重複2法による相乗効果の薬剤の組合せの高スループット識別

サマリー

相乗効果の薬剤の組み合わせは難しいと経験的に識別するために時間がかかるです。ここでは、識別し相乗小分子を検証する手法について述べる。

要約

抗菌薬は^{20 世紀}に劇的に寿命や生活の質を増加している、抗菌薬耐性は、全身性の感染症を治療するために私たちの社会全体の能力を脅かしています。単独で米国で抗生物質耐性感染症は年とコスト追加医療で約 200 億米ドル約 23,000 人を殺します。抗菌薬耐性に対処する方法の 1 つは療法前に感染源の生物とその薬剤耐性プロファイルが確認されている感染症の重要な初期段階で特に有用であります。多くの抗菌薬治療は併用療法を使用します。しかし、これらの組み合わせのほとんどは、添加剤、結合された効果は個々 の抗生物質の効果の合計と同じであることを意味します。いくつかの併用療法は相乗効果: 結合された効果は添加物よりもはるかに大きい。相乗的な組み合わせは、抗菌薬耐性菌の成長を抑えることができますので特に便利です。ただし、これらの組み合わせが珍しいとを識別することは困難です。これはペアの方法でテストするために必要な分子の膨大な数によるもの: 1,000 分子のライブラリには 100 万の潜在的な組み合わせ。したがって、相乗効果のための分子を予測する努力がされました。この資料では、重複²法 (O2M) として知られている小分子で相乗ペアを予測するための私たちの高スループット方法について説明します。O2M が過敏相乗ペアの各分子が他の分子に変異を識別するのに化学遺伝的データセットのパターンを使用します。ブラウンの実験室は、変異がない野生型の細胞の増殖を抑制する分子の高スループットの画面を実行することによってこの成長の違いを悪用します。ラボの仕事は、以前抗生物質のトリメトプリムと抗真菌薬のフルコナゾールこの戦略を使用して相乗効果の分子を識別されます。著者らは、複数の微生物のため変更することができます新しい相乗的な組み合わせの方法画面を紹介します。

概要

抗生物質耐性菌は、¹CDC によると米国の毎年以上 200 万感染症や 23,000 の死を引き起こします。新しい治療法は、これらの感染症を克服するために必要です。これらの新しい治療法を特定する戦略には、新しい抗菌薬の開発や小さな分子微生物感染症^2,3、4を治療するために他の条件のために承認の転用が含まれます。しかし、新しい薬剤の発見は非常に高価な時間のかかるです。新薬を識別できないことがあります薬を転用または薬剤ターゲット^5,6。私たちの研究室は、相乗的組み合わせ療法として知られている 3 番目の戦略について説明します。相乗的な組み合わせは、2 つの小さい分子は一緒に彼らの個々 の効能⁷の添加効果より大きい薬効を持つ場合に発生します。さらに、相乗的な組み合わせすることができますレンダリングすること偉大な潜在的な^{8,9、以下の不要なオフターゲット効果だけでなくペアの小さな分子のいずれかに耐性病原体に対して有効であります。 10}。

相乗ペアは、薬物の組み合わせ^11,12,13の約 4-10% に発生するまれな。このように、ペアワイズ画面などの伝統的な技法、挑戦的な 100 分子の小さなライブラリからの潜在的な組み合わせの何千もの時間がかかる。さらに、相乗作用通常予測できない化合物¹⁴の活動から。ただし、相乗的組み合わせは、重複²メソッド (O2M)¹²と呼ばれる画面に高スループットのアプローチを開発しました。このメソッドは、ここで説明はこれらの相乗のペアをより速くより効率的な識別するためことができます。O2M は、知られている相乗ペアと化学遺伝学データセットの使用を必要とします。ノックアウト変異体のライブラリは、多くの異なる小さな分子の存在下で育てられたとき、化学遺伝学データセットが生成されます。その同じ突然変異体の表現型を引き出す他の小さな分子が既知の各メンバーと相乗効果も知られている相乗ペアで 1 つの分子が 2 番目の相乗的分子として特定ノックアウト変異体から同じ表現型を引き起こす場合相乗のペア。この根拠は、相乗抗生物質ペアエシェリヒア属大腸菌 (E. 大腸菌)に対してアクティブと病原性の真菌クリプトコッカス ・ ネオフォルマンス(c. に対してアクティブな相乗的抗真菌薬のペアを識別するブラウンの実験室で使用されていますネオフォルマンス)^11,12。O2M は様々 な病原体に適応できるだけでなく、分子の大規模なライブラリのスクリーニングは、簡単かつ迅速に相乗のペアを識別します。O2M によって識別される遺伝的変異スクリーニングの相乗効果の予測小さな分子のみを検証することができます。したがって、あった場合のみ 20 分子の相乗効果を予測したライブラリで、今相乗効果の試験日の問題を受け取る一方で、2,000 分子ライブラリーのペアワイズ テストと、月がかかるでしょう。O2M は、プログラミングスキルは不要、必要な機器はほとんどのラボや中核施設で利用可能です。薬の組み合わせに興味がある研究者に加えて O2M 分析薬物画面が完了し、重要な薬物相互作用を識別することによって彼らのヒット曲を拡大したい人誰にも興味深いものです。以下、細菌、相乗効果の小さい分子を識別するだけでなく、よく知られている試金^15,16の予測の相乗作用を検証するプロトコルです。

プロトコル

1. 重複²法 (O2M) による化学遺伝学データセットから相乗効果予測の突然変異を識別します。

注: これはニコルズらから公開されたデータセットを使用したシナジー予測変異を識別する方法です。¹⁷ 大腸菌。ただし、これは任意の化学遺伝学データセットや微生物を行うことができます。これらのデータ セットには、各変異体それぞれの小さな分子の量的成長スコアを与える以上 100 の小さな分子の存在下で成長してノックアウト変異のライブラリが含まれています。知られなければ 1 つ相乗ペアと、データセットに含まれる両方の小さい分子の成長スコアする必要があります。

1. 各小分子の単一濃度の存在下で成長してすべての突然変異体の平均成長スコアと標準偏差を計算します。
   メモ: これは実行することができます、スプレッドシート ソフトウェアを使用します。ブラウンの実験室を使用して、Excel や関数 =AVERAGE(B3:B3981) および小分子の各列の計算のための =STDEV(B3:B3981)。
   1. 別のデータセットを使用している場合、この方向が異なる可能性がありますが、手段と小分子の各列からの標準偏差を計算します。
2. ・ ニコルズらから同じデータセットを使用した小分子の各濃度の Z スコアを計算します。スプレッドシート プログラムで¹⁷ 。このため、負の z スコアになります Z(2.5) = 意味 - 2.5 * 標準偏差と正の z スコア Z(2.5) になります = 平均 + 2.5 * 標準偏差。
3. 遺伝子変異体を含むそれらの分子のすべての濃度を確認されている既知の相乗ペアを作る小さな分子で重要な Z スコアを決定します。否定的な Z (2.5) 未満の変異体のスコアは、成長スコアまたはその小さな分子のための肯定的な Z (2.5) のスコアをより大きく、重要なと見なされます。
4. オペロンに属している重大な遺伝子変異体のいずれかを決定します。
   注:エシェリヒア属大腸菌、著者チェックお勧めします「Ecoli wiki」の情報について遺伝子がコードする RNA の一部として書き換えられます。
5. 異なる濃度で興味の小さい分子の大部分に共通する遺伝子/オペロン変異体を特定 (e.g抗生物質のトリメトプリムと相乗作用分子を識別する重要な Z を示す変異体を探しているとき、。スコア トリメトプリムとスルファメトキサゾールなど sulfamethizole 知られている相乗パートナーの存在下で育てられたとき)。これらは推定上シナジー予測変異体です。

2. O2M によって化学遺伝学データセット内の Synergizers の予測

1. データセット¹⁷に戻ると、シナジー予測突然変異体から大きな成長スコアを引き出す小さな分子の各濃度を特定します。これは、Z スコアの小さい分子の各濃度の計算を見ることによって行われます。もう一度、大きな成長スコアは小分子の濃度の正の Z スコアを超える負の Z スコアよりも小さいかです。
   注: 分子は、1 つでもその濃度に表示されている場合は、予測 synergizer が分子で見なされます。大きな成長スコアは発生しませんすべての分子は、予測非 synergizer です。

3. 予測の相乗作用の検証

1. 予測 synergizers の最小発育阻止濃度 (MIC) を見つけます。
   1. M9 最小媒体を 37 ° C での大腸菌の一晩の文化を育てる
      注: 任意の一晩の文化は興味の有機体のための適切に定義された媒体で栽培できます。ブラウンの実験室では、LB や YPD のようなリッチ メディアは推奨しません。M9 最小媒体で構成される 10.5 g/L M9 スープ 0.2% カザミノ酸、0.1 M CaCl₂0.4% グルコース、1 M MgSO₄0.25% ニコチン酸 0.33% チアミン H₂o.
   2. MIC データの関心の病原体は小分子を受け取ったら文学溶解する場合ないジメチルスルホキシド (DMSO) で高濃度 (> 10 mg/mL)。
   3. 96 ウェル プレートで、M9 媒体の 100 μ L を各ウェルに追加します。200 μ L の合計が含まれていますので、M9 媒体の余分な 100 μ L を列 1 に追加します。
   4. 1 列目の集中の小分子ソリューションの任意の量 (~ 10 μ L) を追加します。列 1 (プレートごと 8 小分子) の井戸あたり 1 つの小さい分子。
      注: これらは相乗効果と予測されている関心の小さな分子です。ブラウンの実験室は一般に大腸菌を抑制することができます 100 %dmso 量以下である高濃度低分子溶液 10 μ L を追加します。
   5. 小さな分子を追加すると、プレートの x 軸では小分子を希釈します。1 列からソリューションの 100 μ L を取る、2 列の配置し、混ぜます。列 2 から 100 μ L を取るの 3 列配置し、混ぜます。100 μ L は 11 の列に配置されるまで、このプロセスを続けます。ミックス 11 列、その列から 100 μ L を取るし、破棄します。データを正規化するだけのメディアで 12 列をまま。
   6. プレートを接種します。一晩かけて培養から光学濃度 (OD₆₀₀) を取得します。文化と 0.002 の OD₆₀₀ M9 メディア ソリューションを準備 (または興味の目的の有機体のための 500 細胞/μ L を表す濃度を適切な)。ウェルあたり 1000 個の細胞がありますので、プレートの各ウェルに培養液 2 μ L をピペットします。
   7. 優しくプレートを振るし、読んで 0 h の OD₆₀₀を取得します。24 時間取得を読んで 24 時間外径₆₀₀の 37 ° C で成長板ができます。
      注: 適切な関心を持つ他の有機体の条件を成長しています。
   8. よくスプレッドシート プログラムを使用してそれぞれの純成長率を計算します。
   9. 取得平均ない薬成長する 12 柱の純成長率を平均します。スプレッドシート ソフトウェアを使用していない薬剤成長のなかに他の井戸を正規化します。10% 未満で、よく探して、MIC90 を識別するために成長します。50% 未満でも成長を示します、MIC50。これらの井戸で小さな分子の濃度を計算します。
2. 相乗作用の市松模様の試金
   1. 前に、として M9 最小媒体のエシェリヒア属大腸菌の一晩の文化を育てます。
      注: 適切な成長する他の有機体のための条件。
   2. M9 媒体の 100 μ L を各ウェルの 96 ウェル プレートと 1 列目の余分な 100 μ L に追加します。
   3. テスト小分子を追加 (~ 8 時マイク x) 各列 1 でよく、濃度 2 倍を追加 (~ 16 マイク x) も A1 に (1 つの小さな分子テスト プレートごと)。
      注: この金額マイク テスト完了前から決定され、それぞれの潜在的な synergizer は異なります。
   4. X 軸の列 1 から 100 μ L を取り、列 2 に転送することによってグラデーションの希釈を作成します。11 列に 100 μ L を追加するまで、このプロセスを続けます。ミックス、列 11 から 100 μ L を取るし、処分します。12 (図 1 a) の列に任意の薬物を追加しないでください。
   5. 入力の薬を y 軸に 2 つ目の薬のグラデーションを設定します。A. ミックスの行入力分子のマイクと行 A および B. 続行に 100 μ L が g. ミックスの行に配置されるまでを置くことから前に、希釈として、100 μ L x 2 を含むメディアの 100 μ L を追加、100 μ L と dispose をように行秀の任意入力の薬剤を追加これにより、H の行と列 (図 1 b) テスト薬ペアの個々 のマイクを含む 12。
   6. プレートを接種します。外径₆₀₀ 0.002 の大腸菌培養の 2 μ L を各ウェル (ウェルあたり 1,000 セル) に追加します。
   7. 0 h 読書用プレートの各ウェルの OD₆₀₀を測定します。
   8. 37 ° C で 24 時間のプレートを孵化させなさい
   9. 24 h での OD₆₀₀を測定します。
3. チェッカー ボードから小数の発育阻止濃度指数 (FICI) を計算します。
   1. スプレッドシート プログラムで 24 h で OD₆₀₀ 0 h 外径₆₀₀を減算することによって、プレートの各ウェルの純成長率を計算します。
   2. 除して各も H12 は、小分子が含まれていないソフトウェアの成長を正常化します。
   3. 12 欄入力分子の MIC90 と行英に潜在的なレチノイドシナジストの MIC90 を見つける
   4. 90% の成長を阻害するすべての井戸を探します。
   5. いずれか最も低い (相乗) 以下よくのため FICI90 を計算または最高 (拮抗) 上記方程式を使用して、両方の MIC90 値。
      
   6. 任意 FICI ≤ 0.5 として相乗効果を検討、FICI ≥ 4 拮抗 (図 2)。
      注: これも行えます MIC50 と (成長の 50% 阻害) それらの MIC の値に基づいて、FICI50 を取得します。
4. ブリス独立アッセイ
   注: 至福の独立は、独自に、マイクを持っていなかったすべての潜在的なレチノイドシナジストが実行されます。
   1. 37 ° C で M9 媒体のエシェリヒア属大腸菌の一晩文化を前に成長します。
      注: 再度、関心を持つ他の有機体の適切な成長条件使用できますこの手順で。
   2. 潜在的な相乗的分子、入力分子、組み合わせ、および無処理コントロール テストの 96 ウェルのプレートを準備します。
   3. M9 媒体の 50 μ L を各ウェルに追加することによって潜在的なレチノイドシナジスト プレートを作成します。行の各ウェルに、潜在的なレチノイドシナジストの設定濃度 (10 μ M または 100 μ M) を含むメディアの 50 μ L を追加します。プレートごと 8 分子をテストします。
   4. メディアの 50 μ L を各ウェルに追加することによって入力分子プレートを作成します。4 x を含む 50 μ L を追加 1 列目のウェルに入力薬剤の MIC。マイク板、列 1 から 50 μ L を取り、分散、2 カラムで混合する x 軸に沿ってグラデーション希釈を作成します。列、12 列 12 から 50 μ L を破棄までこのプロセスを続行します。各ウェルの最後の合計は 100 μ L 各ウェルにメディアの追加の 50 μ L を追加します。
   5. 96 ウェル プレートを使用したコンビネーション プレートの作成、メディアの 50 μ L を各ウェルに追加します。4 x を含む 50 μ L を追加 1 列目のウェルに入力薬剤の MIC。X 軸のマイク プレート、列 1 から 50 μ L を取り、分散、列 2 の混合のように希釈します。これは列、12 列 12 から 50 μ L を破棄に全体の方法を続けます。10 μ M または行の各ウェルに 100 μ M で潜在的なレチノイドシナジストを含むメディアの 50 μ L を追加します。もう一度、1 つの濃度または行ごと薬する必要があります。
   6. 無処理コントロールを作成するには、プレートのすべての井戸に M9 媒体の 100 μ L を追加します。
   7. 前に各同様に 0.002 や 1000 個の細胞の OD₆₀₀細菌培養の 2 μ L を追加することによってすべてのプレートを接種します。
   8. 0 から 24 h での OD₆₀₀を測定します。
5. 至福の独立性スコアを計算します。
   1. スプレッドシート プログラムを使用して 24 h に成長から 0 h 外径₆₀₀を減算することによって、プレートの各ウェルの純成長率を計算します。
   2. スプレッドシート プログラムでない薬板から平均成長率に井戸を正規化します。
   3. 表計算ソフトを使用して、1 から純増を差し引くことによって阻害を計算します。
   4. 表計算ソフトで入力のグラデーションのみを含む制御板の列を平均します。
   5. 式により各ウェルのブリス スコアを計算します。
      至福のスコアも X を組み合わせる- (よく X + 入力列 X) =
   6. 入力の MIC90 の下の井戸で負のスコアを探してください。
      注: 複数の濃度間で負のスコアの相乗作用を示します。

4. 高スループット画面新規相乗ペアを識別するシナジー予測変異

1. シナジー予測変異体を特定します。
   注: ステップ 1.5 には、推定されるシナジー予測変異が識別されます。ここでは、相乗効果の薬剤のための高スループット画面で最高機能するこれらの変異体を決定します。Bioscreen マシンでこのアッセイを行ったが、96 well プレート リーダーは許容する必要があります。
   1. 各推定シナジー予測変異体と野生型細胞 M9 最小媒体を成長します。
   2. 100 の設定も適切な成長媒体、成長培地 + 入力薬、成長培地 + 入力薬物と成長培地 + 知られていた非相乗薬剤知られている相乗パートナー プレート (または 96 ウェル プレート) をハニカムします。車両のコントロールを含めることを確認します。
      注: 各ひずみ/薬/集中のための井戸を複製 4 をお勧めします。
   3. まあ、空白制御井戸を含むあたり 1000 個の細胞を接種します。
   4. 37 ° c、振動、48 h を成長し、OD₆₀₀ 20 分毎を読みます。
   5. 予測入力の薬と知られている相乗パートナーの存在下で変異細胞に野生型との相乗効果の最大の成長の違いを示す薬物濃度と時間のポイントを決定します。最適な時点で濃度、べきである多く成長違い野生型と相乗効果予測変異細胞 (図 3) の入力の薬物と相乗的行動に知られている薬の存在下で成長しました。
2. 相乗効果の薬剤のための高スループット画面
   1. 野生型細胞とシナジー予測変異細胞 M9 最小媒体を成長します。
      注: は、関心の有機体の適切な成長媒体を使用します。
   2. ライブラリからメディアにそれぞれを前の手順で設定濃度で低分子 100 μ L メディアが含まれる薬を追加します。(セル) を持たない空井戸などの車両コントロールと井戸 (e.g。、DMSO) 薬剤希釈車両によって任意の成長の抑制を考慮します。
      1. プレート、よく位置の影響を考慮して板に理想的に散在しているあたり、少なくとも 4 つの車両制御井戸を準備します。試金は変数である場合、行/列あたりも、少なくとも 1 つの車両の制御を含めるし、全体板 (ステップ 4.2.5) の代わりに各の行/列の Z スコアを計算するコントロールとしてよく行/列の各コントロールを使用します。
   3. 前に各同様に文化の 2 μ L を追加します。(野生型細菌と予測シナジー変異バクテリア用プレート 1 枚用プレート 1 枚)。
   4. クリプトコッカスに対する 0 と 18 h大腸菌または 48 h で OD₆₀₀を評価します。
   5. 表計算ソフトを使用して、車両制御井戸から空白の井戸の OD₆₀₀を引いて純成長率を計算します。Z スコアが-2.5 の井戸を識別 (Z スコア = 平均 - 2.5 * 標準偏差)。これらの井戸には、潜在的なレチノイドシナジスト小分子が含まれています。
   6. 手順 3 で説明した方法を使用して画面のヒットを検証します。

結果

市松模様の試金は、相乗作用を測定するための半定量的方法です。出力の最終的なスコア、FICI、決定薬の組み合わせ相乗 (FICI ≤0.5) を考えると、非相互作用 (0.5 < FICI < 4)、または拮抗 (FICI ≥4.0)。図 1は、市松模様のアッセイで薬物グラデーションを設定する方法を示しています。図 2は、一般的な結果を示しています。90% の成長阻害未満表示成長 (紫井戸) を検討してください。プレートの各ウェルの OD₆₀₀を測定した後我々 はすべてなしの薬物コントロールにも正規化します。正規化された値で何か > 0.1 (よくコントロールの OD₆₀₀の 10%) を獲得して「成長」.FICI スコアすることができますが異なりますも拾うは、;よくは、各プレートの最も低い FICI を選択します。図 2 a、よく f...

ディスカッション

相乗効果の小さい分子のペアは、微生物感染症の治療に強力なツールをすることができますまだ彼ら相乗ペアが識別するために挑戦的なのでその完全臨床的可能性に達していません。本稿では、シンプルなペアの組み合わせよりもはるかに高速の相乗組み合わせを識別するためのメソッドについて説明します。化学遺伝学データセットを使用して、O2M は相乗的組み合わせを予測するために小分子の画面サイズの大きなライブラリに読み出しとして使用することができます遺伝子ノックアウトと変異を識別します。小さな分子を予測する能力は相乗パートナーの大規模識別のため順番に画面の高いスケーラビリティのためことができます。相乗ペアを識別した後 1 つは、分子機構の基になる相乗作用を解明し、追加相乗ペア¹¹の合理的設計できます。

O2M は、化学遺伝学的データセットと知られている相乗ペアに必要です。幸いにも、化学遺伝学データセットはさまざまな微生物^19,20,<...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Bioscreen C	の器械	の成長のカーブUSA
相乗効果H1	器械	BioTek
M9のスープ	の試薬	Amresco	J863-500G
Casaminoの酸の	試薬	フィッシャー科学	BP1424-500
ブドウ糖	の試薬	ΣG7021-10KG
のニコチン酸	の試薬	Alfa Aesar	A12683
Thiamine	reagent	Acros Organics 148991000
CaCl2 二水和物	試薬	Fisher	C79-500
MgSO4 Heptahydrate	reagent	Fisher	M63-500
化学遺伝学データセット	データセット	の例には、Nichols et al., Cell, 2011, Brown et al, Cell, 2014, and others が含まれます本文中で引用されています。
トリメトプリム(インプット薬の例;どれでも使用可能)	試薬	フィッシャー・サイエンティフィック	ICN19552701
スルファメトキサゾール(試験薬の例;どれでも使用可能)	試薬	フィッシャー・サイエンティフィ	ック ICN15671125