非常に小さいスペースで先端成長植物細胞の伸長機能を勉強するマイクロ流体デバイスの開発

Summary

ルート毛、花粉管を含む先端成長の植物細胞の機能を調査し、マイクロ流体デバイス (〜 1 μ m) の非常に狭い隙間を延長する原糸をコケについて述べる。

Abstract

生体内で、植物細胞の先端成長は一連の物理的な障壁を克服するために必要があります。しかし、研究者は、このような制限の厳しい条件下での細胞挙動を可視化する方法論を欠いています。この問題に対処するためポリ ジメチルシロキサン (PDMS) 基板で、微細加工の狭いギャップ (〜 1 μ m) のシリーズを含む先端成長の植物細胞の培養室内で開発しました。この透明な材料では、タイムラプス イメージングによるギャップ浸透中に個々 の細胞における先端伸長プロセスを監視することができます。この実験のプラットフォームを使用して、彼らが侵入、ギャップとして花粉管の形態変化が観察。このプロセス中には、蛍光に分類された栄養核の形状の動的変化と花粉管内の精子細胞を捕獲しました。さらに、我々 は 1 μ m ギャップを貫通する根毛とコケ原糸体の機能を示した。この体外プラットフォームは物理的に制約された空間にどのように個々 の細胞応答を研究に使用することができ、先端成長メカニズムに洞察力を提供する可能性があります。

Introduction

柱頭に花粉が発芽後、各結晶粒は卵細胞と中央細胞二重受精胚珠内に精子細胞を運ぶ 1 つの花粉管を生成します。花粉管は細長いスタイルを通じて、最終的にその方法¹に沿って複数指導の手がかりを感知して胚珠に到達します。延長の間に花粉管発生一連の物理的な障壁。送信トラックは細胞と花粉管が彼らのターゲット (図 1 a)²に到達する胚珠の分の珠孔開口部を入力してください。したがって、花粉管には、自分の周囲から圧縮応力を許容しながら、物理的な障害を貫通する能力が必要です。根毛は詰められた土粒子 (図 1 b) の形式で、環境の物理的な障害に耐える必要がありますヒント成長の植物細胞の別のタイプです。

花粉管の各種力学的性質が研究されている、膨圧と初期原形質分離方法^3,4と細胞の顕微鏡を使用して測定することができます細胞の頂部の剛性などを含む(CFM)^5,6、それぞれ。ただし、これらの方法を単独で花粉管が伸長成長軌道に沿って物理障壁をことができるかどうかは公表しません。監視されている体内に花粉管伸長を可能にする方法は、2 光子顕微鏡⁷です。ただし、この方法では、個々 の花粉管の形態学的変化を観察することは困難だ胚珠組織の奥深く。さらに、土壌の根毛成長視覚化できます x 線断層撮影 (CT) や磁気共鳴画像 (MRI)⁸を使用して低解像度ではあります。従来の顕微鏡で細胞の変形過程の高解像度の画像を取得する方法を紹介します。

ここで説明したメソッドの全体的な目標は、根毛、花粉管を含む先端成長の植物細胞の伸長機能を視覚化し、コケ原糸体、非常に小さなスペースにすることです。本稿で提示ポリ-新規 PDMS マイクロ光学的に透明な空気し透水性、デバイス内部の生きている細胞の培養ができ、顕微鏡下で生育過程を観察します。また、マイクロを作成することが可能だ 〜 金型の使用ソフト ・ リソグラフィー技術⁹ナノメートル スケール スペース。これらの機能は、物理的に限られた環境での植物細胞の先端成長の伸び能力を研究することを許可します。

この作品は、マイクロ流体デバイスの 1 μ m の広いギャップ (高さ 4 μ m) を構築し、円筒の花粉管 (約 8 μ m) の直径よりもはるかに小さいこれらの人工の障害物を貫通する花粉管の能力を検討しました。この実験のプラットフォームは、私たち microgaps に花粉管の応答を可視化し、細胞の変形過程を追跡する、応答の時間経過の画像をキャプチャできます。根毛とコケ原糸体の浸透能力を調査するため使用することができますマイクロ デバイスを開発しました。いくつかのマイクロ デバイスは、ルート^{10、11,12,13}とコケ原糸体¹⁴生育高解像度での可視化を有効にする日付を報告されています。我々 のデバイスでルート成長室一連の根毛成長チャネルは垂直で個々 のルート毛 (直径約 7 μ m) は、1 μ m のワイド ギャップと流路に導かれています。モスも培養を行ったこれらの物理的な障壁への応答を調べる microgaps を含むマイクロ デバイスの原糸体 (直径約 20 μ m)。提案マイクロ ベースのアプローチでは、他の現在利用可能な方法で検査することはできません非常に小さなスペースを延長する様々 なヒント成長植物細胞の機能を探索することが出来ます。

Protocol

1. 花粉管の成長を調べる PDMS マイクロ デバイスの作製や原糸を苔

注意: シリコンウェーハの PDMS 金型を準備するのにマスクレス露光装置を使用しています。システムの操作に関する詳細は、本稿では省略しています。ソグラフィー技術⁹フォトマスクを使用しても本稿で説明した PDMS 金型を作成に使えます。

1. 中古ポリマーは、PDMS 混合物の 11 グラムを注ぐ (エラストマー ベース: 硬化剤 10:1 の比率で) 各 4 インチ型に。
2. 手順 1.1 真空チャンバー内で 20 分間で金型をドガします。
3. 非対流のオーブンで 90 分の 65 ° C で硬化後、金型を PDMS 層の皮をむくし、生検パンチを使用流体チャンネルにアクセス穴をパンチします。
   注意: 花粉管装置の穴のサイズは雌しべの直径に合わせて調整する必要があります。したがって、この値は、種によって異なります。この実験では、雌しべの吸気 1 mm の穴および液体の中の貯水池の 1.5 mm の穴をパンチしました。コケ原糸体デバイスの 4 mm の穴は、サンプル保存容器に使われました。
4. 50 のプラズマを空気に PDMS 層とガラス底皿 (直径 3.5-5 cm) を公開 s。
5. 微小流体ネットワークを完全に封鎖する非対流オーブンで 30 分間ガラス底皿と 65 ° C で熱に PDMS 層を押し込みます。

2. 根毛の PDMS マイクロ デバイスの作製

1. 1.1 1.3 金型を使用したルートおよびルート髪マイクロ デバイスの 2 つの PDMS 層を準備の手順を繰り返します。
   注意: ルート マイクロ デバイスに液体中の貯水池に 2 mm の穴を使用しています。
2. 50 のプラズマを空気に両方の PDMS のレイヤーを公開 s。
3. カスタム デスクトップ アライナを使用して顕微鏡下で 2 つの PDMS 層を組み立てます。
   注: これらの PDMS 層のマイクロ互いに直面する必要があります。、を組み立てる前に両方のレイヤーの位置合わせマーク一致していることを確認します。
4. 65 ° c 微小流体ネットワークを完全に封鎖する非対流オーブンで 30 分加熱します。
5. 構築されたマイクロ デバイスからカバー スリップを取り出し、直径 5 cm ガラス底皿にデバイスを置きます。

3. 準備体外細胞培養液中の花粉管 (トレニア)

1. 20 分の¹⁵とオートクレーブを前述のように変更した Nitsch の媒体 121 ° C にある媒体を準備します。
   注: 修飾された Nitsch の培地の組成は NH₄いいえ₃ (80 mg/L)、自演₃ (125 mg/L)、Ca (₃)₂‧4H₂O (500 mg/L)、MgSO₄‧7H₂O (125 mg/L)、KH₂PO₄ (125 mg/L)、MnSO₄‧4H₂O (3 mg/L)、ZnSO₄‧7H₂O (0.5 mg/L)、H₃ボー₃ (10 mg/L)、CuSO₄‧5H₂O (0.025 mg/L)、ナ₂MoO₄‧2H₂O (0.025 mg/L)、(50,000 mg/L)、ショ糖、カゼイン (500 mg/L)。準備された媒体は 4 ° C で少なくとも 4 ヶ月間保存できます。
2. 26% (w/v) ポリエチレング リコール オートクレーブ脱イオン水を使用しての準備し、ソリューションをフィルター 0.3 μ m 孔フィルターと。
   注: 準備された媒体は 4 ° C で 1 ヶ月保存できます。
3. ステップ 3.1 と 1:1 (v/v) 比で 3.2 の試薬を混ぜます。
   注: この媒体準備されるべき新鮮な使用するたびに。

4. 根毛 (シロイヌナズナ) の体外細胞培養液の準備

1. 0.215% (w/v) 培地・培、0.05% (w/v) MES の 1% (w/v) ショ糖と純水で 1% (w/v) 寒天溶液を準備します。オートクレーブ 121 ° C、20 分でソリューション。

5 コケ原糸体 (ヒメツリガネゴケ) の体外細胞培養液の準備

1. 中古 BCDAT 中¹⁶ペトリ皿でコケ原糸を孵化させなさい。
   注: BCDAT 培地の組成は 1 mM MgSO₄、10 mM 自演₃、45 μ M FeSO₄、1.8 mM KH₂PO₄ (pH 島の 6.5 に調整)、微量元素液 (0.22 μ M CuSO₄, 0.19 μ M ZnSO₄, 10 μ M H₃ボー₃、0.1 μ M Na₂MoO₄、2 μ M MnCl₂、0.23 μ M CoCl₂、および 0.17 μ M KI)、1 mM CaCl₂、および 5 mM アンモニウム (+)-酒石酸。
2. 文化 BCDATG マイクロ中でモス。
   注: BCDATG メディアは、0.5% (w/v) グルコースと BCDAT 中です。準備された媒体は、1 ヶ月の 4 ° C で保存できます。

6. t. について花粉管、マイクロ デバイスのin Vitro培養

1. 真空チャンバー内で花粉管マイクロ デバイスを置き、ドガの 20 分間。
2. 真空チャンバーからマイクロを削除し、極細先端のピペットを使用して雌しべ入口に成長培地をご紹介します。同じ媒体でそのトップに残りの井戸を埋めます。すべての内壁が内壁の中作成された真空による媒体で満ちているまで、数分待ちます。
3. 皿の中の湿度を維持するためにガラスの下皿にいくつか湿らせたペーパー タオルを配置します。
4. 野生型から花粉を転送解剖針を用いてその汚名にt. について「青と白の花。
   注: また実験を行いこのトランスジェニックt. についてと 'バイオレット クラウン' 花 ( RPS5Ap::H2B tdTomatoライン¹⁷)、花粉管の蛍光に分類された精子細胞と栄養核を含みます。
5. カット (1 センチ) の受粉のスタイルは、ブレードを使用します。
6. 図 2に示すように、デバイスの入口にカット スタイルを挿入します。
7. 皿にふたをかぶせるし、テープでそれを封印します。
8. 暗闇の中で 5-6 時間 28 ° c の定温器のデバイスの場所。

7. マイクロにおけるシロイヌナズナ根毛のin Vitro培養

注: 手順 7.1 7.9 7.3 と 7.5) を除くは層流フードで実行する必要があります。

1. シロイヌナズナコロンビア (コル-0) から種子を殺菌し、transgenic ラインの無菌の液体 (5% (v/v) 世帯の漂白剤と 0.02% (v/v) トリトン X-100) 5 分でそれらを浸すことによってUBQ10pro::H2B mClover (蛍光核マーカーを含む)。
2. オートクレーブ処理した水で滅菌の種子を徹底的にすすいでください。
3. 暗闇の中で 4 ° C で 2 日間水で洗った種を格納します。
4. 一晩、UV 光の下でマイクロ デバイスを滅菌します。
5. 真空チャンバー内でマイクロを置き、ドガの 20 分間。
6. マイクロ ピペットを使用して、デバイスでの井戸に成長培地を紹介します。真空は、媒体とマイクロ流路をいっぱいになるまで、数分待ってください。
7. 皿の中の湿度を維持するためにガラスの下皿にオートクレーブ湿らせたペーパー タオルを配置します。
8. デバイスの入口に種子を滅菌を転送します。
9. 皿にふたをかぶせるし、テープでそれを封印します。
10. 連続白色光の下で 22 ° C でインキュベーターでデバイスを垂直方向に配置します。
11. 4-10 日の孵化後ルート髪の成長を確認してください。明視野、倒立顕微鏡を用いた蛍光画像を取得します。

8.ヒメツリガネゴケ(モス) マイクロ流体デバイスの原糸体のin Vitro培養

注: 手順 8.2 8.6 (8.3) を除くは層流フードで実行する必要があります。

1. ヒメツリガネゴケひずみ Gransden 2004¹⁸ 25 ° C で連続的な白色光の下で一週間シャーレのセロファンで覆われて BCDAT 中の preculture します。
2. 層流フードの一晩紫外線の下でマイクロ デバイスを滅菌します。
3. 真空チャンバー内でマイクロを置き、ドガの 20 分間。
4. マイクロ ピペットを使用して井戸に成長培地をご紹介します。真空は、媒体とマイクロ流路をいっぱいになるまで、数分待ってください。
5. 皿の中の湿度を維持するためにマイクロ デバイスを囲む皿にオートクレーブ処理した水を追加します。
6. マイクロの入口にコケ原糸体組織の小片を転送し、連続白色光の下で 25 の ° c の定温器の組織文化します。
7. 孵化の 2 〜 3 週間後コケ原糸体の成長を確認してください。顕微鏡を用いた明視野画像を取得します。

9 T. について花粉管伸長のタイムラプス イメージング

1. 画像集録ハードウェアを搭載した倒立蛍光顕微鏡、マイクロ デバイスに配置 (e.g。、CCD カメラ) とソフトウェア。ギャップの場所を見つけます。
   注: 画像集録ソフトウェアの市販製品 (材料表) を使用しました。µManager などオープン ソース顕微鏡ソフトウェアは、利用可能なオンライン (https://micro-manager.org/wiki/Micro-Manager) であります。高解像度画像を得るために、顕微鏡に顕微鏡コンデンサーをインストールするをお勧めします。
2. すべての 10 の明視野画像をキャプチャ顕微鏡画像集録ソフトウェアを使用して s。
3. 蛍光に分類された精子細胞と栄養RPS5Ap::H2B tdTomatoラインの花粉管核を観察する 561 nm レーザーを試料に照射し、帯域光学フィルターを使用 (578/105 nm)。
   注: が花粉管の伸長のコマ撮り画像は頻繁に捕獲された、イメージングでした成長に影響を与えるには表示されません。ただし、レーザー強度、露光時間、光毒性と蛍光の退色を最小限に抑えるためのコマ間隔を最小化することを常にお勧めします。
4. 明るさとコントラスト画像の調整し、ImageJ ソフトウェア (https://imagej.nih.gov/ij/) を使用してビデオ ファイルを準備します。

Results

図 1に示すように、植物細胞の先端成長の成長パスの vivoに沿って物理的な障壁のシリーズに遭遇します。本論文で示したセル文化プラットフォーム マイクロ流体の in vitro試験を有効に、先端成長の植物細胞 (花粉管、根毛、コケ原糸) を 1 μ m の人工の隙間 (図 3からの 3 つのタイプのプロセス図 4図 5)。花粉管の調査では、住セルイメージ投射は花粉管と同様の栄養核の根尖部の形態変化と (補足ムービー 1 と 2) の非常に小さいスペースを発生する応答内の精細胞を監視する使用されました。

我々 はそれらのいくつかが完全に気づいたが、m...

Discussion

プロトコルのいくつかの重要な手順は、上記に示した結果を得るために正確に続くことに必要があります。まず、PDMS 層およびガラス底皿の表面両方扱われなければならないプラズマ接合前に、の時間の十分な量の。それ以外の場合、先端成長のセルは、microgaps を交差させている間、ガラス面から PDMS 層可能性がありますデタッチ ローカル。根毛とコケ原糸体のプロトコルの別の重要なステップは、マイクロの殺菌です。通常、根毛とコケ原糸体細胞は数週間のカップルのためのマイクロで培養する必要があります。デバイスを滅菌せずこれらのヒント成長細胞の成長に影響するかもしれない微生物は活気づくかもしれない。半日以内実験を締結以来、花粉管デバイスの滅菌は、重要ではありません。我々 は定期的に滅菌せず花粉管デバイスを使用しているし、実験中に任意の望ましくない影響を観察しなかった。

マイクロ デザインは、興味のセルに従って変更する必要があります。我々 の仕事でシロイヌナズナ根毛の実験のために使用されるチャネルの設計はt. について花粉管とヒメツリガネゴケ原...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
PDMS	ダウコーニング株式会社	Sylgard184
村重 &スクーグ ミディアム	和光純薬	392-00591
MES	同人堂	345-01625
ショ糖	和光純薬	196-00015
50 mm ガラス底皿	松波 ガラス	D210402
35 mm ガラス底皿	いわき	3971-035
外科用刃	フェ	ザーNo.11
生検パンチハリ	ス		ユニコア
ゲルローディングのヒント	バイオビック	124-R-204
倒立顕微鏡	オリンパス	IX83
CSU-W1	河電機		カタログ番号は、このカスタマイズされた顕微鏡
のために利用可能ですMetaMorphイメージングソフトウェア	Molecular Devices