唾液腺機能低下は自己免疫病と放射線療法の頻繁に結果です。これらの疾患のマウスモデルにおける唾液腺機能の再現性の評価は、技術的な挑戦です。ここでは、マウスの唾液の分泌の正確かつ再現可能な測定のための簡単な方法を説明します。
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この記事について
サマリー
要約
外分泌腺に影響を与える自己免疫疾患シェーグレン症候群患者唾液腺の炎症を起こすし、唾液の生産を減らした。同様に、唾液の分泌は、頭頸部がんの放射線治療を受けている患者の侵害が深刻です。齧歯動物モデル、これらの臨床条件を模倣するために開発は疾患の病態の理解を容易にして新しい治療戦略の開発を可能にします。したがって、正確に、再現性をもって、繰り返し動物モデルで唾液腺の機能を測定する能力は重要です。以前文献で説明されている手順を踏まえ、方法はこれらの基準を満たしているとマウスの唾液腺機能の評価に使用されたを開発しました。この新しいメソッドの追加の利点は、それが簡単に習得し、そしてオペレーター間の変動が小さいをことです。唾液腺機能は、数量 (重量又は容積) または唾液ピロカルピン刺激に反応して生成率 (mL/分) として評価されます。採取唾液タンパク質含有量、免疫グロブリン濃度と他の生体分子の解析のためのよい源であります。
概要
唾液腺は、様々 な神経学的および力学的刺激1に対して唾を生成します。刺激は、腺のアドレナリン作動性およびコリン作動性受容体に交感神経と副交感神経の神経系を介して実行されます。ピロカルピンは、ムスカリン受容体に作用する主にコリン作動性、パラ交感神経エージェントです。唾液腺には、M31ムスカリン性アセチルコリン受容体に作用して唾液の生産を誘発します。ピロカルピン投与唾液の分泌唾液腺の刺激に応答する能力の指標であるし、唾液腺の機能の尺度として使用されます。
シェーグレン症候群2頭頸部がん治療3放射線障害などの唾液腺疾患における唾液の生産の正確な測定が欠かせません。齧歯動物の唾液の分泌を測定するさまざまな方法が開発されています。排泄の唾液腺導管4、5真空下で口腔内から唾液のコレクション、ガラス毛細管6またはピペット7,8,を使用して、コレクションの直接穿刺が含まれます9. 直接唾液腺導管の穿刺が最も正確かつ純粋な唾を提供します。ただし、これは技術的に挑戦的な手順、管の損傷を引き起こす可能性を排除する同じ動物から反復唾液コレクション。真空下で唾液を収集管から唾液の乾燥により、変数の結果につながることができます。この損失は、減らされた唾液を持つマウスでさらに誇張されています。ただし、病気の状態で分泌される唾液の粘度の変化により、毛細血管の効率的な充填、ガラス管許可以降の解析のための唾液のコレクション。さらに、残留唾液を収集するために口腔内を掃除しようは、怪我につながることができます。ピペット法は、完全なコレクションと同じ演算子の実験間非常に一貫しています。しかし、未知の理由のためこのメソッドは差の異なる演算子を示しています。したがって、適切に比較できるように、同じ演算子は、特定のプロジェクトに関連するすべての実験を実行することが不可欠なります。明らかに、これは実験室の主要な不利な点を表します。
これらの問題を克服するためにプロシージャを組み合わせた唾コレクション メソッドを人間および齧歯動物の使用をしました。ピロカルピン誘導唾液量を測定するため下記綿棒の方法は、簡単に再現できる、オペレーターによって影響されないと同じ動物で繰り返し実行することができます。さらに、タンパク質や他の生体分子、免疫グロブリン、以降の解析に唾液を収集できます。
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プロトコル
下記プロトコルは機関動物ケアおよび使用委員会によって承認され、健康の国民の協会によって倫理的なガイドラインに従うこと。このレポートに表示されるすべてのデータは、10-12 週齢をした雌のマウスを使用して生成されました。マウスの次の系統が使用された: (B6XA/J) F1、129S、DBA1 BALB/c C57BL/6。すべてのマウスが特定病原体フリーの条件でバリア ケージ (檻ごと 5 動物) に収容され、飼料と水のアドリブ。
1. 準備
- 塩酸ピロカルピンの原液を準備するには、化合物の 10 mg の重量を量るし、ボルテックス 5.63 mg/mL の原液を与えることによって 1.776 mL 滅菌等張生理食塩水に溶かします。このソリューションを消毒する必要はありません。しかし、必要な場合は、0.2 μ M フィルターをフィルター処理します。3 ヶ月間-80 oC の冷凍庫に複数の因数でこの原液を格納します。各冷凍ストックは、1 つ使用します。解凍後、ピロカルピン ソリューションは再冷凍しないでください。
- 0.6 mL の microfuge の管と温水 18 ゲージ針で慎重に各チューブの底に小さな穴をパンチします。2 mL の管にこれらの管を設定しました。チューブを滅菌する必要はありません。
- 長さ約 2 cm の部分に円筒吸収性の綿棒をカット、シャープ、滅菌かみそりの刃を使用しています。斜めに 2 の円錐形をした綿棒を与える各 2 cm 部分をカットします。0.6 mL の microfuge の管のそれぞれに 1 つの綿棒を配置します。
- 乾燥綿棒を含む 0.6 mL および microfuge の管の重量を量る。
- 水のボトルと新しいきれいなケージに調査されるマウスを転送します。収集唾液の汚染から食品の粒子を防ぐために唾コレクションの開始前に少なくとも 2 時間の食べ物がなくてもマウスを維持します。
注: この手順のケージごと 1 マウスを維持する必要はありません。ただし、各ケージに置かれたマウスの数は特定の学校の規則の動物の使用のための規則に依存します。 - 2 h の終わりの直前に滅菌生理食塩水で原液の 100 倍希釈することによって作業ピロカルピン液 (0.0563 mg/mL) を準備します。さらにフィルターする必要はありませんこのソリューションを滅菌します。氷上作業ピロカルピン ソリューションを常に保ちます。
注:表 1はピロカルピン体重 0.375 mg/kg の最終的な線量を与えるマウスの体重の範囲に注入する量を示します。
2. 手続き
- 各マウスの重さし、表 1を使用して各マウスの麻酔のミックスの用量を決定します。麻酔のミックスの適切なボリュームと腹腔内のルートで最初のマウスを注入します。(ほとんどのマウス系統をこのプロトコルでテストは 2 分でスリープ状態に入る) 2 分間タイマーを設定します。マウスの麻酔正しく平らな面に置いたときの歩行の不足を確認します。マウスがまだ歩いている場合、は、次のステップに進む前にさらに 2 分を待ちます。乾燥を防ぐために両方の目に潤滑剤の眼軟膏のドロップを適用されます。
注:テーブル 1、麻酔のミックスの投与量 0.007 mL/g 体重です。この手順に最適な範囲に 0.008 0.006 mL/g 体重。しかし後に、4 分、マウスがまだ歩くかぎくしゃくした動きを示す場合適切に麻酔薬の投与量を増加させるため機関の獣医師と相談して。 - 表 1を使用してマウスのピロカルピンの投与量の決定し、適切な量を注入して腹腔内のルート。2 分間タイマーを設定、切断端から頭と耳を出すまで、マウスを 50 mL 落管に挿入します。頭を下げ、45 度の角度で管と上向き腹側表面を配置します。移動からそれを維持する手順ボードにチューブをテープします。
注:表 1は、17 g 以下の重量を量るマウスにこの手順が試行されていないように 17 g 以上のマウスの投与量を提供します。 - 2 分の最後に、優しくマイクロ鉗子を口の中に解離性の閉じたペアを挿入する、上向きに口を開くに下顎を持ち上げます。さらに 1-2 mm の鉗子を舌が鉗子のトップの腕に休息を見られることを確かめて、口の中に押し込みます。微細鉗子の別のペアに円錐形の先端に近い重量を量られた事前乾燥綿棒を保持します。
- 口に綿棒の円錐形の先端をゆっくり押し込みます。口腔内に綿棒の先端を残しながら鉗子を撤回します。
- 広い口の外を拡張する綿棒の端をつかみ、口が付いている接触の最大の領域を許可するように回します。綿棒を 15 分間この位置にしてください。
注: コレクションの期間の綿棒が口の中に残っているとこうなります。綿棒の円錐形の先端が芯として機能、綿棒の広い部分は口の外に注意してください。 - 15 分の終わりには、ゆっくり吸収されていない唾液を収集するには綿棒を回転させると、湿式の綿棒に 0.6 mL および microfuge の管。管を閉じて、氷上に置いた 2 mL チューブでそれを設定します。
注: この時、口腔粘膜が完全に乾燥で表示されます。今、マウスも、麻酔からの回復のためのケージに戻って移動することができます。 - ケージ内マウスを転送します。場所は、高速な再水和作用を助けるために唾液収集後ケージに餌ペレットを湿らせた。
注: マウスは、コレクションの終了後 10 分以内で目覚めます。0.2 mL に予め温めておいた等張生理食塩水の皮下注入は、回復を加速に与えられる可能性があります。 - 次のマウスに進みます。すべての彼らが完全に回復するまで、マウスを監視する必要があり、外来。
3. 測定
- すべてのコレクションの最後に、ウェット綿棒と 0.6 mL の管の重量を量る。湿重量と唾液が生産の重量を得るための乾燥重量の差を計算します。2 mL チューブに唾液で 0.6 mL のチューブを配置します。
- 2 ml チューブのキャップを切った。その後、唾液を回復するマイクロ遠心分離機で 4oC で 7500 x g で 2 分間 2 mL チューブを遠心分離機します。マイクロ ピペットを用いて唾液の量を測定します。
- 唾重量 (mg)10 15 分以上、または唾重量 (mg) の比として結果を表現/体重 (g) をマウスします。
注: 綿棒から抽出の唾液の量を測定すると、唾液の回復 (mL) のボリュームまたは唾液の量 (mL) の比として結果を表現/体重 (g) をマウスします。
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結果
実験的マウス モデル システムにおけるピロカルピン刺激への応答の唾液を生産する能力、唾液腺機能の指標として使用されます。唾液の分泌は、綿棒法による 11 週齢の c57bl/6 雌マウスで測定しました。図 1 aで結果は唾液 (mg) 収集したピロカルピンの用量増加を次の量として表されます。1 mg/kg 体重の投与量でマウスのいくつかで遭難 (不本意な揺れと震え) の展示を開始しました。したがってピロカルピン 1 mg/kg 体重以上の高用量は、本研究ではテストしませんでした。図 1 b結果は、マウスの体重 (g) 唾重量 (mg) の比率として表されます。総称して、これらのデータは、ピロカルピンの量や唾液の生産の良い線量反応関係を表示します。綿棒から回復した唾液の量を測定したも。図 1に示すように、唾重量と唾液の 1 mg が 0.001 mL を等しい容積と重要な索引があります。
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ディスカッション
唾液の分泌は複雑なプロセスであり、多くの要因に影響されます。したがって、測定実験動物の唾液腺機能は、挑戦をすることができます。追加の課題は、同じ動物の唾液腺機能の繰り返し測定が病気の発症を確立する次の治療回復を示す、または必要なことです。
このレポートで説明した綿棒方法は技術的にデータを表す複数のオプションを実行する簡単です。得られる結果は、事業者間の変動が小さいと、再生可能です。メソッドは、唾液腺機能不全の異なるモデルの唾液の分泌の減少を検出できます。重要な利点は不活性、高吸水性ポリマーの使用と唾液の測定を許可する収集、唾の効率的回収。このメソッドのもう一つの利点は、単一の演算子を一度に最大 2 マウスで同時にこの手順を実行することが可能です。これは同時に単一のマウスで舞われることいくつかの他の方法よりも大幅に効率化です。
唾生産測定の変動はすべて唾液測定技術の悩みの種にされています。変動を最小限に抑えるため、プロトコルに厳密に準拠することが重要です。重要な手順が含まれます: 乾式と湿式の綿棒の正確な重量記録とピロカルピン ...
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開示事項
著者はある利益相反を開示します。
謝辞
研究は、国立衛生研究所、国立歯科頭蓋顔面研究 (DE025030) からの助成金によって支えられました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 唾液収集用のChemicals | |||
| Pilocarpine hydrochloride | Alfa Aesar, Tewksbury, MA, USA | B21410 | 滅菌等張性生理食塩水で希釈します。-80o |
| CName | Company | カタログ番号 | コメント |
| 麻酔ミックス溶液 | Mix 1 mLケタミン塩酸塩+ 0.5 mLキシラジン+ 8.5 mL滅菌等張生理食塩水滅菌バイアルに保管してください。3ヶ月間使用できます。 | ||
| ゼタミン(塩酸ケタミン) | Vet One、ボイジー、アイダホ州、米国 | C3N VT1 | ストックは100 mg / mL |
| Anased(キシラジン) | Med-Vet International、Mettawa、IL、USA | RXANASED-20 | ストックは20 mg / mL |
| 等張性滅菌生理食塩水 | Vet One、ボイジー、アイダホ州、米国 | 501032 | 剤として使用されます |
| 人工涙液(潤滑剤眼科軟膏) | ヘンリー・シエン、ダブリン、オハイオ州、米国 | 48272 | 手順中に目が乾燥するのを防ぐために使用 |
| 名前 | strong会社 | カタログ番号 | コメント |
| 唾液収集のための材料 | |||
| SalivaBio子供の綿棒 | Salimetrics、LLCカールスバッド、 CA, USA | N/A | 個包装綿棒 |
| 50mLポリプロピレンチューブ | VWR, Radnor, PA, USA | 89004-364 | チューブの底を1cm切り取ります。切り口が滑らかであることを確認してください。 |
| 微量遠心チューブ 0.6 mL | VWR, Radnor, PA, USA | 87003-290 | 加熱された18ゲージの針でチューブの底に穴を開け |
| 微量遠心チューブ 2 mL | VWR, Radnor, PA, USA | 87003-298 | |
| 恒久的に取り付けられた針付きインスリン注射器 | Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA | 324702 | |
| 18ゲージのレギュラーベベル針 | Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA | 305195 | |
| 滅菌メス刃 #11 | Integra York Inc PA, USA | 4-311 | |
| Microdissecting 鉗子 | Roboz, Gaithersburg, MD, USA | RS-5139 | 鋸歯状角 0.8 mm チップ、4" |
| 長さ ラベルテープ | Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA | sc-224487 | |
| 3 チャンネルタイマー | Amazon.com,米国ワシントン州シアトル | B06W2KCYVN | |
| 分析天びん | メトラー・トレド、オハイオ州 | ||
| strong>名前 | 企業名 | カタログ番号 | コメント |
| 唾液機能障害を誘発するための化学物質/試薬 | |||
| LPS | Invivogen, San Deigo, CA, USA | tlrl-b5lps | エンドトキシンフリー水に溶解し、ストック溶液を5 mg/mLで保存します。滅菌HBSS 100 ug/mLで希釈してください - 100 uL/ moue ip |
| Imject Alum アジュバント | Thermo Scientific | 77161 | 滅菌生理食塩水で1:1に希釈します。腹腔内0.1mL/マウスを注入 |
| 抗Ro52抗血清 | ラボ | 組換えマウスRo52によるウサギの免疫 | |
| <>名前 | Company | カタログ番号 | コメント |
| <>strong>Chemicals/唾液分析用キット | |||
| Salivary リゾチーム推定 | |||
| EnzChek リゾチームアッセイキット | Molecular Probes, Eugene, OR, USA | E-22013 | 製造元の指示に従って使用 |
| 名前 | >会社 | カタログ番号 | コメント |
| サンドイッチによる唾液IgAの推定 ELISA | |||
| Mouse IgA | Southern Biotech, Birmingham, AL, USA | 0106-01 | サンドイッチELISAの標準 - 範囲 30 ng/mL から 0.5 ng/mL |
| ギの抗マウスIgA 非標識 | Southern Biotech, Birmingham, AL, USA | 1040-01 | 重炭酸塩緩衝液ヤ |
| ギ抗マウスIgA HRP | で1 ug/mLでコーティングSouthern Biotech, Birmingham, AL, USA | 1040-05 | 1:4000希釈TMB基質で使用した検出抗体 |
| Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA | 555214 | 製造元の指示に従って使用 | |
| Immulon 4HBX Microtiter 96ウェルプレート | Thermo Scientific, Rochester, NY, USA | 3855 | |
| Name | Company | カタログ番号 | コメント |
| Salivary protein estimation | |||
| Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Reagent Concentrate | BioRad, Hercules, CA, USA | 5000006 | 製造元の指示に従ってタンパク質を推定するため |
参考文献
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