非常に小さいスペースで先端成長植物細胞の伸長機能を勉強するマイクロ流体デバイスの開発

Summary

ルート毛、花粉管を含む先端成長の植物細胞の機能を調査し、マイクロ流体デバイス (〜 1 μ m) の非常に狭い隙間を延長する原糸をコケについて述べる。

Abstract

生体内で、植物細胞の先端成長は一連の物理的な障壁を克服するために必要があります。しかし、研究者は、このような制限の厳しい条件下での細胞挙動を可視化する方法論を欠いています。この問題に対処するためポリ ジメチルシロキサン (PDMS) 基板で、微細加工の狭いギャップ (〜 1 μ m) のシリーズを含む先端成長の植物細胞の培養室内で開発しました。この透明な材料では、タイムラプス イメージングによるギャップ浸透中に個々 の細胞における先端伸長プロセスを監視することができます。この実験のプラットフォームを使用して、彼らが侵入、ギャップとして花粉管の形態変化が観察。このプロセス中には、蛍光に分類された栄養核の形状の動的変化と花粉管内の精子細胞を捕獲しました。さらに、我々 は 1 μ m ギャップを貫通する根毛とコケ原糸体の機能を示した。この体外プラットフォームは物理的に制約された空間にどのように個々 の細胞応答を研究に使用することができ、先端成長メカニズムに洞察力を提供する可能性があります。

Introduction

柱頭に花粉が発芽後、各結晶粒は卵細胞と中央細胞二重受精胚珠内に精子細胞を運ぶ 1 つの花粉管を生成します。花粉管は細長いスタイルを通じて、最終的にその方法¹に沿って複数指導の手がかりを感知して胚珠に到達します。延長の間に花粉管発生一連の物理的な障壁。送信トラックは細胞と花粉管が彼らのターゲット (図 1 a)²に到達する胚珠の分の珠孔開口部を入力してください。したがって、花粉管には、自分の周囲から圧縮応力を許容しながら、物理的な障害を貫通する能力が必要です。根毛は詰められた土粒子 (図 1 b) の形式で、環境の物理的な障害に耐える必要がありますヒント成長の植物細胞の別のタイプです。

花粉管の各種力学的性質が研究されている、膨圧と初期原形質分離方法^3,4と細胞の顕微鏡を使用して測定することができます細胞の頂部の剛性などを含む(CFM)^5,6、それぞれ。ただし、これらの方法を単独で花粉管が伸長成長軌道に沿って物理障壁をことができるかど....

Protocol

1. 花粉管の成長を調べる PDMS マイクロ デバイスの作製や原糸を苔

注意: シリコンウェーハの PDMS 金型を準備するのにマスクレス露光装置を使用しています。システムの操作に関する詳細は、本稿では省略しています。ソグラフィー技術⁹フォトマスクを使用しても本稿で説明した PDMS 金型を作成に使えます。

1. 中古ポリマーは、PDMS 混合物の 11 グラムを注ぐ (エラストマー ベース: 硬化剤 10:1 の比率で) 各 4 インチ型に。
2. 手順 1.1 真空チャンバー内で 20 分間で金型をドガします。
3. 非対流のオーブンで 90 分の 65 ° C で硬化後、金型を PDMS 層の皮をむくし、生検パンチを使用流体チャンネルにアクセス穴をパンチします。
   注意: 花粉管装置の穴のサイズは雌しべの直径に合わせて調整する必要があります。したがって、この値は、種によって異なります。この実験では、雌しべの吸気 1 mm の穴および液体の中の貯水池の 1.5 mm の穴をパンチしました。コケ原糸体デバイスの 4 mm の穴は、サンプル保存容器に使われました。
4. 50 のプラズマを空気に PDMS 層とガラス底皿 (直径 3.5-5 cm) を公開 s。
5. 微小流体ネットワークを完全に封鎖する非対流オーブンで 30 分間ガラス底皿と 65 °....

Results

図 1に示すように、植物細胞の先端成長の成長パスの vivoに沿って物理的な障壁のシリーズに遭遇します。本論文で示したセル文化プラットフォーム マイクロ流体の in vitro試験を有効に、先端成長の植物細胞 (花粉管、根毛、コケ原糸) を 1 μ m の人工の隙間 (図 3からの 3 つのタイプのプロセス図 4図 5)。花粉管の調査では、住セルイメージ投射は花粉管と同様の栄養核の根尖部の形態変化と (補足ムービー 1 と 2) の非常に小さいスペースを発生する応答内の精細胞を監視する使用されました。

我々 はそれらのいくつかが完全に気づいたが、m.......

Discussion

プロトコルのいくつかの重要な手順は、上記に示した結果を得るために正確に続くことに必要があります。まず、PDMS 層およびガラス底皿の表面両方扱われなければならないプラズマ接合前に、の時間の十分な量の。それ以外の場合、先端成長のセルは、microgaps を交差させている間、ガラス面から PDMS 層可能性がありますデタッチ ローカル。根毛とコケ原糸体のプロトコルの別の重要なステップは、マイクロの殺菌です。通常、根毛とコケ原糸体細胞は数週間のカップルのためのマイクロで培養する必要があります。デバイスを滅菌せずこれらのヒント成長細胞の成長に影響するかもしれない微生物は活気づくかもしれない。半日以内実験を締結以来、花粉管デバイスの滅菌は、重要ではありません。我々 は定期的に滅菌せず花粉管デバイスを使用しているし、実験中に任意の望ましくない影響を観察しなかった。

マイクロ デザインは、興味のセルに従って変更する必要があります。我々 の仕事でシロイヌナズナ根毛の実験のために使用されるチャネルの設計はt. について花粉管とヒメツリガネゴケ原.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
PDMS	ダウコーニング株式会社	Sylgard184
村重 &スクーグ ミディアム	和光純薬	392-00591
MES	同人堂	345-01625
ショ糖	和光純薬	196-00015
50 mm ガラス底皿	松波 ガラス	D210402
35 mm ガラス底皿	いわき	3971-035
外科用刃	フェ	ザーNo.11
生検パンチハリ	ス		ユニコア
ゲルローディングのヒント	バイオビック	124-R-204
倒立顕微鏡	オリンパス	IX83
CSU-W1	河電機		カタログ番号は、このカスタマイズされた顕微鏡
のために利用可能ですMetaMorphイメージングソフトウェア	Molecular Devices