新生児マウス脳の線条体にマイクロインジェクション試薬は自家製頭固定デバイスに定位手術のプロトコルについて述べる。この手法では、新生児マウス脳の特定の領域の神経細胞で遺伝子操作ことができます。
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この記事について
サマリー
要約
多くの遺伝子は萌芽期の脳で表されます、それらのいくつかは継続的に出生後、脳で表現されます。このような永続的に表現された遺伝子の彼らは、発達過程や新生児の脳の生理機能を調節する機能があります。脳の特定の遺伝子の神経生理機能を調べるためには、脳における遺伝子を不活化する不可欠です。ここでは、新生児のタイム ・ ウィンドウでトランスジェニック マウス線条体における遺伝子発現の不活化する簡便な脳定位固定装置について述べる。Microinjected AAV eGFP Cre ウイルスはあった生後日 (P) 定位脳手術による 2 Ai14 レポーター遺伝子マウスの線条体に。P14 線条体、成功の Cre loxP AAV 導入線条体細胞での DNA 組換えを介した示唆 tdTomato レポーター遺伝子発現が検出されました。さらに、P2Foxp2フロリダ州/フロリダマウスに AAV eGFP Cre ウイルス マイクロインジェクションによるこの技術を検証しました。GFP と Foxp2 の二重ラベル GFP 陽性細胞に導入 AAV eGFP Cre 線条体における Foxp2 蛋白質の損失を示唆、P9 の線条体の Foxp2 を免疫反応性が欠けていたことを示した。一緒に取られて、これらの結果は、floxed トランスジェニック マウスの新生児の脳の特定の神経細胞集団におけるてんかん microinjected AAV eGFP Cre ウイルスによって効果的な遺伝子欠失を示します。結論としては、私たちの脳定位固定装置の手法は、新生児マウス脳における遺伝子操作の簡単でシンプルなプラットフォームを提供します。テクニックだけが使えないことが新生児の脳の特定の領域に遺伝子を削除するが、それはまた、薬の薬理学的、神経トレーサー、遺伝子組み換えの研究と chemogenetics タンパク質、神経活動の指標を注入する使用ことができ、新生児マウス脳の線条体に他の試薬。
概要
構造の近代的な研究と脳の機能が神経細胞の特定の遺伝子の遺伝的操作を通常要求します。完全、トランスジェニック マウスを含む突然変異体の対立遺伝子を運ぶの異なる遺伝子の機能を調べるため、ノックアウト、ノックイン対立遺伝子を定期的に生成されます。大人の齧歯動物の脳定位固定脳外科手術は、ローカル齧歯動物の頭脳1,2の特定の領域に薬物、ウイルス、トレーサーおよびその他の試薬を提供する標準的な方法です。トランスジェニック マウスに定位脳手術を適用することにより、遺伝子遺伝子機能およびマウス脳の特定の神経集団の神経活動を操作する 1 つ。セル型固有の操作は、脳の3,4、5の複雑な神経回路の神経機能を解読する強力なアプローチを提供します。
神経系の神経系の発達が初期胚の段階から始まり、幼齢期まで生後後発達プロセス続行します。神経系の成熟生後には6脳の生理学的および認知機能のために不可欠である正確なシナプス神経回路網の配線が含まれます。したがって、新生児のタイム ・ ウィンドウで発生する発達のイベントの勉強は通常の神経系の発達を理解するためだけで....
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プロトコル
ここで説明した動物のプロトコルは、動物のケアと使用国立陽明大学委員会によって承認されています。
1. 新生仔脳定位固定装置のホルダーの準備
- 頭のトレイを作る: 管の壁の 1/5 を削除することによって新生児子犬の頭にフィットする形状に 1.5 mL 遠心チューブ (15 mm 長い) の下部をカットします。
- 脳定位固定装置の台座に合った適切なサイズのピペット チップ ボックスを取るし、上部カバーを取り外します。手順 1.1 ・熱溶融接着剤で先端トレイのベースの上に組織の埋め込みカセットで頭のトレイに貼付します。組織の埋め込みカセットの高さは 7 mm、ヘッド固定位置で子犬の首と体をサポートするものです。
- 標準的な脳定位固定装置の全体のセットアップを配置します。
2. 30 G 注射ステンレス針の準備
- 3 日間のクロロホルムでそれらを浸すことによってクリーン前 30 G 注射針。
- 慎重に、ゆっくりと引き出す針化学フードをポリプロピレン ハブから鉗子を使用します。
- 無水エタノール 50 rpm でシェーカーの 3 × 10 分の 70% のエタノールの洗浄に続いて 20 分針を洗います。使用するまで針の空気乾燥し、室温 (RT) でクリーン ボックスの洗浄針を保存してみましょう。
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結果
実験の最初のセットに我々 microinjected 200 Ai14 マウスの P2 線条体に GFP 融合エクスプレス DNA Cre リコンビナーゼ AAV9.hSynapsin.HI.eGFP Cre.WPRE.SV40 ウイルス (AAV-eGFP-Cre、ダルベッコ リン酸緩衝生理食塩水で 1/10 希釈) の nL。Ai14 マウスは、loxP 並ぶ (floxed) 停止カセット (図 2 f) の削除を Cre を介した tdTomato レポーターの遺伝子を表現します。脳は、GFP と tdTomato の免疫染色の P14 に収穫されました。多くの AAV が GFP 陽性細胞を導入した (図 2 a, C)、線条体全体で現在 AAV eGFP Cre ウイルスによって線条体細胞の広範な感染を示します。TdTomato のような広範な表現も、線条体 (図 2.......
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ディスカッション
本研究では新生児マウス脳の線条体に AAV ウィルスを注入するシンプルで信頼性の高い定位法を紹介します。我々 は P2 で Ai14 レポーター マウスの線条体に AAV eGFP Cre ウイルスを microinjected し、P14、レポーター遺伝子の発現を分析します。AAV 導入 GFP 陽性細胞は rostrocaudal レベルで線条体全体がわかった。さらに、ほぼすべての GFP 陽性細胞は共同 AAV による Cre 活性の発現によって誘導される成功, DNA 組換えを示唆、線条体における tdTomato レポーターの遺伝子を表現しました。さらに P2 で線条体Foxp2フロリダ州/フロリダマウスに AAV eGFP Cre の薬剤によりこのアプローチの有効性を確認しました。二重ラベル通気導入 GFP 陽性細胞は多くに新生児線条体におけるFoxp2遺伝子の正常に条件付き削除を示唆、P9 の線条体の Foxp2 を免疫反応性が欠けていたことを示した。Microinjected 通気量は、感染した脳の領域のサイズに関連付けられます。200 と噴射量の nL、GFP .......
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開示事項
著者が明らかに何もありません。
謝辞
この作品は科学省によって支えられた、パワーオプティマイザーの技術は MOST104-2311-B-010-010-MY3、MOST106-2321-B-010-012、国家衛生研究院を与える NHRI-EX106-10429NI と注目領域研究センター プログラム助成脳研究センター、台湾国立陽明大学を通して教育省・員 MOST106-2811-B-010-031 (s ・ エンライテンメント)、MOST105-2811-B-010-036 MOST106-2811-B-010-030 (H. 社長交代)。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 30G PrecisionGlide ニードル | ベクトン ディキンソン | REF 305106 | |
| クロロホルム | JT ベイカー | 9180-03 | |
| ハミルトン マイクロリットル シリンジ | ハミルトン | 80300 | 30Gの針はPE10の管のための適合; 26Gの針はPE20アダプター |
| ポリエチレンの管 PE20 | Becton Dickinson | 427406 | |
| ポリエチレンの管 PE10 | Becton Dickinson | 427401 | |
| マイクロ フロー レート シリンジ ポンプ | Longerの精密ポンプCo. | TJ-2A(コントローラー)およびL0107-2A(ドライブユニット) | |
| 25Gシリンジ | ベクトン・ディッキンソン | REF 302105 | |
| ファストグリーン | シグマ・アルドリッチ | F-7252 | 0.1% |
| 標準 固定装置 | FRB) | 68037 | 68030を使用しない マウス/新生児ラットアダプター |
| 抗FOXP2抗体 | アブカム | ab16046 | ウサギポリクローナルからFOXP2、1:4,000 |
| 抗RFP抗体 | Abcam | ab65856 | マウスモノクローナル RFP, 1:1,000 |
| BX63 顕微鏡 | オリンパス | BX63 | |
| LSM 880 共焦点顕微鏡 | ツァイス | LSM 880 | |
| ヤギ 抗ウサギ抱合 アレクサ fluor594 | ジャクソン lmmunoReserch Laboratories Inc. | 111-585-003 | |
| AAV9.hSynapsin.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 | Penn Vector Core | AV-9-PV1848 | Lot # CS0987, 5.506x1013 (GC/mL) |
| AAV9.chicken actin-eGFP | AAV core, Institute of Biomedical Sciences, Academia Sinica, Taiwan | N/A | 1x1014 (GC/ml) |
| B6.CG-GT(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J | ジャクソン研究所 | 007914 | Ai14 |
| B6(CG)-Foxp2tm1.1Sfis/CfreJ | ジャクソン研究所 | 026259 | Foxp2fl/fl |
| >ダルベッコ'リン酸緩衝生理食塩水 | コーニング セルグロ | 21-030-CVR |
参考文献
- Athos, J., Storm, D. R. High precision stereotaxic surgery in mice. Current Protocols in Neuroscience. , Suppl ement 14. Appendix 4, Wiley Online Library A.4A.1-A.4A.9 (2001).
- Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. Stereotaxic gene delivery in the rodent brain. Nat. Protoc. 1
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