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方法論記事

ラットモデルにおける部分的な術後後の漏れを減らすために脂肪組織由来幹細胞シートの移植

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DOI：

10.3791/57213

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2018年8月11日

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1Department of Clinical Sciences of Companion Animals, Faculty of Veterinary Medicine, Utrecht University, 2Department of Otorhinolaryngology, Erasmus MC University Medical Center, 3Department of Clinical Sciences and Public Health, Faculty of Veterinary Science, Mahidol University, 4Department of Surgery, Erasmus MC University Medical Center, 5Department of Orthopaedics, Erasmus MC University Medical Center, 6Hill's Pet Nutrition Inc.

この記事について

サマリー

準備・ ラットのモデル大腸吻合の縫合が不十分な上に脂肪組織由来幹細胞 (ASC) シートの移植が表示されます。この新しいアプリケーションは、ASC シートが大腸吻合の漏れを減らすことができますを示しています。

要約

縫合は、大腸手術後悲惨な合併症です。漏洩防止のための現在の方法は、臨床的有効性の異なるレベルを持って、彼らは今不完全なソリューションまでです。ASC のシートを使用して幹細胞療法は、この問題への解決策を提供できます。Asc は、組織のための栄養と免疫調節特性治癒を促進するために有望な候補者と見なされます。ここでは、漏れを減らすためラットのモデル大腸吻合移植された高密度の ASC シートを生産するためのメソッドを提供します。Asc は、容易に切り離すことができる温度応答性培養皿の細胞シートを形成しました。移植の日、5 縫合大腸吻合による部分的な結腸切除術を行った.動物はラット ASC 1 枚入ですぐに定植。ASC シートは、任意の接着剤、縫合、または任意の生体材料なし吻合に自発的に付着しました。動物のグループが 3 と 7 日を犠牲になった術後。移植した動物に比べると、対照動物の吻合部膿瘍と漏れの発生率は高かった。私たちのモデル大腸吻合後 ASC シートの移植は成功し漏れ率が低いに関連付けられています。

概要

主な吻合を持つ部分的な結腸切除術は、大腸癌、クローン病、憩室炎1,2など大腸に影響を与える多くの病気のため行うことができます一般的に行わ手術です。大腸吻合は縫合3後、最も恐ろしい合併症です。吻合部リークに関連付けられているいくつかの危険因子が同定されている、不明4、5のまま漏洩防止ソリューションです。

脂肪組織由来の間質細胞 (Asc) は、抗炎症および栄養特性6、7、再生治療8候補者を約束これらの細胞を作るに関連付けられます。心臓の筋肉、皮膚、食道9,10、11,12,13など様々 な組織に組織の治癒を促進するため Asc の有効性を示した。ただし、腸治癒を促進する Asc の使用に関するほとんどのレポートがありません。ASC コーティング biosutures を介して実験的大腸吻合に Asc のローカル移植または Asc の漿膜注射癒しの14のいずれかなしの改善を示した吻合部をより好ましいにもかかわらず縫合を予防しなかった15をの癒し。

懸濁液の Asc のローカル移植併用または生体が不十分なセルの保持または移植細胞11の不十分な分布に関連付けられた可能性があります。細胞シート技術16,17 ASC 配信18,19の革新的な方法を提供しています。したがって、以前の研究では、新しいアプローチは実験的大腸吻合20で適用できるシートのセルで構成されている Asc を提案しました。この研究は、ASC シート移植がラットモデルにおける部分的な術後後大腸吻合の漏れを減らすに成功したことを示した。この記事は、ASC シート準備と外科的移植法を報告します。

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プロトコル

腹部皮下脂肪は医療倫理委員会 (#MEC-2014-092)、エラスムス MC 大学医療センター、ロッテルダム、オランダの承認を得て人間のドナーから得られました。すべての動物実験は、動物実験倫理委員会、エラスムス MC 大学医療センター、ロッテルダム、オランダ (133-14-01) によって承認されました。

1. 人間の Asc の分離と培養

  1. 脂肪の 1 グラムの分離培地 3 mL を準備します。ミックス低血糖ダルベッコの変更イーグル培地 (LG DMEM) 10 G/L のウシ血清アルブミン (BSA) と 1 グラム/L のコラゲナーゼ タイプ 1。
  2. 人間の皮下の腹部の脂肪組織を解剖 (n = 8、すべての女性、平均年齢 40 ± 9 歳) 一個 (0.5 cm) の滅菌生物学的 SafetyCabinet の生殖不能外科ブレード サイズ 10、アドソン ブラウン組織鉗子および Metzenbaum はさみを使用してにします。
  3. 切り裂かれたティッシュを滅菌瓶メディア ストレージに格納します。切り裂かれたティッシュの総量の重量を量る、準備された分離培地 (150 ml のボトルあたりの分離媒体の脂肪組織の 50 g) で消化を始めます。プロトコルは、一晩ローラー ミキサーに切り裂かれた脂肪と 4 ° C で分離培地ボトルを格納することによってここで一時停止できます。次の手順を続行する前に 15 分間室温 25 ° C に次の日にボトル、prewarm します。
    注: 承認エラスムス MC 医療倫理委員会 (# メック-200) の倫理規定によるとで乳房再建手術を受けるドナーから残り物の材料としてその腹部皮下脂肪の得られた:「適切な二次利用人間の組織」の (< http://www.federa.org>)。残った脂肪はないオプトアウトを二次利用ドナーから使われました。
  4. シェーカー ・ インキュベータで 150 rpm と 1 h の 37 ° C で滅菌ガラス メディア ストレージ ボトルに切り裂かれた脂肪を消化します。
  5. 50 mL チューブに消化ソリューションを分割し、390 x g で 10 分間のチューブを遠心分離機します。
  6. 培地の準備: 10% 牛胎児血清 (FBS)、50 μ g/mL ゲンタマイシン 1.5 μ G/ml ampothericin B. と LG DMEM
  7. 以下の遠心分離、上澄みを除去し、培養液 (10% 牛胎児血清 (FBS)、50 μ g/mL ゲンタマイシン 1.5 μ G/ml ampothericin B と補われる LG DMEM) 20 mL で細胞ペレットを再懸濁します。390 x g で 5 分間のために再度細胞を遠心し、上清を除去します。
  8. 10 ml の培地 (lg 電子-DMEM 10 %fbs、50 μ g/mL ゲンタマイシン 1.5 μ G/ml ampothericin B) の細胞ペレットを再懸濁し、100 μ m のフィルターを通して細胞懸濁液をフィルターします。
  9. 細胞懸濁液を 50 μ l 添加する (赤血球溶解) の 3% 酢酸/メチレン ブルー溶液 50 μ L を追加、ソリューションをミックス、セルをカウントする 10 μ L を使用します。細胞診断とカウントを実行します。プレート細胞培養培地 (lg 電子-DMEM 30 %fbs、50 μ g/mL ゲンタマイシン 1.5 μ G/ml ampothericin B と) で 40,000 セル/cm2の密度で。
  10. 37 ° c 5% CO2 24 h の湿気のある大気でセルを孵化させなさい。
  11. アスコルビン酸-2-リン酸 (25 μ g/mL) とひと遺伝子組換え繊維芽細胞成長新鮮なインキュベーション、洗浄暖かい (37 ° C) リン酸の細胞緩衝生理食塩水 (PBS) 細胞の残骸を削除し 10 %fbs 文化メディアとメディアを置き換えると、次追加2 (FGF2、1 ng/mL) を考慮します。
  12. 標準 0.25% トリプシン EDTA 溶液 (T175 フラスコ 3 mL) を使用して 90% 合流でサブカルチャー Asc。3-5 分後、10 ml の培地 (lg 電子-DMEM 10 %fbs、50 μ g/mL ゲンタマイシン 1.5 μ G/ml ampothericin B) の 0.25% トリプシン EDTA 溶液を中和します。
    注: の流れ cytometry による一般的な ASC 表面マーカーとトライ系統分化アッセイを以前行ったし、Asc がこの表示プロトコル ASC 特徴21,22を使用してを分離したことを明らかにしました。
  13. 10 ml T175 フラスコ (LG DMEM 添加 10 %fbs、50 μ g/mL ゲンタマイシン 1.5 μ G/ml ampothericin B) 培養液中の細胞を洗うし、遠心分離機 250 x g. 削除で 8 分間細胞の上清 1 ml 培養液中の細胞を再懸濁します。診断とセルをカウントします。
  14. 8,000 セル/cm2の密度で T175 培養フラスコで細胞をプレートします。
  15. さらに使用する前に培地の 10% ジメチルスルホキシド (DMSO) と液体窒素で残りの Asc を凍結します。

2. ASC シート準備

  1. FBS、1 mL でプレコート熱応答性培養皿 (直径 3.5 cm)、細胞を播種する前に少なくとも 30 分の 37 ° C でインキュベーター内料理を配置します。
  2. Asc 標準 0.25% トリプシン EDTA 溶液を用いた 3-5 分 (T175 培養用フラスコの 3 mL) を trypsinize します。Trypsinization 後いずれかの細胞の塊がある場合は、カウントする前に 100 μ m のフィルターを通してセルをフィルターします。
  3. トリプシン溶液を中和する 10% LG DMEM で FBS (T175 フラスコ 10 mL) と 250 x g に 8 分間遠心する細胞懸濁液上澄みを除去し、10% LG DMEM の 1 mL の細胞を再懸濁します FBS。
  4. FBS と温度応答性培養皿をコーティングしたインキュベーターから 37 ° c の温暖化のプレートに皿を移動し、お皿から FBS を削除します。
  5. シード Asc 400,000 セル/cm2 (合計で、3.52 × 106細胞培地皿あたり 2 mL で希釈した)。
  6. 慎重に優しく料理を振ることによって細胞をできるだけ均等に配布します。
  7. 5% CO2と湿気のある大気で 37 ° C で 48 時間培養 ASC シート。
    注: は、ASC シート形成を妨げる可能性がありますまたは形成された ASC シートの早期剥離を引き起こす温度低下を防ぐために Asc を播種後インキュベーターのドアを開いて最小化しようと。

3. 部分的な結腸切除術と大腸吻合

  1. 誘導し、雄 Wistar ラット (250-350 g の間の重量を量る) イソフルランの 1 L/分を維持 (1.5-5%)/oxygen 吸入とブプレノルフィン 0.05 mg/kg を筋肉内注入します。
  2. 動物が全身麻酔下で、反射テストを用いた麻酔の深さを評価します。乾燥を防ぐため目にビタミン A 含有の眼軟膏を適用します。麻酔は手術のために十分に考えられている無菌で毛を剃ると、70% エタノールで 2 回外科領域をスプレーで腹部を準備します。滅菌紙カーテン腹部をおいましょう。無菌技術を使用し、全体の手術中に滅菌野を維持します。
  3. 滅菌手術ブレード サイズ 10 で 5 cm の正中線腹部切開を行い Metzenbaum ハサミで切開部を拡張します。識別およびコロンを外在生理食塩水湿らせたガーゼで腹腔内の残りの部分から、コロンをパックします。右、真ん中を特定し、左結腸動脈、腸間膜、ぶっきらぼうホルステッド蚊を使用して各容器の周りを解剖し非吸収性の編みシルク 4/0 各個別容器を縛る。
  4. 結腸盲腸 aborally 1.0 cm と 0.5 cm 尾側腸間膜動脈の間を分離します。Metzenbaum はさみを使用して健康なコロンを縦断面します。結腸切除後 2 つの長い綿棒遠位結腸を通じてトランス肛門し、近位結腸の最後に導入することにより、結腸の近位および遠位端を一緒にもたらします。
  5. 手術顕微鏡を使用して、1 つレイヤー反転 5 縫合 (非吸収性のモノフィラメント ポリアミド 8/0) を使用して縫合で縫合が不十分なエンド ツー エンドの吻合を作成します。コロンの壁のすべての層の縫合を置き、ノット イレウスを配置します。
  6. ラットを制御または ASC シート グループにランダムに分割します。

4. ASC シート移植

  1. ASC シートの剥離を容易にする、各種の生体内移植前に 40 分室温に冷却する培養皿を許可します。
    注: 剥離後、ASC シートは直径約 2 cm に縮小します。ASC シート生存率は剥離20後少なくとも 3-6 h の高いまま。
  2. 血清 1 ml 無料 LG DMEM 培地を取り外し。
  3. ゆっくり非外科的鉗子で ASC のシートの縁をつかむと、皿側吻合部のラインの上に ASC シートの。
  4. 慎重に ASC を伸ばしシート約 0.25 cm 非外科的鉗子とコロンのまわりにシートのラップを使用して縫合線の上下です。ラップで、背側 ASC シートまでコロンを持ち上げます。
    注: ASC シート付着自発的に吻合部のラインに、組織接着剤を使用する必要があるまたは他の生体材料はありません。コントロール グループは、任意の追加治療を受信しません。
  5. 手袋と楽器を変更したり、綿棒を削除します。腹部にコロンを交換してください。吸収性の縫合糸を使用してを実行している 1 つの層に近い腹部リネア アルバは、ポリグ リコール酸 5/0 を編組。皮下を縫合し、皮膚吸収性の縫合糸を使用してを実行している 1 つの層で一緒に編みポリグ リコール酸 5/0。

5. 術後評価とフォロー アップ

  1. すぐに 5 mL の温かい生理食塩水の皮下注入と動物を術後水分補給します。体温を維持し、動物が胸骨の横臥を維持するために十分な意識を取り戻すまでバイタル サインを監視するための熱ランプの下で動物を配置します。
    注: 手術を受けた動物が他の動物を完全に回復するまでの会社には返されません。回復後、水への無料アクセスと通常ラットの食事を許可します。手術後の痛みを軽減するため 3 日間のすべての 6-8 h 皮下 0.05 mg/kg ブプレノルフィンを管理します。本研究では任意の時に抗生剤を投与しません。
  2. 健康と体重の毎日の臨床評価を取得します。非常に低い健康スコアや重度の体重減少の場合動物は麻酔下にいながら心臓穿刺による急激で安楽死する必要があります。
  3. 術後 3 または日の 7 日目、イソフルランの 1 L/分で再びラットの麻酔 (ブプレノルフィン、なし 1.5-5%)/oxygen 吸入 U 字切開で再手術を行い。腹膜炎、狭窄、線維性の癒着、膿瘍の存在の兆候の腹部をチェックしてください。癒着の重症度をスコアし、腹部、吻合部の地域両方の膿瘍します。
  4. 吻合部を含む、コロンの閉じたセグメント内の空気の吸入による吻合部破裂圧力を決定します。時破裂圧力として最初の空気が漏れる空気の圧力と破裂の場所を記録します。
  5. 各犠牲動物からコロンを削除し、パラフィン埋め込むと 4 μ m 厚いセクションにコロンを切断して次のバッファー 4% ホルムアルデヒド - 大腸吻合を含む - コロンのカットのセグメントを修正します。
  6. 心臓穿刺による急激で吻合セグメントのコレクションの後に直接麻酔中の動物を安楽死させます。呼吸運動、心臓の鼓動の不在と動物の死を確認します。
  7. ヘマトキシリン ・ エオシンと赤、Picro シリウスなど組織化学的染色を行い、人間のミトコンドリア、ラットの血管内皮細胞 (抗 cd34 陽性) と (CD3 +、CD163 +) 免疫系の細胞に対する抗体で免疫組織化学的染色。
  8. コンピューター分析のためのスライドをデジタル化し、動物のグループを比較します。

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結果

ASC シート文化と結腸切除および吻合術の手順を描いたこの研究の流れは、図 1に示すです。図 2は、ASC シート顕微鏡的形態と中および剥離後 ASC シートの巨視的な外観を示しています。図 3は、ASC シート剥離・移植の別の手順を示します。図 4示します吻合と漏洩防止の ASC シートの存在術後 3 日間。

大腸吻合評価のフォロー アップの期間。異なる評価の数字と表のとおりです。対照群と比較して、移植動物群は、頻繁に吻合部裂開や術後 3 日目に漏れ少なくなり術後 7 日目に頻繁に膿瘍形成を示した。対照群と比較して、移植した動物開発しなかった重要な癒着や狭窄形成。表 1は、移植、移...

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ディスカッション

縫合は、プライマリ吻合による結腸切除術後最も重篤な有害事象です。吻合部の中断や漏れを防ぐために最適な技術はまだ欠けています。生体材料の配列のローカル アプリケーションはさまざまな結果25,26,27と、実施されています。細胞療法の目的は、組織置換による組織修復やパラクリン分泌を介してローカル癒しの刺激を容易にすることです。

このラットモデルにおける ASC シート移植は技術的に成功しました。臨床的および組織学的評価は、一次吻合による結腸切除後漏れを減らすことで ASC シートの有効性を実証しました。

大腸吻合する ASC シートの移植、大腸手術における新しいアプローチです。今回、初めて、高密度 ASC シートが移植されました。Asc 細胞シートとして配信のための選択は、従来の細胞移植技術細胞シート技術28<...

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開示事項

著者らは、調査した潜在的な利益相反として解釈される可能性が任意の商業や金融関係の不在を宣言します。

謝辞

著者は、皮下脂肪組織のコレクションの外科の部門のすべての外科医、博士 M.A.M。 Mureau 教授博士 S.E.R. 活発に感謝しています。P. Sukho は、試験の実施中にオランダのフェローシップ プログラム (非営利団体-12/435) からの助成金によってサポートされます。Y. m. Bastiaansen-Jenniskens は、オランダの関節炎財団 (LP11) からの助成金によってサポートされます。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
LG DMEMGibco, Life technologies22320022ASC isolation and culture
Collagenase type IGibco, Life technologies17100-01ASC Isolation
Bovine Serum AlbuminSigma-AldrichA9418ASC Isolation
Fetal wevine serumGibco, Life technologies10270-106FBS, ASC isolation and culture
3% aceticメチレンブルーの酸Stemcell Technologies7060ASC Isolation
GentamicinGibco, Life technologies15750-037ASC isolation and culture
Ampothericin BGibco, Life technologies15290-018ASC isolation and culture
Shaker (Gallenkamp Environmental Shaker Model 10X 400)Akribis ScientificF240ASC Isolation
遠心分離機HettichlabRotina380ASC 分離および培養
リン酸緩衝液 生理食塩水Gibco, Life technologies14190-094PBS, ASC 分離および培養
アスコルビン酸-2-リン酸Sigma-AldrichA8960ASC 分離および培養
ヒト組換え線維芽細胞成長因子 2AbD セロテックAF-100-15FGF2, ASC 分離および培養
トリプシン EDTAGibco, Life technologies25200-056ASC 培養
ジメチルスルホキシドSigma-AldrichD2650-5xDMSO, ASC 凍結
熱応答性培養皿Nunc サーモ科学174904ASC シートの準備
非吸収性編組シルク 4/0B ブラウン21151042手術
非吸収性モノフィラメントポリアミド 8/0B ブラウンG1118170手術
吸収性編組ポリグリコール酸 5/0B ブラウンC1048207手術

参考文献

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