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方法論記事

冠動脈バイパス移植手術によって治療慢性心筋虚血の外科豚モデル

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DOI:

10.3791/57229

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2018年3月27日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, University of Minnesota, 2Cardiology, Minneapolis VA Medical Center

この記事について

サマリー

このプロトコルは、地域の異常の結果、梗塞、冬眠の心筋層として知られているが発生しない慢性的な単一容器の虚血の外科大動物モデルを提示します。慢性虚血の確立、次の動物は、ポンプをリマ若者冠動脈バイパス術後虚血組織血行再建の適応と扱われます。

要約

心機能を損なうが、梗塞が発生しない慢性心筋虚血は、冬眠の心筋層 (HM) と呼ばれます。冠動脈疾患 (CAD) 患者の大規模な臨床サブセットがある HM は、機能障害を引き起こすだけでなく、不整脈と将来の心イベントのリスクが高いにそれらを置きます。この条件の標準治療は血行再建術が、この不完全な療法であることが示されています。前臨床心臓研究の大半は、この主に恵まれなかった慢性虚血患者のサブセットを残しての心筋虚血、梗塞モデルについて説明します。研究で、このギャップに対処するためとして開発を進めて豚、冬眠の心筋層の特徴と再現性の高いモデル豚が人間の心臓病のための理想的な並進モデル。このユニークな疾患モデルを作成するに加えてブタの冠動脈バイパス手術の臨床的治療モデルを最適化しています。これにより正確に心臓病のバイパス手術の効果し同様に追加または代替療法を調査できます。このモデルは手術、動脈左前下行枝 (LAD) は若い豚の収縮をはめ込むことによって単一の容器の狭窄症を誘導します。豚が大きくなると、括約筋は漸進的な狭窄、地域機能が障害を伴う慢性虚血の結果、組織の実行可能性を維持するを作成します。冬眠心筋表現の確立、次の診療所で患者のための金本位治療を模倣した冠動脈バイパス術後虚血領域血行再建の適応を実行します。

概要

冠状動脈性心臓病 (CHD) アメリカ合衆国1推定 1550 万人に影響し、グローバルに死の主要な原因の一つです。冠動脈疾患に関連する死亡率は、ここ数年でダウンして、発生率、患者と医療制度の負担まま高1。深刻な CAD の主な治療法は、血行再建術、生存率を改善し、狭心症2,3、4を減らすです。ただし、心機能は多くの場合特に増加する負荷の下で、押したままにしておくし、心不全5,6に進むことができます。慢性虚血の冠動脈バイパス手術 (CABG) の臨床試験は、生存や症状の改善が 8-10 7,8の放出割合ショーのみささやかな改善点を示しています。慢性心筋虚血の私達の革新的な特徴の豚のモデルは、進歩的な血管狭窄症臨床の CAD のモデルです。我々 は血流9の段階的な削減の結果心筋収縮力の減少を示しています。心筋梗塞ではない行われずこのシナリオで実行可能に残ることができます。回復は、結果が変数でもタイムリーな血行再建が可能です。慢性的なまま実行可能な心筋の虚血は血流の低下によって特徴付けされている剰余室収縮予備能との残りの関数は、HM と呼ばれているし、治療冠動脈バイパス手術が必要です。HM の血行再建術は、収縮の機能を復元する必要があります、不完全な8,10を回復には実験と臨床観察を示しています。

HM の存在下で機能不全心筋局所血流11の減少はまだ実行可能の存在によって特徴付けられます。にもかかわらず障害収縮と HM、安静時代謝活動は変力作用刺激12特別法の機能と代謝を示すことができます。病気の広いスペクトルを包含して、冠動脈疾患患者の大半で疑われて HM。このプロトコルでは臨床シナリオを模倣している若者の動脈に左内胸動脈 (リマ) で回避される HM の私たちの確立された豚のモデルを示しています。心外膜の架橋担保を持たないので、豚は他の大型動物を心臓病の優れたモデルを提供します。これにより局所虚血13の結果一人の若者の狭窄です。

ここでは、若者の動脈で単一血管狭窄を作成することで豚の冬眠の心筋層を誘導する手術の方法について述べる.慢性虚血が確立されたら (8 週間ポスト若者収縮のインプラント)、豚モデル HM の臨床治療を再作成の方法を述べる: オフポンプ冠動脈バイパス術。これらの手術の方法は、だけでなく慢性の心筋虚血の臨床的に関連するモデルを勉強するが、また心筋虚血のための潜在的な代替または補助療法をテストし同様、心筋虚血に対するバイパス手術の効果を調査に使用できます。

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プロトコル

すべての動物の研究は、動物介護制度とミネアポリス VA の医療センター、ミネソタ大学の使用委員会によって承認されました。用や実験動物の世話現在の国立衛生研究所のガイドラインに従ってください。

1. 休止状態の手術

  1. 動物の準備
    1. 冬眠の心筋層、5 週間の古い、女性の使用、平均重量 9.2 kg で 8 〜 10 キロの範囲内の重量を量るヨークシャー豚のモデルを作成します。
    2. 術前の状態が監視、手術前 3 日以内動物の重量を量る。
    3. 12 h のための動物を麻酔を開始する前に高速です。水は空腹時の動物のすべての回で使用できることを確認します。
    4. 手術前に SR ブプレノルフィン 0.18 mg/kg IM 24 h を与えます。
  2. 誘導
    1. 6.6 mg/kg チレタミン チレタミンとキシラジン カクテル筋肉に与えられた動物を落ち着いた。薬のための 5 〜 15 分許可有効にするカクテル。
    2. IV カテーテル留置の 70% イソプロピル アルコールを 3 回を拭くことによって無菌耳静脈を準備します。
      注: 耳静脈が適切でない場合別末梢静脈があります (すなわち頭部) を使用します。
    3. 角膜の乾燥を防ぐために両方の目に眼軟膏を適用されます。
    4. 必要に応じて、プロポ フォール IV の 1-2 mg/kg を投与することによって麻酔または気管挿管を可能にする 3 L/分の酸素および 3% イソフルランとマスクします。
      注: 瞬目反射または顎トーンが存在しない場合は、動物を適切に麻酔と見なされます。
    5. 動物の適切なサイズの気管内チューブを挿管します。
  3. 手術
    1. 動物を麻酔すると、一度の手術を左胸部領域を剃る。
    2. 1-4 L/分、イソフルラン麻酔外科平面を維持するために必要に応じて 3.0% と 1.0 の間で分セット酸素あたり 10-15 呼吸で換気を開始します。
    3. 動物の監視装置を配置します。監視装置は心電図、血圧、温度、およびパルスオキシ メーターを含める必要があります。
    4. IV カテーテルを 5-10 mL/kg の割合で 0.9% 食塩を点滴に接続/h。
    5. 無菌手術時手洗い法、FDA と左胸部を準備します。
    6. 深さを評価麻酔 5-15 分ごとに記録基準のバイタル サイン (心拍数、心電図、SpO2NIBP、ETCO2と温度) 15 分毎。
      注: 瞬目反射または顎トーンが存在しない場合は、動物を適切に麻酔と見なされます。
    7. 動物の右側を下に置くことと場所滅菌の滅菌フィールドの第 3 肋骨領域を中心とした肩甲骨を背骨から胸の左側にあるをカーテンします。
      注: 滅菌フィールドには継続 6 リブ スペースに胸骨頭側腋窩領域を含む左フロントのショルダーが含まれます。
    8. グルコン酸クロルヘキシジンなど FDA 承認された手術法や、ヨウ素手術時手洗い法を 2 分間ターゲット パターンを使用してフィールドをやさしくスクラブします。
    9. リンス水でフィールドし 2 分すすぎ洗浄の間に水と手術野の上として FDA 承認された方法で 2 回以上洗って滅菌タオルまたは 4 × 4 cm ガーゼでふきます。
    10. ヨウ素溶液をスプレー領域と滅菌ドレープと (手術野) を除く全体の動物をドレープします。楽器、ガウン、およびプロシージャのカーテンを滅菌するのに滅菌蒸気やガス滅菌を使用します。
    11. 第 2、第 3、第 4 肋骨 0.5 %bupivicaine の 0.3 mL を使用して肋間の神経ブロックを管理します。
    12. 胸を開く前にセファゾリン IV の 125 mg を与えます。
      注: サッキニルコリン 1.5 mg/kg IV は胸腔内のオープン時に外科医の要求あたりの筋肉の動きを抑える麻痺剤として与えられる場合があります。
    13. 左開胸による心臓を公開します。心の操作の前に 2 mg/kg IV 不整脈を防ぐためにリドカインの塊を与えます。モノポーラ電気焼灼で作る側の第 3 スペース開切開。切開を腋窩領域の約 10 cm です。 肌と胸の空洞にエントリを許可する基になる筋肉を切開する使用、焼灼する肩甲骨の頭蓋の側面から拡張する必要があります。
    14. Finochietto リブ リトラクターを配置し、肺を撤回する第 3 肋で胸膜腔を入力します。
    15. 鋭く心膜を切開し、2-0 polyglactin 宿泊縫合糸を使用して、若者の動脈と静脈を公開する側に引き込みます。ガーゼに覆われたヘラ リトラクターと左心耳を撤回します。
    16. アイリスはさみを使用して、若者に外膜を開きます。
    17. ぶっきらぼうを解剖、若者と回旋動脈の接合部の遠位の若者動脈約 1 cm の約 0.25 cm 部分。若者を取り囲むように直角クランプを使用します。
    18. 任意のテンションをかけることがなく 2 つ動脈周囲 4-0 ポリエステル縫合糸を配置します。
    19. 場所容器遮蔽せず最初の対角線に近位の若者に 1.5 mm の内部の直径とプラスチック製 c 形収縮。
    20. 若者を取り囲むポリエステルの関係 2 つの 4-0 で固定します。
    21. 緩く簡単な中断パターンで 2-0 polyglactin 縫合糸を使用して膜を閉じます。
    22. 肋間筋層が閉じている間に、胸から空気を除去する呼吸ホールドを実行します。水の 20-30 cm の適切な範囲内の圧力を維持し、完了時に解放する麻酔器の気道圧マノメータを注意深く監視します。
      注: これは術後の期間で胸管の必要があります。
    23. 2-0 および 3-0 吸収性縫合糸を使用して標準的な方法で筋肉と皮膚の層を閉じます。
    24. 切開で皮膚縫合用の皮膚接着剤を使用します。
    25. 1 mg/kg 筋肉内の手順の最後で切開の長さに沿って複数のサイトでブピバカインの総線量を管理します。メロキシカムを管理リカバリ領域をトランスポートの前に SQ の 0.2 mg を kg。
    26. 皮膚層が閉じられますと、人工呼吸器を動物を引き離します。
    27. それは自発的に呼吸できるし、リターンを保護反射開始まで麻酔器に接続した動物を残します。
    28. 動物は、その気道を保護するために飲み込むことができるまでは、気管内チューブを削除しないでください。
    29. 切開トリプル抗生物質軟膏と滅菌、非付着性ドレッシングを適用します。
  4. 手術後
    1. レコードの心拍数、呼吸数、体温、粘膜色 15 分毎、動物は、胸骨の位置に自力で保持するまで。
    2. 放置しないでください、動物までそれを持ち上げて、頭を保持することができ、自力で立つことができます。
    3. メロキシカム (0.2 mg/kg) を皮下に与えます。
    4. 徐放性ブプレノルフィン最初の術前投与の後 6 h を管理します。
    5. それは清潔で乾燥したままの場合 3 日前までの切開にドレッシングを残します。それに汚れてくる場合はドレッシングを交換します。
    6. 痛みのレベル、一般的な幸福と手順 5 の日のための切開の状態を監視します。
      メモ: 子豚のしかめっつらスケール、術後これらの動物の痛みのレベルを評価するために利用できる14。画期的な痛みのため一日一回必要に応じて半分の線量メロキシカムを使用します。
    7. シングル ・家活動を制限し、傷を癒すを許可する 5 日間の回復期間中に動物。
    8. 完全に冬眠心筋表現型を開発する 8 週間かかります。

2. 血行再建術またはポンプ バイパス オフ

  1. 動物の準備
    1. 手術前 3 日以内動物の重量を量る。
    2. 手術前に 12 時間のための動物を高速です。水は空腹時の動物のすべての回で使用できることを確認します。
    3. 手術前に徐放性ブプレノルフィン 0.18 mg/kg 筋肉内 24 h を与えます。
  2. 誘導
    1. 6.6 mg/kg チレタミン チレタミン/キシラジン カクテルで動物を筋肉内に落ち着いた。5-15 分、鎮静後はカテーテル留置の無菌耳静脈を準備します。
      注: 耳静脈が適切でない場合別末梢静脈があります (すなわち頭部) を使用します。
    2. 両方の目に眼軟膏を適用されます。
    3. 1-2 mg/kg の IV のプロポ フォールを用いた麻酔を誘導します。
    4. 動物の適切なサイズの気管内チューブを挿管します。
  3. 手術
    1. 動物の胸骨、左胸側と手術大腿三角形のひげをそる。
    2. 10-15 分、1-4 L/分で酸素とイソフルラン麻酔の手術平面を維持するために必要に応じて、1.0 〜 3.0% で呼吸する換気を設定します。
    3. 監視装置の位置 (心拍数、心電図、SpO2、直接血圧、ETCO2および温度) 動物に。
    4. 通常生理食塩水または LRS 点滴に IV カテーテルを接続します。
    5. 無菌ポビドン ヨード ・ スクラブや他の FDA の承認の方法で肌を準備します。
    6. 麻酔の深さのための動物を評価します。
      注: 動物は考慮深く麻酔とき目や顎反射が存在しません。
    7. 動物の背部に位置、前述したように皮膚を準備し、滅菌タオルで動物をドレープします。
    8. 大腿動脈穿刺にカットを実行します。モノポーラ電気メスを使用して作成、大腿動脈穿刺で公開する上約 3 cm 切開します。
    9. 薬物を正確に配置できるように、切開を行った後、大腿神経ブロックを実行します。手術中に血圧を監視する探触子大腿骨カニューレに接続します。
    10. 剣状突起に胸骨の切開をし、筋肉、脂肪、および胸骨のレベルに結合組織を切開する電気焼灼を使用します。
    11. 振動見た胸骨を分割します。
      注: 振動を使用して見てではなく、標準胸骨見た若者を収縮配置するため開胸手術の結果として心膜癒着から潜在的な心筋障害を回避できます。
    12. (2 mg/kg IV ローディング線量、50 μ g/kg/分連続点滴) 不整脈を防ぐためにリドカインを管理します。1 Mg/ml の濃度で生理食塩水入りの 500 mL 袋にリドカインを希釈します。
    13. ストレートのマヨはさみで後部の胸骨板を分割します。
    14. 胸リトラクターを使用して、胸腔内を公開します。
    15. モノポーラ電気メスで癒着をダウンさせます。
    16. アシスタントで胸骨上左端の穏やかな上昇を同じリトラクターを使用して、胸壁から無料の左内胸動脈を解剖します。
    17. 血管クリップを用いたで動脈は枝を制御します。
    18. 100-300 単位/kg IV ヘパリンの動物を heparinize します。
    19. 3 分後分割動脈遠位端を縫い以上。移植の近位端を準備します。
    20. 開き、心膜を撤回します。リマの長さが若者に適切な吻合に到達する十分であることを確認します。
    21. オフのポンプを使用して 7-0 ポリプロピレン縫合糸で若者吻合にリマを実行心臓スタビライザー、バネクリップ フォームと適切なサイズの管腔内デバイス技術。
    22. 外部化し、15-30 分のため、胸腔内から空気を除去するために真空に接続されている、左の胸部の肋骨間の胸腔チューブを配置します。
    23. 胸骨を 8の字パターンを使用して #5 ポリエステル縫合糸で近似します。
    24. 筋肉、休止状態の手術で記載されている通常の方法で皮下および皮膚の層を閉じます。胸腔内から任意の残留空気を削除し、1 つの皮膚縫合糸で切開を閉じるバルサルバ法を実行している間胸管を削除します。
    25. 胸骨切開を保護するために皮膚に皮膚接着剤を塗布します。優しく大腿動脈カテーテルを削除し、財布の文字列パターンで 7-0 ポリプロピレン縫合糸を使用して動脈を修復します。皮膚真皮のパターンで 2-0 polyglactin 縫合糸を使用してを閉じます。
    26. 1 mg/kg 筋肉内の手順の最後で切開の長さに沿って複数のサイトでブピバカインの総線量を管理します。
    27. メロキシカムを管理 0.2 mg/kg 皮下リカバリ領域への輸送の前に。
    28. 休止状態の手順で術後のプロトコルに従ってください。

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結果

次の初期休止状態手術 70% 以上の狭窄は血管造影や心臓 mri 検査 (図 1A) などの臨床画像処理技術によって観察されることができる必要があります。若者収縮の外科的アプリケーションを次の 8 週間エコーや心臓 MRI による地域の機能の解析は、(図 2) の負荷の増加の下で減らされた機能を明らかにします。これは、ドブタミン (5 mg/kg/分)、心を刺激し、周方向のひずみと局所壁肥厚測定でテストできます。PET イメージングは、血流減少と同じ心では虚血性の組織が有効であることを示す内非若者領土と比較して冬眠の地域で増加のブドウ糖吸収を示します。この血流のブドウ糖取り込み促進「流代謝の不一致」として知られているし、慢性的な冬眠の臨床所見を模倣している心筋4。任意のイメージング法による梗塞の証拠はないです。LAD 領域の梗塞が存在する括約筋がきつすぎると動脈の完全閉塞を...

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ディスカッション

ここでは、HM の豚モデルは正確に単一の容器病患者の臨床経験を模倣しているし、左室機能を維持を示します。血行再建術は、前に単一の容器 HM を持つ動物展示駆出率によって測定されたグローバル関数で最小限の障害、局所壁肥厚を大幅に削減。以下の血行再建術、回復の 1 つまたは 3 つのヶ月で CMR イメージングは収縮予備能低用量ドブタミン負荷テストでの推定値でない限り、永続的な地域障害ですが保存生存率およびグラフト開存性を示します。

休止状態の初期操作のためのいくつかの重要な手順があります。第 3 肋で胸に入る近位の若者に簡単にアクセスできます。湿ったガーゼで左心耳の撤回は、不整脈を誘発することがなく血管の可視化を促進します。若者を公開する支援は出血を最小限に抑える、括約筋を確保しています。胸閉鎖空気を避難させるのにバルサルバ法で気胸を防ぐことができます。

正常な血行再建術のいくつかの重要な手順があります。適切な麻酔深度と麻痺剤の使用での保証ない動きプロシージャの吻合部分。リドカインと 200 p 単位/kg ヘパリンの使用は不整...

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開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

この作品はによって、VA メリット レビュー #I01 BX000760 (RFK) アメリカ合衆国 (米国) からサポートされていた復員事務 BLR & Dこの仕事の内容は、ビューの米国政府の退役の米国部門を表しません。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ベアハガー3Mモデル505患者加温システム
SR ブプレノルフィン 10 mg/mLアボットラボNADA 141-434術後鎮痛
手術用スプリングクリップアプライドメディカルA1801テイクダウン後のLIMAのクランプエンド
動脈ラインキットアローASK-04510-HF血圧モニタリング用大腿骨カテーテル
1000mL0.9% 塩化ナトリウムBaxter2B1324XIV 交換液
250 mL 0.9% 生理食塩水Baxter UE1322D交換用IV液 
500mL 0.9% 塩化ナトリウムバクスター2B1323Qドラッグデリバリー、ブロワー ミスター
フロースルー 1.0バクスターFT-12100マから L
フロースルー 1.25バクスターFT-12125
フロースルー 1.5バクスターFT-12150
フロースルー 2.0バクスターFT-12200
クロロプレップベクトン・ディッケンソン260815外科用皮膚製剤
メロキシカム・ベーリンガー・インゲルハイム・ベトメディカ0010-6013-01鎮痛剤用NSAID
HypafixBSN Medical4210安全な創傷被覆材とIVカテーテル
ブロワー用IVチューブ MisterCarefusion42493Eブロワー/ミスター
ボビー焼灼用IV液に適応します CovidienE2516止血 
チェストチューブCovidien8888561043胸腔から空気を排出します 
モノポーラ焼灼 CovidienValleylab FT10止血 
Telpha padCovidien2132滅菌創傷被覆材
4-0 Tevdek II StrandsDeknatel7-922LAD
PropofolDiprivan269-29Induction agent
 喉頭鏡用ロングブレード DRE12521挿管のための気管の可視化が可能
ECGパッドDRE1496モニター 心調律
喉頭鏡 DRE12515
麻酔器 + 人工呼吸器DRE Drer- Fabius TiroDRE0603FT患者に酸素と吸入剤を供給
 5 エチボンド EthiconMG46G縫合糸
0 VicrylEthiconJ208H縫合
2-0 VicrylEthiconJ317H縫合
3-0 VicrylEthiconVCP824G縫合
7-0 ProleneEthiconM8702縫合糸
DermabondEthicon DNX12皮膚接着
力結箉EthiconMSC20LIMAテイクダウン用外科用ステープル
滅菌生理食塩水 20 mLフィッシャーサイエンティフィック20T700220IVカテーテル用フラッシュ
テラゾール 100 mg / mLフォートダッジ01L60030術前鎮静剤
トリプル抗生物質軟膏ジョンソン&ジョンソン23734局所上創
6.0 mm 内径 気管内チューブMallinckrodt86049Revasc、MRI、および終了のための気道の確立
1インチ医療用テープMedlineMMM15271Z創傷被覆材とIVカテーテルの確実
4.0 mm 内径 気管内チューブMedlineDYND43040冬眠のための気道の確立
内径 4.5 mm 内径 気管内チューブMedlineDYND43045冬眠のための気道の確立
内径5.0mm気管内チューブMedlineDYND43050冬眠のための気道の確立
内径6.5mm気管内チューブMedlineDYND43065Revasc、MRI、および終了のための気道の確立
7.0mm内径気管内チューブMedlineDYND43070Revasc、MRI、および終了
のための気道の確立ベアハガーブランケット - 大型、足回りメドラインAUG55501患者保温システム
ベーシックパックメドラインDYNJP1000滅菌ドレープとテーブルカバー
ボーンワックスメドラインETHW31G切断骨の止血
吸引  チューブメドラインDYND50223
吸引容器 MedlineDYNDCL03000
1 mL シリンジMedtronic/Covidien1188100777注射剤の投与
12 mL 注射剤の投与888151287820
mL 注射Medtronic/Covidien8881520657注射剤の投与
3 mL SyingeMedtronic/Covidien1180300555注射剤の投与
6  mL シリンジMedtronic/Covidien1180600777注射剤の投与
60mL 注射Medtronic/Covidien8881560125注射剤の投与
ブロワー ミスターキットMedtronic/Covidien22120血管吻合のための手術野をクリア
RoncuroniumMylan67457-228-05神経筋遮断薬
#40 クリッパーブレードオスター078919-016-701手術部位から脱毛
バリカンオスター078566-011-002手術部位から脱毛
ブピビカインファイザー00409-1161-01局所麻酔薬
セファゾリンファイザー00409-0805-01抗生物質
ヘパリン ファイザー 0409-2720-03抗凝固薬
リドカイン 2%ファイザー00409-4277-01局所麻酔薬/抗アレチック
サクシニルコリン 20 mg/mLファイザー00409-6629-02神経筋遮断薬
麻酔モニターフィリップス Intellivue MP70 吸入剤で換気をサポート
人工涙液ラグビー0536-1086-91角膜の乾燥を防ぐために目を滑らかにする
ブプレノルフィン 0.3 mg/mLシグマ アルドリッチB9275生存処置のための術前鎮痛薬
イソフルランシグマ アルドリッチCDS019936全身麻酔-吸入剤
36インチ圧力監視チューブSmith's MedicalMX563Connectアート。ライン トランスデューサー
へ 48インチ圧力監視チューブSmith's MedicalMX564Connectアート。ライン トランスデューサ
ーJelco 18 ga IVカテーテル Revasc、MRIおよびTerm
Jelco 20 gaIVカテーテルスミス医療4054IVアクセス
Jelco 22 ga IVカテーテルスミスメディカル4050冬眠手順でのIVアクセス
OPVAC Synergy IIテルモ心臓血管システム401-230心臓ポジショナーとスタビライザー
胸骨鋸/剖検鋸サーモフィッシャー812822胸腔を開くために使用
デルリンコンストリクターU of MNカスタムメイドLAD
酸素タンクEシリンダー様々な様々な ブロワーミスターに使用 麻酔器に補助流量計がない場合
圧力トランスデューサ様々な麻酔モニターに適応する必要がありますモニター直接動脈圧
キシラジン 100 mg / mLVedco468RX術前 鎮静剤/鎮痛剤
リ社な保護 剤の投与 剤の投与 のの狭窄を作成します

参考文献

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