方法論記事

腹膜由来マスト細胞とその機能特性と Ca2 +の単離-イメージングと脱顆粒の試金

DOI：

10.3791/57222

⸱

2018年7月4日

 ,  ,  , 
1Institute of Pharmacology, Ruprecht-Karls Heidelberg University

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ここでは、分離し、マウスの腹腔肥胖細胞を養うプロトコルを提案します。2 つのプロトコルの機能特性評価についても述べる: リリースされた β-ヘキソアミダーゼの比色定量に基づく細胞内 Ca2 +濃度を無料と脱顆粒試験の蛍光イメージング。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

肥満細胞 (MCs)、免疫システムの一部としていくつかの病原体に対するホストを守るために、アレルギーの免疫応答の開始に重要な役割を再生します。MCs の高親和性 IgE 受容体 (受容) だけでなく、他のいくつかの受容体の刺激による IgE がバインドされた表面のクロスリンクすることにより活性化無料の細胞内 Ca2 +濃度の上昇が開始されます ([Ca2 +]私)アレルギー炎症性メディエーターの放出を促進します。これらのシグナル伝達経路に関与する分子の同定は、MC の機能制御を理解するため重要です。この記事で腹膜 MCs (Pmc) のマウスの結合組織型腹膜灌流による MCs の分離と培養のためのプロトコルについて述べる。この方法による様々 なノックアウト マウス モデルから MCs の文化は、MC シグナル伝達経路に関与するタンパク質の同定に有用なアプローチを表しています。また、Ca2 +シグナル MCs。 蛍光ベース監視の [Ca2 +]私の定量化のための重要な技術は信頼性の高い単一セル Fura 2 するイメージングのためのプロトコルについても説明し、よくするアプローチを使用Ca2 +シグナル イベント、MC の活性化にとって重要であるストア作動性カルシウム エントリを含むを研究します。MC 脱顆粒の解析、β ヘキソアミダーゼ リリース アッセイをについて説明します。MCs β-ヘキソアミダーゼで説明されているすべての 3 つ異なる分泌のサブセットの脱顆粒マーカーはで colorigenic 基板との反応によって容易に定量化ことができますはとしての β-ヘキソアミダーゼの培養液中に放出される量を。マイクロタイター プレートの比色定量法。この再現性の高い技術、コスト効果の高い特殊な装置は必要ありません。指定されたプロトコルが高収率を示します全体的にみて、典型的な MC の表面マーカーを表現する MCs の MCs の典型的な形態および表現型特徴を表示して、Ca2 +- のところ再現性の高いレスポンスを発揮イメージングおよび脱顆粒の試金。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MCs は、自然免疫と獲得免疫の間に顕著な役割を果たします。具体的には、MCs は細菌や寄生虫などの病原体の殺害に参加し、潜在的に有毒の内因性ペプチドや毒 (レビュー ガリら20081を参照) のためのコンポーネントも低下します。自然免疫と適応免疫の MCs の生理的役割激論の主題であります。したがって、異なる MC 欠損マウス モデルで実施された試験で多数のデータの不一致アレルギー2MCs の免疫学的機能の体系的な再評価が必要です。成熟した MCs は、大抵集中する組織や皮膚、肺、腸などの臓器で、通常血に小さな数字でのみ発見します。MCs は MC 前駆細胞などの造血前駆細胞に由来し、分化と成熟、微小でほぼすべての血管柄付きの組織1を完了します。T 細胞由来因子インターロイキン (IL)-3 は選択的にその造血前駆細胞3からの生存・増殖・分化多能性人口マウス MCs を促進します。幹細胞因子 (SCF) は、組織の構造細胞によって生成され、MC 開発、生存、移行、および関数4の重要な役割を果たしています。個々 の MCs の特性を合成して様々 なプロテアーゼやプロテオグリカンを格納する能力によって異なります。マウス、いわゆる結合組織型 MCs は解剖学的局在、形態、およびヘパリンおよびプロテアーゼの5の内容に従って粘膜 MCs と区別されます。

MCs の増加は無料のゾル性細胞質 Ca2 + ([Ca2 +]私) が脱顆粒とエイコサノイドの生産のためだけでなく、サイトカインの合成と抗原に対する応答における転写因子の活性化は不可欠ですし、様々 な分泌刺激6。これらの刺激の主要な下流ターゲットはジアシルグリセ ロール (DAG) とイノシトール 1,4,5 三リン酸ホスファチジルイノシトール 4, 5-ビスリン酸を加水分解するホスホリパーゼ C、です。DAG はプロテインキナーゼ C を活性化し、IP3 は、Ca2 +小胞体からのイオンを解放します。これらの店の枯渇は、原形質膜 Ca2 +チャネル作動させたカルシウム エントリ (SOCE) を格納するリードを介する Ca2 +流入をアクティブにします。このプロセスは Ca2 +との相互作用を誘発-センサー、一過性受容体電位標準 (TRPC) チャネルの活性化を介してだけでなく、Orai17と小胞体で間質相互作用分子-1 (Stim1)(レビューを参照してください Freichelらのタンパク質20148) 血しょう膜の。

勉強するには、いくつかの薬理学的これらのチャネルの生理的役割、(チャンネル遮断薬の適用) または遺伝的アプローチは通常使用されます。後者の場合、タンパク質発現の抑制がターゲット mRNA (ノックダウン) によって達成されるゲノム DNA が細孔の形成 (ノックアウト) チャネルのサブユニットをコードするエクソンのグローバルまたは組織固有の9削除と編集。これらのチャンネルに十分な特異的なブロッカーの可用性は制限されています。さらに、ノックダウンの方法は、例を使用して、その有効性の注意深い制御を必要があります。 西部、ブロット分析、および多くの場合対象となるチャネル蛋白質のための特定の抗体の使用不能によって妨げられています。したがって、ノックアウト マウス モデルの使用は、そのような分析のためのゴールド スタンダードとしてみなされます。MC の機能の調査のため最寄りの in vitroモデルは分離前のヴィヴォ完全に成熟した個体としては、Pmc の栽培 (MCs体外、例えばから差別化ではなく、骨髄細胞)10。.MC 関数体外受容と β ヘキソアミダーゼの刺激を研究にも使われている骨髄由来 MCs (BMMCs) に比べてリリース 8 倍と 100 倍に増資 Pmc、それぞれ。この記事では、純粋な結合組織の数が多いを培養 2 週間タイプ MCs、さらなる分析のための十分な後に取得することができますマウス Pmc の培養と分離のメソッドについて説明します。

開発及び遺伝的コード化カルシウム指標の適用の最近の進歩にもかかわらず、使用状況限られている標的細胞に遺伝子の配信の難しさによって具体的には、一次培養 MCs など専門性の高い細胞。さらに、[Ca2 +]私の測定のための蛍光プローブのこのグループには、レシオ メトリック染料と高ダイナミック レンジまだ欠けています。これらの理由から、最寄りレシオ メトリック [Ca2 +]私の測定法はまだ蛍光染料「Fura 2」11の使用です。

現在、MC 活性化の評価のために最も一般的に使用されるアプローチと脱顆粒が β-ヘキソアミダーゼ活性の測定。Β-ヘキソアミダーゼ、アレルギーの調停は、MCs12から一定の割合でヒスタミンが分泌される MC 顆粒コンポーネントの 1 つです。Β-ヘキソアミダーゼは、マイクロ プレートの比色定量法で容易に検出できるが colorigenic 製品の測定可能な量を生成する特定の基質との反応によって容易にかつ正確に測定できます。この資料では、この様々 な刺激への応答で Pmc の脱顆粒の解析手法の応用が報告されます。

高親和性の原形質膜 IgE 受容体 (FcɛRI) の集計は MCs の分泌顆粒周囲の細胞外領域のコンテンツのリリースにつながる多彩な細胞内シグナル伝達経路をアクティブにします。特異抗原に加えて、他の多くの刺激は免疫調節メディエーター、補体によりなどの多様な配列を解放する MCs をアクティブ化できます (e.g、C3a と C5a)13、血管収縮ペプチド エンドセリン 1 (ET1)14。、数々 のカチオン性物質と pseudoallergic 反応の刺激薬として (e.g。、icatibant)15 MRGPRX216へのバインド。MRGPR 誘起 MCs 脱顆粒反応に関与する細胞内シグナル伝達経路の FcɛRI を介した細胞内シグナル伝達; と比較して特徴は不十分これらの経路は、受容体同定16後最後の数年間17の間に集中的に調査される開始。主として、カルシウム項目の後に MRGPRX2 刺激に関与する細胞膜のイオン チャネルは、理解されるに残る。したがって、本稿はまた細胞内カルシウム シグナルに焦点を当て、MRGPR アゴニストと MCs の脱顆粒が刺激されます。

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プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

動物のすべてのプロシージャは (カールスルーエ地域評議会によって正式に承認された) 実験動物の管理と使用のためのドイツの法律ガイドラインに従って行われました。

1. PMC 分離および腹腔内洗浄による栽培

1氷
210 mL 注射器
327 G 針
420 G 針
5発泡スチロール ブロックとピン
6コレクション チューブ (50 mL プラスチック遠心管)
770% エタノール
8RPMI 培地 (前に冷え、氷で保たれる)
9PMC 媒体: RPMI 培地 + 20% の FCS (胎児の子牛の血清) + 1% ペニシリン ストレプトマイシン溶液 (ペン-連鎖球菌)
10ダルベッコ リン酸緩衝生理食塩水 - DPBS (なしで Ca2 +と Mg2 +)
11培養フラスコ (25 cm)
12成長因子在庫ソリューション (IL 3: 1 μ g/μ L。SCF: 2.5 μ g/mL)
13血清ピペット (10 mL)
14ピペット先端不稔 (20-200 μ L)
15検定
16ベンチ遠心
17ハサミ ・鉗子
18マウス用 CO2チャンバー
19オープン滅菌フード
20滅菌カバーを閉
21セル インキュベーター (37 ° C、5% CO2)
22ピペット (20-200 μ L)

ステップ 1 の第 1 表: 材料。

  1. 腹腔内洗浄による PMC 分離
    1. 細胞分離前に表 1に示す材料を準備します。
    2. PMC の分離のための 14 週齢雄マウスに 8 を使用します。CO2吸入によるマウスを安楽死させるし、反射の損失によって死を確認します。70% エタノールでマウスをスプレーし、ピン (背側を下) を使用して泡のブロックにそれを修正します。鈍い刃のはさみを使用してマウスの腹側の皮膚を削除します。腹腔内の損傷を防ぐ。
      注: プロトコルを使用して通常この C57BL/6 n 系統の遺伝的背景を持つマウスのため。
    3. 7 mL の冷たい RPMI 培地の 27 G 針、10 mL シリンジを用いた腹膜キャビティ内の空気を 5 ml を注入します。腹膜に慎重に針を押して、任意の臓器を穿孔しません。臓器穿孔のリスクを減らすための副睾丸脂肪の地域スポットを使用します。
    4. 注入後、RPMI 培地に腹腔細胞をデタッチするのには 1 分間マウスを振る。内臓にダメージを与えると、血液と腹腔内の汚染を避けるためにマウスをあまりにも強く振らないでください。
    5. 新しい 20 G カニューレとそれを装備して 10 mL 注射器を再利用します。1 つの側面に発泡ブロックを傾斜してやさしく反対側から中誤嚥しやすくし、ベンチにタッピング内部器官をシフトします。20 G 針を挿入、ベベル、優しく、ゆっくりと腹からの流体を吸引内部器官によって目詰まりを避けるために (~0.5 な mL/秒)。できるだけ (通常 5-6 mL) 同様に多くの流体を収集します。
    6. 注射器から針を除去し、氷の上コレクション チューブで収集した細胞懸濁液を転送します。目に見える血液汚染がある場合は、サンプル チューブを破棄します。
    7. ~ 300 × gで 5 分で細胞懸濁液をチューブを遠心します。無菌フードの下で上清を吸引します。風邪 (4-10 ° C) の 4 mL にサンプル ペレットを組み合わせる各マウスの PMC の中、25 cm2培養用フラスコへの転送細胞懸濁液。最終濃度 10 ng/mL に成長因子 IL 3 と SCF および 30 ng/mL をそれぞれ追加します。インキュベーター (37 ° C、5% CO2) のセルを含むフラスコを置き、次の手順まで 〜 48 時間インキュベートします。
  2. PMC の文化
    1. 日 2 (分離後 ~ 48 h): 中型の変更
      1. 削除するには、清と非付着性細胞 (赤血球と死んだ細胞) はフラスコの端にパスツール ピペット チップを置き、フラスコをほぼ水平に持ってフラスコから培地を吸引します。マウスごとに予め温めておいたの PMC の中の 4 つの mL を追加します。成長因子 IL 3 に追加 (10 ng/mL) と SCF (30 ng/mL)。インキュベーター (37 ° C、5% CO2) のセルを含むフラスコを配置します。
    2. 9 日目: セルの分割
      1. 細胞培養用フラスコから 50 mL のプラスチック遠心チューブに細胞懸濁液を転送します。3 回 10 mL 加温 (37 ° C) ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水 (DPBS) とフラスコを洗い、同じ 50 mL 中剥離細胞の細胞懸濁液を集めてプラスチック遠心管。検定によって細胞濃度をカウントし、セルの合計数を計算します。
      2. ~ 300 × gで 5 分で細胞懸濁液を遠心し、上清を吸引します。予め温めておいた PMC 培地濃度 1 x 106セル/ml セルを取得する (37 ° C) でペレットを回復します。細胞懸濁液を新しい 25 cm2培養用フラスコに転送します。下部に付着線維芽細胞と古いフラスコを破棄します。
      3. 成長因子 IL 3 に追加 (10 ng/mL) と SCF (30 ng/mL)、インキュベーター (37 ° C、5% CO2) のセルを含むフラスコを配置。
    3. 12-15 日: セルの測定
      1. FcɛRI 受容器の刺激ですべての実験が予定されている場合は、標準培地の IgE 抗 DNP の 300 ng/mL で一晩細胞を前処理します。ステップ 2 またはステップ 3 に進みます。

2. Pmc の蛍光細胞内遊離カルシウム濃度測定

  1. 測定の前に表 2に示す材料を準備します。またから成るイメージ投射のセットアップの準備: 倒立蛍光顕微鏡;目的: 40 X 1.3/油;Fura 2 フィルターを設定;CCD カメラ。励起光源;画像取得プログラム;重力与えられるソリューション アプリケーション システムです。
1PMC (12-15 日古い) 1 x 10 の6セル/mL
2コンカナバリン A
3Fura 2 AM
4プルロニック F-127 20% 溶液
5カバー スリップ メガネ ラウンド;ø 25 mm;第 1
6DNP HSA (ジニトロフェノール ヒト血清アルブミン) 原液
7抗 DNP 抗体 (IgE) 原液
8底が平らなプレート (12 ウェルズ)
9複合 48/80 原液
10よく部屋をイメージングをカバーします。
11検定
12ピペット (20-200 μ L)

ステップ 2 の表 2: 材料。

  1. フラ 2 の画像の準備
    1. 診断を使用してセル数を実行し、1 x 106セル/mL に細胞濃度を調整します。Pmc の植民地を分割するには、(3 ~ 5 回)、細胞懸濁液 1 mL ピペット先端を軽くピペッティングします。
    2. Ca2 +の準備-食塩 HEPES を含むバッファー (Ca2 +-HBSS) 135 mM NaCl、KCl 6 mM、2 mM CaCl2、1.2 mM MgCl2、10 mM HEPES、12 mM グルコースから成る。3 M NaOH で 7.4 に pH を調整します。
    3. コンカナバリン A を準備各 25 mm にコンカナバリン A 液 (0.1 mg/mL H2O) のピペットの 1 滴スライドに塗ったラウンド無菌フードの下でカバーのガラス。少なくとも 1 分カバー スリップに水滴を残すし、ピペットと 45 分は、商工会議所をイメージング ゴム コンカナバリン A 処理カバー スリップを慎重に押して、カバー スリップが空気乾燥させるとともに、ソリューションの大部分を削除する (テーブルの材料を参照) まで彼らは顕微鏡検査の部屋の映像を取得する接続します。
      注: 別の方法としてポリ-L-リジン コーティング スライドを使用できます。
    4. 蛍光 Ca2 +染料フラ 2 を溶かすジメチルスルホキシド (DMSO) で午前 (1 mM)。光から保護されたこのソリューションを保存します。
    5. フラ 2 を希釈で Ca2 +午前原液 - HBSS「読み込みバッファー」を準備するために 5 μ M の最終的な集中に。5 μ L/ml の DMSO で 20% プルロニック F-127 の補足します。
    6. PMC 細胞懸濁液 500 μ L で「読み込みバッファー」のミックス 500 μ l。イメージング室に混合物をピペットし、暗闇の中で室温で 20-30 分のための細胞を孵化させなさい。
    7. 重力与えられる刺激プロトコルに従ってさまざまなソリューションのアプリケーション システムを設定します。Ca2 +-HBSS 溶液 40 mL をシリンジ 1 の補足、2 Ca2 +-HBSS 100 ng/mL 大日本印刷を含む溶液の 40 ml を注射器、3 Ca2 +-HBSS 50 μ g/mL 48/80 の化合物を含む溶液の 40 ml を注射器、4 の 40 ml の注射器名目上 Ca2 +-無料-HBSS ソリューションとシリンジの名目上 Ca2 +40 ml 5-無料-HBSS 溶液 2 μ M アーゼファミリー。
    8. 浸漬油の小滴を置くことによって 40 X 高絞り油浸対物レンズを準備します。
    9. 倒立顕微鏡のステージ上には、アプリケーション システムをマウントします。アプリケーション システムに読み込まれた細胞イメージングの商工会議所を入れて、録音中に動きを防ぐためにします。透過光をオンにし、細胞に焦点を当てます。
    10. リンスの細胞 Ca2 +-HBSS 重力供給アプリケーション システムを使用してバッファーを 3 回。
    11. Ca2 +の細胞をインキュベート - HBSS Fura 2 5 分午前解消エステル化。
    12. リンスの細胞イメージングを開始する前に 1 つのより多くの時間、蛍光色素をリーク可能性がありますを削除します。
  2. 細胞イメージング
    1. 生理・ アクイジション ・ モードで取得するイメージング プログラムを開始します。セットアップ ウィンドウを開き、フォーカスと最適な捕捉時間を調整 (同じ 340 で励起される nm 380 nm と通常 50-150 ms 間の範囲)。
      注: フラ 2 の露出を最小限に抑える、色素の退色を避けるために任意の光を読み込むセル。
    2. 参照画像をイメージし、利益 (率 ROI) の領域としてセルをマークします。ない細胞が存在し、それを背景として定義領域で最後の投資収益率をマークします。
    3. セットアップを完了し、5 s 取得率と測定を開始します。
      注: セル交互点灯励起光 340 nm と 380 nm、および放出される蛍光 (> 510 nm) CCD カメラを使用して収集されます。蛍光信号 F340 nm F380 nm と比 (F340 nm/F380 nm) のイメージは、3 つのウィンドウに表示されます。個別・ ロワの蛍光強度の経時変化のグラフを意味値が継続的に表示されます。
    4. 実験の設計に従って適切なサイクル数にソリューションを追加します。
      1. [Ca2 +]私は、抗原誘発メジャー昇格する図 2、2 bに示すようは、サイクル 20、150 サイクル後の録画を停止した後シリンジ 2 ソリューションを適用します。
      2. [Ca2 +] の複合 48/80 誘起の標高を測定するには、i、図 2Cに示すようはサイクル 20、および 150 サイクル後の録画を停止後シリンジ 3 ソリューションを適用します。
      3. 図 2Dに示すように、[Ca2 +]私、SOCE によって誘発の標高を測定するには、サイクル 10 後シリンジ 4 ソリューションを適用、サイクル 70 後シリンジ 5 ソリューションを適用、サイクル 120 後、シリンジ 4 ソリューションを適用サイクル 150 後、シリンジ 1 ソリューションを適用し、220 のサイクルの後に記録を停止します。
    5. 測定を終えた後結果を変換比の値とすべての投資収益率のためのバック グラウンド補正なしと同様、両方の励起波長とバック グラウンド補正なしの測定強度を含む比率表すべての測定の時点。取得プログラムで連続してボタンを押し:「開始カッター」、「すべてをマーク」、「すべてを変換」、「生理測定」、"Ok"Ok"。テーブルとオフライン解析のための画像のスタックとしてファイルを保存します。

3 Pmc の β ヘキソアミダーゼ リリース測定

1PMC (12-15 日古い) 1 x 10 の6セル/mL
2抗 DNP 抗体 (IgE) 原液
3DNP HSA 原液
4複合 48/80 原液
5イオノマイシン
696 ウェル プレート、v 字底
796 ウェル プレート、底が平らです
8プラスチック製遠沈管 (15 mL)
9血清ピペット
10セル インキュベーター (37 ° C、5% CO2)
11ベンチ遠心
12光学濃度測定用マイクロ プレート リーダー
13マルチ チャンネル ピペット (20-200 μ L)
14検定

ステップ 3 の表 3: 材料。

  1. 測定の前に、表 3に掲げる材料を準備します。
    注: β-ヘキソアミダーゼの刺激後 MCs からリリースは p-ニトロフェノールと N-アセチル-D-グルコサミンに p-ニトロフェニル-アセチル-D-グルコサミン (林) を加水分解します。Β-ヘキソアミダーゼのサンプルの量が形成される p-ニトロフェノールの量に比例です。「停止ソリューション」の高 pH では、p-ニトロフェノール完全に脱プロトン化した p-nitrophenolat として存在し、、405 で光吸光度によって検出することができます nm。
  2. 130 mM の NaCl、5 mM KCl、1.4 mM CaCl2、1 mM MgCl2、10 mM HEPES、5.6 mM グルコースおよび BSA の 0.1% を含むタイロード液を準備します。3 M NaOH で 7.4 に pH を調整します。
  3. タイロード液に 1% トリトン X-100 のボリュームを追加することによって溶解ソリューションを準備します。
  4. 200 mM グリシンから成るストップ ソリューションを準備し、10.7 NaOH で pH を調整します。
  5. 4 mM の最終的な集中に 0.4 M クエン酸で林を溶解することにより林 (2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranoside 4-ニトロフェニル) ソリューションを準備します。
  6. 細胞アッセイに必要な量を計算する (重複でアッセイを行う)。ウェルあたり 200,000 Pmc を使用します。ネガティブ コントロール (DNP など分泌促進物質や化合物 48/80 なしタイロード液) として 2 井戸を使用とポジティブ コントロールとして 2 井戸 (タイロード液 10 μ m イオノマイシン) すべての遺伝子。
  7. 15 mL プラスチック遠心管にセルを転送タイロード液と 15 mL にボリュームを調整し、200 × gで遠心分離機の 4 分パスツール ピペットで上澄みを除去し、2 × 106セルにタイロード液で細胞を再懸濁します/mL です。
  8. 96 ウェル V 底ウェル プレートによくあたり細胞懸濁液を 100 μ l 添加を転送します。(図 3Aに示すピペッティング方式) によると各ウェルに刺激または制御ソリューションの 25 μ L を追加します。37 ° C と 5% の CO2の 45 分のセルを孵化させなさい。
  9. 5 分間氷の上 96 ウェル プレートを配置することによって、反応を停止します。その後、120 x gで 4 分の 4 ° C でプレートを遠心分離機します。フラット底 96 ウェル プレートにマルチ チャンネル ピペットを使用して上清の 120 μ L を転送し、氷の上に置きます。慎重に細胞ペレットに触れることを避けるが、完全に上清を吸引します。
  10. 細胞ペレットに換散バッファーの 125 μ L を追加します。室温で 5 分間細胞ペレットを孵化、孵化後繰り返しピペッティング (約 5 倍) によってそれらを再懸濁します。
  11. 新しいフラット底 96 ウェル プレートの必要な井戸の中林ソリューション (4 mM) の 25 μ L をピペットします。準備された林ソリューションとして各細胞ライセートの 25 μ L にそれぞれの上清から 25 μ L を追加します。
  12. 37 ° C で 1 時間反応バッチを孵化させなさい、孵化後、反応を停止する各ウェルに停止液を 150 μ L をピペットします。
  13. デュアル波長設定を使用して、405 でマイクロ プレート リーダーでプレートを分析自動バック グラウンド減算参照 630 nm nm。取得プログラムでチェック ボックス「リファレンス」と「吸光度」プログラム要素メニューを選択"630 nm」ドロップ ダウン リストから。サンプルの光学濃度が高すぎる場合は、再測定する前にプローブの適切な希釈を準備します。
  14. 次の式に従って β ヘキソアミダーゼ リリースの割合を計算します。
    figure-protocol-1
    [清] が背景でリリース [%] が特定のベータ版ヘキソアミダーゼのリリースの割合は、上澄みの吸収を修正し、[溶解]、バック グラウンド対応する細胞ライセートの吸収を修正します。

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結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pmc は腹腔内洗浄によって 3 の野生型マウス (C57BL/6 n) から隔離され RPMI 培でさらに培養 1% と 20% の FCS 滅菌下で成長因子 (IL-3 10 ng/ml) と 30 ng/mL で SCF の存在下でペン球菌加湿条件37 ° C と 5% の CO2。媒体は、細胞分離後 2 と 9 の日に変更されました。細胞の形態は、伝送を用いて解析した DIC イメージングの光 (図 1A, Bを参照)。セルのコントラストと粒度は、良い細胞生存率を示した。これらの条件の下で培養 2 週間後 1.5 倍の 10 の7セルの同質な人口を求めた。共同と FITC 標識抗 IgE 抗体で染色細胞と PE と抱合抗 C-kit 抗体の流れフローサイトメトリー解析では、FITC 陽性と 99.8 %pe 陽性細胞 (図 1C) の ...

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ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MC モデルは、三菱商事の脱顆粒、走化性、接着、同様 MC 活性化に関与する細胞内のシグナル伝達経路を解明する研究を正常に使用できます。臍帯由来不死化線 (LAD2 および HMC1) など人間の MCs 使用人間 MCs のモデルいくつかの研究者は血 (CD133 陽性) 前駆細胞と末梢血前駆細胞 (CD34 陽性)。他の齧歯動物の不死化など、MC のモデル (ラット好塩基性白血病 RBL-2 H 3 MC ライン) またはプライマリ培養を好む (マウス骨髄由来 MCs BMMCs、Pmc) モデル。マウスのプライマリ MCs は、特定の遺伝子の符号化された蛋白質の生理機能の探索に金標準的なアプローチは、多数の「ノックアウト」マウス モデルで MC 関数を分析する使用できます。十分な選択性と効力の薬理学的ツールの赤字は、MC 活性化18によるシグナル伝達のメカニズムの調査のため特に貴重なメソッドをなります。Pmc のマウス、成熟した形態と高粒度を示す結合組織表現型です。彼らはのみ BMMCs のような受容の抗原の架橋にも応答しないが、複合 48 エンドセリン 1 などいくつか追加の受容体...

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者が明らかに何もありません。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者は、肥満細胞作製、培養での技術支援のジュリア Geminn を認識したいと思います。この作品は、イ共同研究センター (TR SFB) 152 によって支えられました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
RPMIMedium Thermo Scientific21875034
DPBSSigma-Aldrich14190144
FCSThermo ScientificR92157
IL-3R&D Systems403-ML
SCFThermo ScientificPMC2115
Concanavalin ASigma-AldrichC2272
Fura-2 AM サーモフィッシャーサイエンティフィックF1221
ロニックF-127シグマアルドリッチP2443
DNP-HSA Sigma-AldrichA6661
抗DNP抗体 シグマ・アルドリッチD-8406
ペンストレップサーモサイエンティフィック15140122
コンパウンド 48/80 Sigma-AldrichC2313
4-(1,1,3,3-テトラメチルブチル)フェニル-ポリエチレングリコールSigma-AldrichX100
4-ニトロフェニル 2-アセトアミド-2-デオキシ-&β;-D-グルコピラノシドSigma-AldrichN9376
CoverWell イメージングチャンバーSigma-AldrichGBL635051
96-ウェルプレート、V字型底部 Corning3896
96ウェルプレート、平底Greiner Bio-One655180
マイクロタイタープレートリーダー、i-controlソフトウェア付き TecanNano Quant, infinite M200 Pro
フラットボトムプレート Greiner Bio-One655180
イオノマイシンSigma-AldrichI9657
50 mL プラスチック遠心分離管Sarstedt62.547.254 
培養フラスコ (25 cm)Greiner Bio-One69160
Cover slips glasses round; ø 25 mm;No. 1MenzelCB00250RA1
血球計算盤VWR631-0696
倒立顕微鏡ツァイスオブザーバー Z1
Objectiv Fluar 40x/1.3 オイルツァイス440260-9900
HC フィルターセット フラ 2 AHFH76-521
CCDカメラツァイスAxioCam MRm 
単色光源サッター機器ラムダ DG-4
イメージング取得プログラムZeissAxioVision 4.8.2 
重力供給溶液アプリケーションシステムカスタムメイド4チャンネル
15 mL プラスチック遠心分離管Sarstedt62,554,502
ベンチ遠心分離機HeraeusMegafuge 1.0R
プル

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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