します。このプロトコルは、牛、バイソン、ヤギ、羊などの大型動物から組織から整合性の高い RNA 抽出の重要な考慮事項の概要を提供します。サンプル コレクションのための条件と同様、動物のサイズに、回復マウス リンパ節復旧のためのより長い事後処理時間とのより詳細なプロセスです。同様に、これらのリンパ節の大きさは、リンパ節内で免疫学的・病理学的変化を代表するサンプルと同様に、さまざまな動物から並列の例の回復プロトコルを必要とします。このプロトコルではサンプルのコレクションのための提案は、リンパ節の区分に基づいて代表的なプロファイルはそのまま RNA 同様の回復を提供します。

標準化されたサンプリング方法とプロトコルの重要性の例としてここに示された家畜リンパ節のトランスクリプトームを特徴とする PubMed 中央データベースから 25 の論文を調査しました...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
RNA保存液(すべての実験でRNALaterを使用)	ThermoFisher	AM7020
1.5 ml or 2 ml ポリプロピレン微量遠心チューブ	フィッシャーサイエンティフィ	05-408-129
使い捨てメス	ダイガーサイエンティフィック	EF7281
組織鉗子、ラット歯	フィッシャーサイエンティフィック	12-460-117	湾曲した先端、テーパーエッジなど、その他の組織鉗子が利用可能で、ユーザーの好みによって異なります
3mmパンチ生検針	フィッシャーサイエンティフィ	NC9949469
鋭利物容器(小型で剖検用に持ち運び可能)	ステリサイクル	8900SA	1クォートサイズ
こちら まな板または使い捨てトレイ	フィッシャーサイエンティフィック	09-002-24A	ユーザーの好みにより異なる様々なサイズをご用意
個人用保護具			病原体(手袋、マスク、ゴーグルなど)によって異なります。
フェノールベースのRNA抽出試薬(すべての実験にTRIzol試薬を使用)	ThermoFisher	15596026
SilicaカラムベースのRNA抽出キット(すべての実験にPureLink RNA Miniキットを使用)	ThermoFisher	12183018A	最大100 mgの組織用に設計
100%エタノール(分子生物学用の200プルーフ)	Sigma-Aldrich	E7023
密閉型ホモジナイザー付き組織ホモジナイザー(すべての実験にgentleMACS解離器を使用しました)	Miltenyi Biotec	130-093-235
アガロース(一般、ゲル電気泳動用)	Sigma-Aldrich	A9539
1X	TBE Fisher Scientific	BP24301	また、実験室でゼロから作ることができます
脱イオンホルムアミド	EMDミリポア	S4117
ドデシル硫酸ナトリウム	Sigma-Aldrich	L3771
ブロモフェノールブルー	Sigma-Aldrich	114391
キシレンシアノール	Sigma-Aldrich	X4126
EDTA(エチレンジアミン四酢酸)	Sigma-Aldrich	EDS
UV-Vis分光光度計(NanoDrop分光光度計を使用)	ThermoFisher	ND-2000
定量的RNA評価装置(バイオアナライザーを使用し、関連コンポーネントとプロトコルを使用)	Agilent	G2939BA
FFPE RNA抽出キット(ホルマリン固定パラフィン包埋組織用のRecoverAll Total Nucleic Acid Isolation Kitを使用)	ThermoFisher	AM1975
プラスチックスプレッダー(L字型スプレッダー)	Fisher Scientific	14-665-231	感染動物からのサンプルの無菌性試験にのみ必要
剖検ナイフ家畜	コンセプト	WI-0009209