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方法論記事

サンプリング戦略とブタの生物医学的モデルからバイオバンク組織サンプルの処理

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DOI:

10.3791/57276

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2018年3月6日

 , 
1Institute of Veterinary Pathology at the Centre for Clinical Veterinary Medicine, LMU Munich

この記事について

サマリー

バイオバンク プロジェクトの下流解析の広範なスペクトルのブタの動物モデルの代表的な組織サンプルの生成法の性能と実用を実証、超高速を含む体系的なランダム サンプリング定性・定量形態学上および分子分析型の組織サンプルの差分処理。

要約

医学トランスレーショナルリサーチのブタのモデルはより人気となって着実にいます。モデル、およびこれらのモデルの使用可能な動物の多くの場合限られた数の遺伝子組み換え豚を中心に、個々 の動物の高い値を考慮した、適切に処理された組織サンプル集 (バイオバンク) の確立に最適、以降の解析方法、サンプリングの時点で指定されていない解析などの広範なスペクトルを表すモデルの直線移動の値をフル活用する意味のあるアプローチ。ブタの解剖学の特性に関して包括的なガイドラインは標準化された世代代表、異なるブタの臓器や組織からの質の高いサンプルの最近確立されています。これらのガイドラインは、結果および比較可能性さまざまな研究と研究者間の再現性の重要な前提条件です。臓器重量とボリューム、生成される定量サンプリング場所および組織サンプルの番号と同様に自分の向き、サイズ、処理およびトリム方向などの基本的なデータの記録、関連する要因一般化と分子、定性的手法と定量的形態解析用の標本の有用性を決定します。ここでは、代表の世代の最も重要な技術の説明、実用的なステップバイ ステップ サンプル、ブタの組織から多目的バイオバンク検体が提示されます。ここで説明した方法があります決定臓器のボリュームと密度の実質臓器組織収縮の範囲のポイントを数える測定による出来高で加重された体系的なランダム サンプリング プロシージャのアプリケーションサンプル、および垂直な制服と"Orientator"と"Isector"メソッドが生成された等方性一様ランダム (フェース) セクションなど、定量的な薬剤分析ランダム配向試料の世代の組織学的埋め込みに関連ランダム (VUR) セクション。

概要

大動物モデル1,2,3,4、5、ブタの間いくつかの有利な類似のために医学の豚用ますます一般的なものと人体解剖学と生理学との生成を可能にする確立された分子生物的方法の可用性は、合わせて、豚モデル疾患条件1,4の広い範囲のための遺伝子組換え。

しかし、齧歯動物モデルと比較して、いつでも実験のため提供することができますそれぞれの豚のモデルの動物の数は限られています。これは約 1 年と世代の豚のモデルおよび動物飼育のために必要な金融と時間のかかる努力のブタの世代間隔が原因です。したがって、これらの豚から生成することができますサンプルと同様に、ブタのモデルの個々 の動物、遺伝子組み換え豚モデルおよび/または長期の実験問題 (例えば、晩期合併症の場合は特に、非常に貴重です高齢者2,6,7慢性疾患) について説明します。

後で関連性の高いことが判明して可能性がありますいない研究の初期の実験的設計で予定されていた追加解析のパフォーマンス任意の研究の過程で例えば、以前から生じる個別の質問を発見したアドレスに意外な発見。このような追加実験のための適切なサンプルが利用できない disproportionally 高いコストと時間のかかる支出は、追加の豚や組織サンプルを生成する必要あります。そのような事態に備えてするには、バイオバンクのさまざまな器官、組織、またはバイオ液体、量的そして質的幅広い以降の解析に適した保存バックアップ サンプル集の生成、重要と考えられる2,6,7に近づきます。ブタの動物モデルからの最適の利点を派生する、適切なバイオバンク サンプルの可用性で多臓器レベルで同一のサンプル素材にさまざまな分析方法の広範なスペクトルを実行する独自の可能性を提供しています、非常に同じ個々 の動物、例えば、さまざまなワーキング ・ グループの科学者にサンプルの分布によって組織された研究ネットワーク2,6,7。さらに、biobanking の「将来」のサンプリング戦略研究に必要な動物数削減にも貢献しています。ブタのモデル biobanking の利点は、最近多臓器、臓器を調べる multiomics 研究で実証されているミュンヘン MIDY 豚バイオバンクから試験片を使用して、長期的な糖尿病の遺伝子組み換えブタモデルにおけるクロストーク2。

実行後の分析の結果の解釈可能性と信頼性を確立する一般的に遵守しなければならないバイオバンク サンプルいくつかの必須要件があります。サンプルを再現性をもって発生する必要があります、彼らは十分に代表、すなわちをある必要があります7から採取した組織・臓器の興味の形態学的および分子機能を反映しています。下流解析のタイプの広い範囲に適していること、サンプルする必要があります十分な量での撮影、説明を含む様々 な分析方法の要求 (時間と温度条件を含む) に従って処理されます。cryohistology、パラフィン、プラスチック組織学、免疫組織化学の in situハイブリダイゼーション、微細構造の電子顕微鏡解析、臨床検査診断分析、同様に分子などの病理組織学的解析DNA、RNA、蛋白質、および代謝物の分析。

番号、ボリューム、長さ、表面積の異なる組織構造など個別の定量形態学的パラメーターの広い範囲の評価定量的薬剤分析できるように、ランダム化されたセクションの平面、それぞれの臓器・組織の組織サンプルは、7、8,9,10,11を準備する必要があります。(すなわち、空間参照) から撮影されたサンプルの定量形態学的研究、組織や臓器、器官のコンパートメントの合計量の精密測定は、決定的に重要な7,9,12それぞれの臓器、組織、または有機体内の興味がパラメーターの絶対的な数量を計算します。最終的には、組織切片の作製中に埋め込みに関連する組織収縮効果が決定しアカウント13に。したがって、定量的な薬剤試料の分析、特にアーカイブ (組織サンプル、埋め込まれたティッシュのブロック、標本等を固定) 前の調査から、時々 厳しく制限あるいは不可能12、します。数と利用可能な個々 のサンプルの量が十分な場合、代表的なサンプルを保証する十分なサンプリングのデザインが適用されていない場合、それぞれの臓器・組織の超高速を実行しなかった場合に特にまたは場合の処理、サンプルは、関心の定量形態学的パラメーターの推定と互換性がありません。マニホールドの可能な要因による個別の定量形態学的パラメーターの解析アーカイブ サンプル材料の適合性ははっきりと答えることができない、個々 のケースごとの慎重な評価によります。

したがって、場所、サイズ、数、処理、トリミング方向、およびサンプルの向きが可能性があります以降の解析の結果に影響を与える、これらの要因は非常に重要なは、任意の研究の実験の設計で考慮する必要があります。これらの側面およびブタの解剖学、ブタに適応の動物モデルが確立されている最近の包括的な, 詳細な, 大規模なサンプリング ガイドラインの特徴に関して標準化された、再現性のある堅牢な参照を提供します。、および 50 を超える異なるブタ臓器や組織6,7から冗長、適切に処理された、高品質のサンプルの効率的な生成。

方法論の説明と本稿で示すビデオ チュートリアルを提供様々 な超高速、技術の実用性能の手順詳細、説明でわかりやすくの手順でブタ組織のサンプリングと臓器と異なる下流解析のための組織サンプルの処理。関連組織の三次元収縮寸法の測定を含む注目のテクニックは臓器のボリュームとアルキメデスとカヴァリエーリの9の原則に基づいて密度の定量方法など、病理検査の処理中に別の埋め込みメディア14に埋め込み、実用的な出来高で加重された体系的なランダム サンプリングのアプリケーションに近づくと、サンプリングされた組織検体の処理別以降分析7,8,9,15と世代の適切な指向し、潜在的な薬剤の定量的解析7、8のサンプルを処理 9,10,11。ブタ バイオバンクのプロジェクトで彼らのアプリケーションの横に示されたメソッドは、一般的にすべての臓器・組織の病理組織形態の定量的なプロパティを調べることの研究の適切です。さらに、体系的なランダム サンプリングのデザインが世代の豊富な変化、例えばRna、蛋白質、または代謝産物を検出する分子の解析手法を用いた実験の代表的なサンプルのため特に有益ですさまざまな臓器や組織。

次の段落は、その実用性能がプロトコル」に記載されている間にこれらのメソッドを簡単に紹介を提供します。

臓器ボリュームの定量
器官の重量とボリュームの決定は、いくつかの実験的設定の重要な可能性がありますこれらの要因として実験的に関連する可能性のある変更を調べた関心の要因臓器・組織の総量もよく絶対定量的なパラメーター (例えば、総セル数)、stereologically 推定数値ボリューム密度 (すなわち、ボリューム単位セルの数からの計算に必要な組織) の7,12。コンピューター断層撮影などの複雑な技術的な装置を使用してのテクニックとは別に基本的に器官またはティッシュの絶対量を決定するために一般的に使用される 3 つの実用的な方法があります。器官のボリュームは、「直接体積測定」すなわち、アルキメデスの原理によると、水または完全に浸漬した場合の構造によって転置された生理食塩水の量を測定して決定できます。ただし、対等に大きいブタ器官のこれらのアプローチは非現実的であり、不正確さをしやすい非常に大きい容積測定フラスコを要求するので。便利に、臓器・組織のボリュームはその密度と重量7,12,16、「水没法」7,12 を使用して効率的に判断できます。 から計算できます ,16 (プロトコル手順 1.1)。(1598-1647)「カバリエリの原理」に基づく超高速アプローチを使用しても、臓器・組織ボリュームを推定できます。簡単に言えば、カヴァリエリの原理の状態、地面に平行平面の区分である 2 つのオブジェクトと対応するで 2 つのオブジェクトをセクションのプロファイルをカットする場合、地面からの距離で 2 つのオブジェクト、同じエリアがあります。同じボリュームを持っています。したがって、並列、等しく遠く離れている断面平面と断面平面間の距離で、プロファイル断面の製品として任意形状オブジェクトのボリュームを推定できます。これは次の類推で理解できる: 同じ硬貨の同じ数から成る 2 つのスタックは、サイドバイ サイド、コイン整然としたコイン スタック等の円筒形の降伏、互いの上に積み上げ、1 つのスタックの配置検討します。オフセンターの硬貨のスタックには、コイン (図 3 a) が配置されます。両方のコイン スタックの形状が異なる、ボリュームが同じで、両方のスタックの対応するレベルでコインの区域以来 (すなわち、並列セクションのプロフィールの部分はから同じ距離で両方のコイン スタックを介してカット、地面) と同じです。ブタの臓器や組織は、カヴァリエリの原理7,12,15を使用してのボリュームの推定、1.2 の手順で説明します。

組織学的埋め込みに関連する組織の収縮の程度の決定
組織切片で測定するいくつかの定量的形態学的パラメーターの解析では、ティッシュの組織学のための処理中に発生した埋め込みに関連する組織収縮効果決定し、考慮しています。埋め込みに関連する組織の収縮の範囲変数、組織、その処理と埋め込み中8,13,17,18,19に依存します。一般的に、埋め込み関連組織サンプル (すなわち、ほとんど収縮) の容積の変化領域、および、したがって、すべての 3次元パラメーター推定定量化薬剤分析8 に影響を与えるすべての 3 つの次元で.基本的には、手順 1.3 に示すように埋め込みに関連する組織の収縮は、線形組織収縮因子 (fS) として表現の程度を推定できます。(収縮に敏感な) 定量的形態パラメーター14の補正のために使用されます。

出来高で加重された臓器・組織の体系的なランダム サンプリング
ブタ臓器試料のバイオバンク コレクションの構築、手順 2 で説明したように出来高で加重された体系的なランダム サンプリングの手法が代表者の世代の実用的な時間の節約と効率的なテクニックをあることを証明します。多目的組織サンプル7,8,9,15です。

薬剤の定量解析の等方性均一ランダム セクションおよび均一ランダム垂直セクションの生成
バイオバンク組織サンプルは、適切に準備された標本なしできなかったパラメーターの最大値の推定のための異なる定量的解析方法の広い範囲に適している必要があります。「等方性 (独立) 均一ランダム (フェース) セクション「8,9を使用して、ほぼすべての定量的な主パラメーターを決定できます。フェース セクションで組織サンプルの断面平面の 3次元配向がランダムします。これは、断面平面の位置を基準にして組織サンプルの位置のランダム化が適用されると"Isector"法11 (プロトコル手順 3.1)、相対的な断面平面の方向のランダム化に実現、組織サンプルは、"Orientator"法10 (プロトコル手順 3.2) のように。皮膚または粘膜標本自然存在または定義され適切に識別垂直軸、「垂直一様ランダム (VUR) セクション」の準備を表示するなどの組織サンプルの (プロトコル手順 3.3) は厳密の平面内断面の縦軸は有利な8,20です。フェース/VUR サンプリングの理論的基礎と潜在的な下流定量化薬剤分析の包括的な議論の完全な談話、興味を持った読者定量的ステレオロジー人生の教科書に呼びます科学8,9。

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プロトコル

記載されているすべてのメソッドはここで死んだ動物から派生した組織サンプルを使用し、動物福祉のドイツの法規制に完全に準拠します。

1 超高速

  1. 水没組織・臓器密度の定量法 (図 1 および図 2)7,12,16
    1. 材料の準備: メスの刃、紙タオル、微細鉗子、標準研究所の鱗、ガラスまたはプラスチック ビーカー、0.9% 生理食塩水と自己構築された標本のホールダー (図 2 a)。
    2. 組織の一部を切除 (最大サイズ: 2 × 2 × 2 cm3) 興味の器官のコンパートメントから具体的に臓器・組織から。下垂体や松果体腺などの小器官が測定したトトで。
      注意: は、サンプルのサイズが特にビーカー (ステップ 1.1.5 et seq) およびステップ 1.1.7 でビーカーの内壁に連絡せず、サンプルの完全な水没を許可するその充填レベルの内径より小さいことを確認します。
    3. 過剰な血液・組織液を削除するペーパー タオル サンプル、綿棒は慎重に。
    4. 精密スケールのサンプルの重量を量るし、(mS) サンプルの重量を記録します。最も近い mg (図 1 a) 小さい組織サンプルの重量を決定します。
    5. スケールの部屋温度 0.9% 生理食塩水が入ったビーカーを置きます。ビーカーは、後続の手順で組織サンプルの水没のためオーバーフローすることがなく許可するを完全に記入しないでください。
      注意: は、ビーカー サイズのスケールの効果的な測定範囲と測定する組織試料の重量サイズに適切なを使用します。最大 2 cm3x 2 x 2 の大きなサンプルの 50-100 mL のビーカー サイズの組み合わせで適切な 500 g 約 100 mg から尺度が小さいサンプルの精度とスケールとの組み合わせでボリュームを 5-10 mL のビーカーを使用約 0.1 mg と 20 g の間の範囲を測定します。
    6. 生理食塩水の試料ホルダー (すなわち細線の十分に堅いループか何か似ていますが、図 2 a) を水没マーク位置 (図 1 b図 2 b図 2の矢印)。(風袋) ゼロにスケールの表示をリセットします。
    7. 慎重に組織サンプルを試料ホルダーに付けるし、(図 1 b図 2 b図 2の矢印) 試料ホルダーにマークされている位置に達するまでに生理食塩水のサンプルを完全に水没します。
      注意: 水中サンプルとサンプル ホルダー、内側の壁やビーカーの底または生理食塩水の表面との接触になりません。
    8. サンプル ホルダーおよび湛水のサンプルをその位置に保持している間組織サンプルによって転置された生理食塩水の重量を参照するスケール (mL) に表示される重量を記録 (図 1 Cは、図 2 bと図 2)。
    9. サンプル (VS) mLからのボリュームと室温 (20 ° C) で生理食塩水の密度を計算する (ρ生理食塩水1.0048 g/cm ³ =) VS mL=/Ρ生理食塩水[g/g/cm ³](図 1)。
    10. サンプル (mS) とそのボリューム (VS) の重量を (すなわち、質量) から組織サンプル (ρサンプル) の密度を計算: ρサンプル= mS /VS[g/cm ³] (図 1)。
    11. 測定臓器にトトの測定を 3 回繰り返すし、1 つの測定値から平均オルガン密度を計算します。大きな臓器・組織、同じ臓器、組織、器官のコンパートメントの異なるサンプルでの繰り返し測定を行うし、それに応じて単一の測定から平均密度を計算します。
    12. その重量と密度 (図 1) から臓器、組織、器官のコンパートメントの合計量を計算します。
  2. ブタ器官の容積の定量・ カヴァリエーリ ・法の適用7
    1. 材料の準備: 定規、キャリパー、ナイフ、ハサミ、鉗子、防水ペン、プラスチック フィルム、スキャナー、写真カメラ、およびクロス グリッド プラスチック透明フィルムに印刷します。
    2. プレーンの表面 (切削技術) に全体の臓器を配置し、(図 3 b図 5 a) その縦軸に沿って器官の長さ (l) を測定します。
    3. 等距離並列スライスに完全な器官のティッシュを (図 3図 5 b) 縦臓器軸が直交カットするには。十分に小さな組織・臓器スラブの十分な数を受信する 2 つのセクション (すなわち、断面の間隔/切片厚通常約 1 cm) 間の距離dを選択します。ランダムに 0 と断面の間隔の器官の余白からの距離内にある最初のセクションを配置します。スライス、しながら位置とほぼ均一な厚みのパラレル臓器スラブ約を取得する各セクション平面の向きを判断する視覚的に。
      注: 組織・臓器スラブの必要数は図形と検査された臓器・組織のサイズに依存します。小器官やサンプルは ≤5 mm の薄いスラブの断面に、区分する前に寒天にサンプルを埋め込む (1.3.3 の手順を参照してください). 寒天埋め込まれたサンプルのスライスの技術デバイスを使用し、。最もブタ臓器・組織、経験的推奨断面の間隔だけでなく、スライスのデバイスの例は、「組織サンプリング ガイドのブタ生体モデル」7の補足資料で示されます。
    4. 切断底面 (すなわち、右または各臓器のスラブ、 3 D 図、図 5の左側のセクション平面のいずれかに一貫して) 同じ面ですべての臓器・組織の破片を置き、スラブ (n) をカウントします。
    5. 次の方法のいずれかによって組織スラブの断面の輪郭を取得します。
      1. 慎重に彼らの上部および下のセクションの表面の向きを維持しながら適切にラベル付けされたプラスチック フィルムに組織スラブを配置します。防水ペン (図 3E1 2) を使用してプラスチック製の透明の組織スラブのアウトラインをトレースします。
      2. 垂直方向のセクションの表面 (図 3 f) 上にカメラを保持している組織スラブの写真画像を取る。校正、組織スラブの横サイズの定規を配置します。
      3. 上部と下部のセクション表面 (図 3) の向きを維持しながらフラット ベッド スキャナーの組織スラブをスキャンします。校正、組織スラブの横サイズの定規を配置します。
    6. 次の方法のいずれかによってすべて組織スラブ (トレース、撮影、またはスキャン]) セクション プロファイルの領域を測定します。
      1. オーバーレイまたは適切なサイズを持つトレース オルガン スラブ プロファイルをスーパーイン ポーズ、プラスチック透明性、すべてを横切るプロファイル] 領域 (3E を図3-4;に比較を打つ数に均等に間隔をあけられた十字架のキャリブレーション グリッド印刷図 5)。交差 1 つクロスに対応する領域によってプロファイルの打席数を乗じて各器官のスラブのセクション プロファイル領域を計算します。
        注: 十分に正確な量を受け取るに見積もり、隣接する交差の間十分に小さい距離でクロス グリッド」を選択、少なくとも 100 の平均交差するよう研究の各検討ケースにおける 1 つの器官のスラブのセクション表面をヒットします。.最もブタの臓器・組織の経験的推奨クロス グリッド サイズは、「組織サンプリング ガイドのブタ生体モデル」7の補足資料で示されます。
      2. 領域を測定写真/スキャンのデジタル画像で組織のスラブを使用して適切な市販やフリーウェアの形態計測ソフトおよびハードウェア アプリケーション (図 3 H)、市販の画像解析システム21などまたは ImageJ22。
        注意: メモその 1 組織スラブ (最初または最後) はその自然の表面にそれぞれ休憩スキャナーに配置されます、その自然な表面を持つカメラに直面しています。したがって、スキャンしたイメージのイメージは、このスラブの写真画像、セクション表面は表示されません。したがって、断面の面積単位はないこの組織スラブ (図 3 i) のスキャンした画像/写真画像です。注過剰投影も臓器スラブ、すなわちのスキャンした画像や写真で紹介、実際のセクション プロファイルではなくスラブ セクション表面 (図 12 の背後に横たわっている画像で組織の領域を測定G-H)。
    7. ケースごとすべてのティッシュの破片のすべての対応するセクション断面積の合計のプロダクトとして推定される臓器体積を計算 (すなわち、右または左のいずれかの一貫して, 各器官の上部または下部のセクション表面スラブスラブ (すなわち、垂直臓器軸 (l) とスラブの数の測定の長さの商)15の平均厚さと。
  3. 組織学のための組織サンプルの処理中に埋め込みに関連する三次元組織収縮の程度の決定
    1. 材料の準備: ミクロトーム ブレード、鉗子、寒天、金属鋳造金型、デジタルスキャナー、およびサイズの定規 (例えば、グラフ用紙)。
    2. 固定ティッシュ サンプルから新鮮な平面のセクションをカットします。
      注: のサンプルを使用して簡単に変形可能な (ソフト) の組織 (脂肪、ゼラチン状の組織) は、断面 (図 4 a) 前に寒天で固定ティッシュ サンプルを埋め込みます。
    3. 寒天にサンプルを埋め込む。
      1. 水の適切な量と培地微生物学用標準寒天パウダーを混ぜる (約 0.5-1 グラム寒天/10 mL 水) ガラス ビーカーに。混合物をかき混ぜるし、700 W の電子レンジで 3-5 s. 混合物をかき混ぜるし、沸騰させるが 3-5 秒のために再度沸騰するまで加熱します。
      2. 必要に応じて、組織サンプルに寒天のコントラストを高める、液体の寒天、例えば、黒インクを染める (熱い液体寒天培地 10 mL に 1 mL インクを追加し、積極的にかき混ぜる)。
      3. 鋳造金型 (例えば、図 10 aDを埋め込むパラフィン用金型) に熱い寒天を注ぐし、暖かい寒天で固定ティッシュ サンプルが水没します。寒天の凝固まで冷却、金型を削除、ミクロトームまたはかみそりの刃を使用して埋め込まれたティッシュで寒天ブロックをカットをしましょう。
        注意: 熱い液体寒天を処理中に、は、ゴーグルと手袋を着用します。排気ホルムアルデヒド溶液中固定プロセス組織サンプルはフードし、ゴーグルと研究室の手袋を着用します。
    4. サイズ定規とともに、フラットベッドスキャナーの上下向きそのセクションの表面のサンプルを置き、セクションの表面 (図 4 a, B) をスキャンします。
    5. ステップ1.2.6 (図 4 b) で説明する方法のいずれかを使用して、デジタル スキャンの固定ティッシュ サンプル (f) のセクション画面の領域を決定します。
    6. エポキシ (例えばEpon) または glycolmethacrylate/メタクリル酸メチル (MMA/GMA)23、次標準プロトコル23,24,25 (などのプラスチックの埋め込みメディアのサンプルを埋め込む図 4)。(1.3.4) の前の手順でスキャンされた固定サンプルのセクションの表面がプラスチック埋サンプルで維持されることを確認します。
      注: サンプルの処理中にサンプルのセクションのサーフェスの向きを維持するために一貫して埋め込みカセットまたは鋳造金型に下向きその目的セクション表面サンプルを配置または意図したセクションをマーク表面 (またはサンプルの反対側) のインクで。
    7. 固定ティッシュ サンプル (ステップ 1.3.2) の元のセクションの表面に対応するプラスチックのブロックから組織切片を使用してカット ミクロトーム (図 4)、ガラス スライド (図 4) のセクションをマウントし、日常的に (それを汚す例えばヘマトキシリンとエオシン染色、H & E)24,25。
      注意: 固定ティッシュ サンプルの元のセクションの表面と同じ平面で約組織切片を受信するため前に、ミクロトームのマウントにプラスチック製のブロックの位置を慎重に調整します。
    8. サイズ定規と一緒にフラット ベッド スキャナー上にうつむけステンド グラス セクションにスライドを置き、セクション (図 4E) をスキャンします。
    9. 1.2.6 (図 4 階) の手順で説明した方法のいずれかを使用して、デジタル スキャンでプラスチック包埋組織サンプル (Ae) のセクションの領域を決定します。
    10. プラスチック中の埋め込み埋め込み前後に組織サンプルの対応するセクションのプロファイルの測定領域から (それぞれ組織と埋め込む媒体) の平均埋め込みに関連する組織の収縮を計算します。線形収縮係数fsは、プラスチック媒体 (e) とのエリアを埋め込む埋め込み後n組織サンプルの断面の輪郭部の商の平方根として計算されます、包含媒質 (f) (図 4) プラスチックに埋め込む前に同じ組織サンプルの対応するセクション プロファイル14。

2. 出来高で加重された体系的なランダム サンプリング ポイント数えると異なるダウン ストリーム解析タイプ7の組織サブサンプルの処理によって

  1. 材料の準備: 定規、ノギス、ナイフ、ハサミ、鉗子、防水ペン、ポイント/クロス グリッドのプラスチックの透明度とランダムな番号テーブルに印刷します。
    注: グリッド (5-60 ミリメートル) クロスのコピーのテンプレートは、「組織サンプリング ガイドのブタ生体モデル」7の補足資料で提供されます。
  2. プレーンの表面 (切削技術) の臓器・組織を配置し、(図 5 a図 6 a) その縦軸に沿って器官の長さ (l) を測定します。
  3. 等距離並列スライスに完全な器官のティッシュをその縦軸 (図 5 b) が直交カットするには。組織・臓器のスライスの十分な数を取得するには十分に小さい 2 つのセクション (すなわち、断面の間隔/切片厚、通常約 1 cm) 間の距離dを選択します。ランダムに 0 と断面の間隔の器官の余白からの距離内にある最初のセクションを配置します。スライス、しながら位置とほぼ均一な厚さのおよそ平行臓器スラブを取得する各セクション平面の向きを判断する視覚的に。
    注: 組織・臓器スラブの必要数は、検査の臓器と組織のサンプリング場所の数のサイズによって異なります。小器官やサンプルは ≤5 mm の薄いスラブの断面に、区分する前に寒天にサンプルを埋め込む (1.3.3 の手順を参照してください). 寒天埋め込まれたサンプルのスライスを行うための技術的な装置を使用し、。最もブタ臓器・組織、経験的推奨断面の間隔だけでなく、デバイスのスライスの例は、「組織サンプリング ガイドのブタ生体モデル」7の補足資料で示されます。
  4. 切断ベース (図 6 b) に同じ面にすべての臓器・組織の破片を配置します。
  5. 適切なサイズのクロス グリッドと組織スラブ印刷プラスチック透明度外側に向けて配置することによってオーバーレイは残って組織 (図 5-D、図 6 b) からランダムなポイント クロス グリッドの上部。
    注: が選択した隣接する交差の間十分に小さい距離でクロス グリッド研究の検討において, 倍、少なくとも交差しているサンプル数として、サンプリングされる組織コンパートメントのセクション加工するサーフェスをヒットします。その組織のコンパートメントから取られます。最もブタの臓器・組織の経験的推奨クロス グリッド サイズは、「組織サンプリング ガイドのブタ生体モデル」7の補足資料で示されます。
  6. マークし、組織 (それぞれ、組織サブ コンパートメント サンプリングする) を打つすべての交差を数えます。一貫してカウントし、それぞれ 1 行ずつ右に左からそれぞれの交差の連続番号によってなど、すべての組織の破片でサンプリングされる組織コンパートメントを押す十字の番号の統一モードを適用します。上から下、または、例えば、exemplarily 5E を図に示すよう、12 の位置に最も近い間から始まる時計回りの方向で別の後 1 つの組織のスラブで十字架を番号によって。
  7. 系統的サンプリング間隔 (i) を取得する生成されるサンプル数では、サンプリング (n)/組織コンパートメントを押す十字の数で割ります。
  8. 1 と私の間にランダムな番号xを選択して最初のサンプリング位置を決定します。これは、乱数表を使用します。最初のサンプリング位置 (x) および各次x +私をマーク、 x + 2私、 x + 3iなど、クロス プラスチック透明性をサンプリングする組織/組織コンパートメントを打つ防水ペン (図 5 階) を使用します。
    注: ランダムな番号テーブル便利かつ迅速に生成できますオンライン ランダムナンバージェネレーターを使用しています。
  9. マークに対応する場所を越える少しプラスチックの透明度を上げると (図 5図 6 eピンセットのペアを使用して組織のスラブの表面にきれいな、空白の紙吹雪紙の小片を置くことによって組織をタグします。).
  10. (図6f、図 7A図 5 H) サンプリングの場所から組織の標本を切除し、(図 6図 7 aB) で指定されている解析の種類のためにそれらをさらに分割表 1。
  11. サンプリング後、暖かい水と石鹸、乾燥、プラスチックの透明度をきれいにし再利用します。

3 等方性一様ランダム (フェース) セクションおよび薬剤の定量分析のための垂直一様ランダム (VUR) セクションの生成

  1. "Isector"技術
    1. 材料の準備: かみそりまたはミクロトームの刃、寒天、球状鋳造金型 (例えばプラリネ、菓子のサプライヤーから得ることができる金型鋳造)、フォールド クランプ、および鉗子。
    2. 球状の鋳型に適切なサイズ (1 cm3x 1 x 1) の部分固定、体系的にランダムにサンプリングされた組織を配置、フォールド クランプによって一緒に保持し、暖かい液体寒天 (図 8 aE) で金型を満たし。
    3. 寒天の凝固後、鋳型から寒天球 (図 8 f) を削除します。
    4. 寒天球をロールバック テーブルに埋め込まれた組織サンプルを使用停止、およびランダムな位置にセクションします。
      注: 結果の断面平面はフェース セクション (図 8 階-g) です。
    5. GMA/MMA などプラスチック樹脂に組織サンプルを埋め込むに進みます (1.3.5 を参照) 平面フェース セクションの方向を維持します。
  2. "Orientator"技術
    1. 材料の準備: かみそりまたはミクロトームの刃、寒天、鉗子、ランダム番号テーブル、等角とコサイン加重円のプリント。
      注: サークルのコピー テンプレートは、以前の出版物8,26で提供されます。
    2. 0-180 に平行 1 つの端に (または寒天埋め込まれた固定ティッシュ) 固定ティッシュのサンプルを配置等角円のプリント ° 方向 (図 9 a、図 10E)。
    3. ランダムな番号の表を使用して、ランダムな角度を決定します。サンプルにかかっている等角円の規模で対応するマークを見つけます。等角円の規模で示されるランダムな角度の方向に平行と垂直指向されている断面平面のサンプル (または埋め込まれた組織サンプルを取り巻く寒天) のセクションをカットこれらのマークを使用して、(図 9 b-C、図 10 f) 試料の表面を休んでいます。
    4. (図 9、図 10 H) 1-1 方向に平行に置かれた休憩のサーフェスのエッジとコサイン加重円周上の欠点に直面して前の手順で生成されたセクションの表面組織ブロックを配置します。
    5. 3.2.3、手順し、サンプルを新しいセクションをランダムな番号の表 (図 9E-F、図 10IJ) を用いてランダムな角度でカットします。
      注: 結果の断面平面は、フェース セクションです。
    6. 必要に応じて、手順 1.3, 埋め込みに関連する組織の収縮 (図 9-J) による固定ティッシュ サンプルの断面のフェースの領域を決定してプラスチックに組織サンプルを埋め込むに進みますGMA/総合格闘技などの樹脂します。
  3. 垂直一様ランダム (VUR) セクションの生成
    1. 材料の準備: かみそりまたはミクロトームの刃、寒天、鉗子、ランダム番号テーブルおよび等角円のプリント。
      注: サークルのコピー テンプレートは、以前の出版物8,26で提供されます。
    2. 後続の手順でサンプル/セクションで認識は、常に固定ティッシュ サンプル内の垂直軸を定義します。
      注: 通常、組織標本の自然な表面に垂直の軸は垂直軸として選択されます。
    3. 適切な場合は、寒天培地 (図 11 b) にサンプルを埋め込みます。
      注: 寒天埋め込み前に VUR またはフェース - のセクショニング固定サンプルは小さい、薄い、壊れやすい、またはソフトのサンプルに一般的に推奨。また、サンプルの寒天埋め込みデータを使用プラスチック樹脂中サンプルの後続の埋め込み時に VUR 断面サンプルの位置決めを容易にします。
    4. 垂直軸の直交表/紙の表 (図 11) の平面に指向される等角円の印刷サンプルを配置します。
    5. カット サンプル (ランダムな番号の表を使用して決定される) ランダムな角度で断面平面と直交表を VUR の断面 (図 11) を受信する垂直軸への平行します。
    6. 必要に応じて、手順 1.3 (図 9-Jの比較) に記載された埋め込みに関連する組織の収縮による固定ティッシュ サンプルの断面のフェースの領域を決定しての組織サンプルを埋め込むに進みますGMA/総合格闘技などのプラスチック樹脂。

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結果

水没組織・臓器密度の測定法

図 12A-Bは、1.1 (図 1図 2) のステップで説明されている水没を用いたブタ腎臓のボリュームと密度の代表決定を示しています。追加豚の臓器や組織の密度測定の代表的な結果は、表 2に掲載されています。「組織サンプリング ガイドのブタ生体モデル」7で多様なブタの組織や臓器の参照密度のより包括的な一覧が表示されます。独立した標本の同一試料の繰り返し測定による水没メソッドを使用して取得した組織密度測定値の妥当性を見積もることができます。最もブタ組織水 (ρ水≈ 1.0) よりわずかに高い密度の値を表示...

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ディスカッション

ブタの動物モデルからのバイオバンク サンプル コレクションの生成臓器ボリュームによる冗長な組織サンプルの広い範囲に適しています代表者の再現可能な世代堅牢な技術とプロトコルが必要です。異なる分析方法と薬剤の定量分析のためのサンプル セクションの方向のランダム化のため。本稿で説明する方法は、ブタの臓器や組織のサイズに合わせられるし、これら要求2,7を効果的に満たすために開発されています。彼らはよく認識されている方法論的原則に基づいているし、以前別研究発表2,7,12,21の実用性を証明しています。注目のメソッドは、さまざまな種類の代表的なサンプルの生成のため、さまざまな可能性がありますは決定しないパラメーターの取得に基礎を提供するので、組織・臓器のサンプルを調べる研究にと...

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開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

著者はリサの都市の優秀な技術的な支援をありがちましょう。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
AgarCarl Roth GmbH, Germany寒天(粉末), Cat.: 5210.31gの寒天を10mlの冷水にガラスまたはプラスチックビーカーで溶かし、電子レンジで700Wで加熱し、溶液を2回沸騰させながら厳密に攪拌します。温まったまま型に流し込み、固めます。注意:高温の液体寒天で取り扱うときは、保護メガネと手袋を着用してください。
キャリパーHornbach Baumarkt GmbH, Bornheim, GermanySchieblehre Chrom/Vernickelt 120 mm Cat.: 3664902どんな種類のキャリパー(機械式または電子式)でも構いません。
鋳造金型(金属)Engelbrecht Medizin &Labortechnik、Edermünde, ドイツEinbettschälchen aus Edelstahl, 14 x 24 x 5 mm, Cat.: 14302bパラフィン包埋に使用される他の種類の金属鋳造金型でも十分です。
クロスグリッド(5mm-6cm)のコピーテンプレートn.a.n.a.クロスグリッド(5mm-6cm)のコピーテンプレートは、Albl et al. の補足データファイルで提供されています。トキシコールパトール。44, 414-420, doi: 10.1177/0192623316631023 (2016)
等角円と余弦強調円のコピーテンプレートn.a.n.a.等角円と余弦重み円のコピーテンプレートは、Nyengaard &ガンダーセン。Eur Respir Rev. 15, 107-114, doi: 10.1183/09059180.00010101 (2006) and in Gundersen et al. Stereological Principles and Sampling Procedures for Toxicologic Pathologists.で:ハシェックとルソー´毒物学病理学ハンドブック。第3版、215-286、ISBN:9780124157590(2013)。
フォールドバッククランプ(YIHAIバインダークリップ、15 mmおよび19 mm)Ningbo Tianhong Stationery Co ltd.、中国Y10006およびY10005他のタイプの標準オフィスフォールドバッククランプも同様に機能します。
鉗子(解剖学的)NeoLab Migge GmbH、ハイデルベルク、ドイツneoLab スタンダード -Pinzette 130 mm, anatomisch, rund, Cat.: 1-1811どんなタイプの解剖学的鉗子でも大丈夫です。
ホルムアルデヒド溶液 4%SAV-Liquid Produktion GmbH, Flintsbach, Germanyホルムアルデヒド 37/40 %, Cat.: 1000411525005濃縮溶液から 4% に希釈します。中性pHに緩衝液。適切な目、手、呼吸用保護具を着用してください。ホルムアルデヒド溶液に固着した組織サンプルを排気フードの下に処理し、保護メガネと実験用手袋を着用してください。
方眼紙(校正用)BüロマルクトBöttcher AG、イェーナ、ドイツ。www.bueromarkt-ag.dePenig Millimeterpapier A4, Cat.: 2514どんな種類の方眼紙でもかまいません(ミリメートル単位で拡大縮小)。
実験室のビーカー(5ml、10のml、50のml、100のml)NeoLab Migge GmbH、ハイデルベルク、ドイツBecherglas SIMAX® 、niedrige Form、Borosilikatglas 3.3 Cat.:E-1031、E-1032、E-1035、E-1036&ndashのガラスまたはプラスチックビーカーの任意の種類;100のml容量はする。
ラボスケール(s)Mettler Toledo GmbH, Gießen, GermanyPM6000測定範囲が0.1 mgから約20 g、それぞれ100 mgから約500 gの測定範囲を持つ標準的な実験室スケールは
ttingen、ドイツBP61S
ミクロトームブレードEngelbrecht Medizin &Labortechnik、Edermünde, ドイツFEATHER Microtome blasdes S35, Cat.:14700どんな種類の使い捨てミクロトームブレードでも大丈夫です。
形態計測/面積測定ソフトウェア/システムNational Institute of Health (NIH)ImageJhttps://www. imagej.nih.gov/ij/ (1997) からダウンロード。
Zeiss-Kontron, Eching, GermanyVideoplanTM 画像解析システム在庫
フォトカメラNikonD40三脚に取り付けられるデジタルフォトカメラなら何でもOKです。
プラスチック透明フィルムAvery Zweckform GmbH, Oberlaindern, GermanyLaser Overhead-Folie DINA4 Cat.:  3562(レーザー)印刷可能なプラスチックの透明性であれば何でも構いません。
乱数テーブルn.a.n.a.乱数テーブルは、次のような乱数発生器を使用して(定義された数の乱数を使用し、定義された間隔内で)便利に生成できます：
https://www.random.org/ Razor bladesPlano GmbH, Wetzlar, GermanyT5016あらゆる種類のかみそりの刃で十分です。
定規BüロマルクトBöttcher AG、イェーナ、ドイツ。www.bueromarkt-ag.deOffice-Point Lineal 30 cm, Kunststoff, 透明, Cat.: ln30cm-mmスケールの定規なら何でも大丈夫です。
生理食塩水 (0.9%)Carl Roth GmbH, GermanyNatriumchlorid, >99% Cat.: 0601.10.9% 生理食塩水を調製するには、9 g NaCl を 1000 ml の蒸留水に 20°C で溶解します。
メス用刃Aesculap AG &Co KG、Tuttlingen、ドイツBRAUN 外科用ブレード N°22どんな種類のメスの刃でもかまいません。
スキャナーヒューレット・パッカードhp scanjet 7400c150-600 dpiの解像度でスキャンできる標準的なオフィススキャナーなら何でも大丈夫です。
Slicing devicesn.a.n.a.自作のスライシングデバイスの例は、Knust, et al. Anatomical record. 292, 113-122, doi: 10.1002/ar.20747 (2009) および Albl et al.  Toxicol Pathol. 44, 414-420, doi: 10.1177/0192623316631023 (2016)の補足データファイルで見つけることができます。
球形鋳造金型(例:直径25.5 mm)Pralinen-Zutaten.de、Windach、ドイツPralinen-Hohlkugeln Vollmilch、25.5 mm球形鋳造金型は、自己構築することも、他の菓子メーカーから入手することもできます(プラリネの場合)。ここに示されている鋳造金型は、実際には中空プラリネ本体のパッケージ/ラッピングです(最初にプラリネを食べてから、iセクターセクションの生成にパッケージを使用します)
細いワイヤーBasteln&ホビーショーベス、Straßfurth、ドイツ。www,bastel-welt.deMessingdraht (0.3 mm) Cat.: 216464742他の種類の細いワイヤーでもかまいません。
ティッシュペーパーNeoLab Migge GmbH、ハイデルベルク、ドイツDeclcate Task Wipes-White、Cat.:1-5305種類の実験用ティッシュペーパーも同様に機能します。
防水ペンStaedler Mars GmbH &共同KG、Nürnberg, GrmanyLumocolor permanent 313, 0.4 mm, S, black, Cat.: 313-2他の種類の防水ペンでも大丈夫です。
約 5 、Sartorius AG, Gö切れ他の

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