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方法論記事

新生児マウス脳の線条体細胞の遺伝的操作の定位手術

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DOI:

10.3791/57270

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2018年7月10日

 ,  , 
1Institute of Neuroscience, National Yang-Ming University, 2Brain Research Center, National Yang-Ming University

この記事について

サマリー

新生児マウス脳の線条体にマイクロインジェクション試薬は自家製頭固定デバイスに定位手術のプロトコルについて述べる。この手法では、新生児マウス脳の特定の領域の神経細胞で遺伝子操作ことができます。

要約

多くの遺伝子は萌芽期の脳で表されます、それらのいくつかは継続的に出生後、脳で表現されます。このような永続的に表現された遺伝子の彼らは、発達過程や新生児の脳の生理機能を調節する機能があります。脳の特定の遺伝子の神経生理機能を調べるためには、脳における遺伝子を不活化する不可欠です。ここでは、新生児のタイム ・ ウィンドウでトランスジェニック マウス線条体における遺伝子発現の不活化する簡便な脳定位固定装置について述べる。Microinjected AAV eGFP Cre ウイルスはあった生後日 (P) 定位脳手術による 2 Ai14 レポーター遺伝子マウスの線条体に。P14 線条体、成功の Cre loxP AAV 導入線条体細胞での DNA 組換えを介した示唆 tdTomato レポーター遺伝子発現が検出されました。さらに、P2Foxp2フロリダ州/フロリダマウスに AAV eGFP Cre ウイルス マイクロインジェクションによるこの技術を検証しました。GFP と Foxp2 の二重ラベル GFP 陽性細胞に導入 AAV eGFP Cre 線条体における Foxp2 蛋白質の損失を示唆、P9 の線条体の Foxp2 を免疫反応性が欠けていたことを示した。一緒に取られて、これらの結果は、floxed トランスジェニック マウスの新生児の脳の特定の神経細胞集団におけるてんかん microinjected AAV eGFP Cre ウイルスによって効果的な遺伝子欠失を示します。結論としては、私たちの脳定位固定装置の手法は、新生児マウス脳における遺伝子操作の簡単でシンプルなプラットフォームを提供します。テクニックだけが使えないことが新生児の脳の特定の領域に遺伝子を削除するが、それはまた、薬の薬理学的、神経トレーサー、遺伝子組み換えの研究と chemogenetics タンパク質、神経活動の指標を注入する使用ことができ、新生児マウス脳の線条体に他の試薬。

概要

構造の近代的な研究と脳の機能が神経細胞の特定の遺伝子の遺伝的操作を通常要求します。完全、トランスジェニック マウスを含む突然変異体の対立遺伝子を運ぶの異なる遺伝子の機能を調べるため、ノックアウト、ノックイン対立遺伝子を定期的に生成されます。大人の齧歯動物の脳定位固定脳外科手術は、ローカル齧歯動物の頭脳1,2の特定の領域に薬物、ウイルス、トレーサーおよびその他の試薬を提供する標準的な方法です。トランスジェニック マウスに定位脳手術を適用することにより、遺伝子遺伝子機能およびマウス脳の特定の神経集団の神経活動を操作する 1 つ。セル型固有の操作は、脳の3,4、5の複雑な神経回路の神経機能を解読する強力なアプローチを提供します。

神経系の神経系の発達が初期胚の段階から始まり、幼齢期まで生後後発達プロセス続行します。神経系の成熟生後には6脳の生理学的および認知機能のために不可欠である正確なシナプス神経回路網の配線が含まれます。したがって、新生児のタイム ・ ウィンドウで発生する発達のイベントの勉強は通常の神経系の発達を理解するためだけではなく重要ですが、また神経発達や精神疾患7 の病因に洞察力を提供することがあります。 ,8。大人の齧歯動物の脳定位固定脳外科手術の方法がすぐに利用できる2,9, いくつかのプロトコルが新生児マウス10,11脳定位固定脳外科手術のためのインターネットで利用できます。実際には、マウスの新生仔ラットの脳に試薬の脳定位固定装置の薬剤は困難、新生児子犬の頭は非常に傷つきやすい標準脳定位固定装置で固定されるためです。それにもかかわらず、トランスジェニック マウスへの定位脳手術の適用は新生児マウス12可能です。ここでは、マウスの新生仔ラットの脳定位固定脳外科手術を実行する自家製セットアップと簡単な方法をについて説明します。このテクニックにより、レポーター遺伝子マウスおよび条件付きで floxed トランスジェニック マウスの線条体に Cre DNA の AAV 表現の recombinase マイクロインジェクションによる floxed 遺伝子を条件付きで削除する 1 つを示します。この方法は、野生型マウスの新生児の線条体に試薬を提供するも。

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プロトコル

ここで説明した動物のプロトコルは、動物のケアと使用国立陽明大学委員会によって承認されています。

1. 新生仔脳定位固定装置のホルダーの準備

  1. 頭のトレイを作る: 管の壁の 1/5 を削除することによって新生児子犬の頭にフィットする形状に 1.5 mL 遠心チューブ (15 mm 長い) の下部をカットします。
  2. 脳定位固定装置の台座に合った適切なサイズのピペット チップ ボックスを取るし、上部カバーを取り外します。手順 1.1 ・熱溶融接着剤で先端トレイのベースの上に組織の埋め込みカセットで頭のトレイに貼付します。組織の埋め込みカセットの高さは 7 mm、ヘッド固定位置で子犬の首と体をサポートするものです。
  3. 標準的な脳定位固定装置の全体のセットアップを配置します。

2. 30 G 注射ステンレス針の準備

  1. 3 日間のクロロホルムでそれらを浸すことによってクリーン前 30 G 注射針。
  2. 慎重に、ゆっくりと引き出す針化学フードをポリプロピレン ハブから鉗子を使用します。
  3. 無水エタノール 50 rpm でシェーカーの 3 × 10 分の 70% のエタノールの洗浄に続いて 20 分針を洗います。使用するまで針の空気乾燥し、室温 (RT) でクリーン ボックスの洗浄針を保存してみましょう。

3. マイクロインジェクション チューブ用アダプターを準備します。

  1. PE10 ポリエチレン管 (PE10 チューブ) 30 G 注射針 1 マイクロリットル注射器に接続します。1 マイクロリットルの注射器と注射針をブリッジの PE20 ポリエチレン チューブ (PE20 チューブ) アダプターを準備します。アダプターの使用は、PE10 チューブの直径は 26 G 1 マイクロリットル シリンジの針よりもかなり小さいため、必要です。
  2. 1 マイクロリットル注射器にチューブを準備: PE20 チューブ 5 cm と事前にクリーンアップされた 30 G 注射針を接続し、瞬間接着剤との接合部をシールします。このチューブ アダプターは再利用です。
    注: 場合のインジェクション注射器の針は 30 G、調製 (ステップ 3.1) とその利用 (ステップ 3.3) このアダプターの必要はありません。
  3. 1 マイクロリットル注射器 (10 μ L) (3.1 の手順で準備) チューブ アダプターを接続します。
  4. PE20 チューブ アダプターの 30 G 針に (ない 60 cm 以上) PE10 チューブの一方の端を接続します。PE10 チューブのもう一方の端に新しい 30 G 注射針をマウントします。

4. オートクレーブ蒸留水、染料とウイルスのインジェクション チューブをロードします。

  1. 1 マイクロリットル シリンジのプランジャーを取り外します。25 G の注射器を使用して、1 マイクロリットル注射器とオートクレーブ蒸留水、チューブから空気を削除するとその接続の PE 管を読み込みます。
  2. 戻る 1 マイクロリットル シリンジのプランジャーを置き、プランジャー バレルのままに蒸留水の 2 μ L まで。2 μ L よりも低くなる蒸留水の量を聞かせてはいけません。
  3. マイクロ フロー レート シリンジ ポンプに 1 マイクロリットル注射器を慎重にマウントします。
  4. 少量の 0.1% 高速グリーン色素 (0.9% 生理食塩水に用意され、0.22 μ m フィルターでフィルタ リング) とパラフィルムの部分にウイルス液をピペットします。
  5. マイクロインジェクション チューブで流体の流れをテストする 30 G 注射針とチューブへのフィルタ リングの高速グリーンの 0.7 μ L の読み込みに続いて PE10 チューブの間のジャンクションで気泡を表示するへの空気の少量を撤回します。
  6. 空気を抜いてマイクロインジェクション チューブにウイルス液を読み込むことによって続いて第 2 気泡の別の少量を撤回します。
  7. 添付し、脳定位固定装置のアームに 30 G マイクロインジェクション針を固定します。

5. 低体温による新生児マウスの麻酔

  1. ラテックス手袋スリーブに子犬を置き、5 分間の首まで砕いた氷に浸します。
  2. 子犬の足を確認の足の撤退応答に鉗子でつまみます。
  3. 頭のトレイにラテックス手袋スリーブと子犬を置き、低体温麻酔の寒さを維持するラテックス スリーブ周り砕いた氷を入れた。
  4. 可能であれば麻酔中の乾燥を防ぐために子犬の目に獣医軟膏を適用します。

6. マイクロインジェクション

  1. 70% エタノールで十分に脳定位固定装置を拭くことによって生殖不能手術を準備します。70% エタノールに浸漬した手術器具を滅菌します。
  2. 70% エタノールで子犬の頭をごしごし洗いなさい。頭蓋のランドマーク ラムダを探し、マーカーペンでラムダをマークします。ラムダに針の先端を目指して、ゼロとして前後 (AP) と内側-外側 (ML) 座標を設定します。
  3. 注射の腕をターゲット サイトの X および Y 座標によるとターゲット ・ サイトに移動します。生後一日 (P) 2 の線条体の子犬、座標は、: AP、ラムダ; 前方 +2.4 mmML、± 1.0 mm; 正中線から外側背腹軸 (DV)、頭蓋骨から −1.7 mm。PE10 管内高速グリーン色素の位置をペンでマークします。
  4. 皮膚と頭蓋骨を貫通するゆっくりと 30 G の注射針をダウンさせるし、頭蓋骨の表面で停止するまで針の先端をもたらします。ゼロとして DV 座標を設定します。
  5. ターゲット ・ サイトの DV 座標に到達するまでゆっくりと 30 G の注射針をダウンさせます。実質通常の形状の再開を許可する 1 分待ちます。マイクロインジェクション プログラム (100 nL/min) を実行します。
  6. 高速グリーンの色素のマークが脳にウイルス液を注入できるように PE 管で動いていることを確認します。
  7. マイクロインジェクションの終了後 1 分待つし、DV 深さ 30 以内の高さの 1/2 に針をゆっくりと徐々 に戻して s。30 後 s、子犬の頭から針をゆっくりと引き出します。
  8. すべてのターゲット サイトの薬剤が完了するまで、手順 6.2 に 6.7.

7 子犬の手術後の回復

  1. 33 ° C の定温器で 20 分間子犬を暖かい。子犬は胸骨の横臥を維持するために十分な意識を取り戻したまで低体温麻酔 5 分ごとから子犬の回復を確認します。
  2. 子犬は完全に回復した後、子犬をダムに戻ります。

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結果

実験の最初のセットに我々 microinjected 200 Ai14 マウスの P2 線条体に GFP 融合エクスプレス DNA Cre リコンビナーゼ AAV9.hSynapsin.HI.eGFP Cre.WPRE.SV40 ウイルス (AAV-eGFP-Cre、ダルベッコ リン酸緩衝生理食塩水で 1/10 希釈) の nL。Ai14 マウスは、loxP 並ぶ (floxed) 停止カセット (図 2 f) の削除を Cre を介した tdTomato レポーターの遺伝子を表現します。脳は、GFP と tdTomato の免疫染色の P14 に収穫されました。多くの AAV が GFP 陽性細胞を導入した (図 2 a, C)、線条体全体で現在 AAV eGFP Cre ウイルスによって線条体細胞の広範な感染を示します。TdTomato のような広範な表現も、線条体 (図 2...

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ディスカッション

本研究では新生児マウス脳の線条体に AAV ウィルスを注入するシンプルで信頼性の高い定位法を紹介します。我々 は P2 で Ai14 レポーター マウスの線条体に AAV eGFP Cre ウイルスを microinjected し、P14、レポーター遺伝子の発現を分析します。AAV 導入 GFP 陽性細胞は rostrocaudal レベルで線条体全体がわかった。さらに、ほぼすべての GFP 陽性細胞は共同 AAV による Cre 活性の発現によって誘導される成功, DNA 組換えを示唆、線条体における tdTomato レポーターの遺伝子を表現しました。さらに P2 で線条体Foxp2フロリダ州/フロリダマウスに AAV eGFP Cre の薬剤によりこのアプローチの有効性を確認しました。二重ラベル通気導入 GFP 陽性細胞は多くに新生児線条体におけるFoxp2遺伝子の正常に条件付き削除を示唆、P9 の線条体の Foxp2 を免疫反応性が欠けていたことを示した。Microinjected 通気量は、感染した脳の領域のサイズに関連付けられます。200 と噴射量の nL、GFP ...

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開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

この作品は科学省によって支えられた、パワーオプティマイザーの技術は MOST104-2311-B-010-010-MY3、MOST106-2321-B-010-012、国家衛生研究院を与える NHRI-EX106-10429NI と注目領域研究センター プログラム助成脳研究センター、台湾国立陽明大学を通して教育省・員 MOST106-2811-B-010-031 (s ・ エンライテンメント)、MOST105-2811-B-010-036 MOST106-2811-B-010-030 (H. 社長交代)。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
30G PrecisionGlide ニードルベクトン ディキンソンREF 305106
クロロホルムJT ベイカー9180-03
ハミルトン マイクロリットル シリンジハミルトン 8030030Gの針はPE10の管のための適合; 26Gの針はPE20アダプター
ポリエチレンの管 PE20Becton Dickinson427406
ポリエチレンの管 PE10Becton Dickinson427401
マイクロ フロー レート シリンジ ポンプLongerの精密ポンプCo.TJ-2A(コントローラー)およびL0107-2A(ドライブユニット)
25Gシリンジベクトン・ディッキンソンREF 302105
ファストグリーンシグマ・アルドリッチF-72520.1%
標準 固定装置FRB)6803768030を使用しない マウス/新生児ラットアダプター
抗FOXP2抗体アブカムab16046ウサギポリクローナルからFOXP2、1:4,000
抗RFP抗体Abcamab65856マウスモノクローナル RFP, 1:1,000
BX63 顕微鏡オリンパスBX63
LSM 880 共焦点顕微鏡ツァイスLSM 880
ヤギ 抗ウサギ抱合 アレクサ fluor594ジャクソン lmmunoReserch Laboratories Inc.111-585-003
AAV9.hSynapsin.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40Penn Vector CoreAV-9-PV1848Lot # CS0987, 5.506x1013 (GC/mL)
AAV9.chicken actin-eGFPAAV core, Institute of Biomedical Sciences, Academia Sinica, TaiwanN/A1x1014 (GC/ml)
B6.CG-GT(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/Jジャクソン研究所 007914Ai14
B6(CG)-Foxp2tm1.1Sfis/CfreJジャクソン研究所 026259Foxp2fl/fl
>ダルベッコ'リン酸緩衝生理食塩水コーニング セルグロ21-030-CVR
( ライフサイエンス

参考文献

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