マウス顎下腺唾液腺の直立した生体顕微鏡検査のための準備

サマリー

手術を公開し、直立した生体顕微鏡を用いた生体イメージングのマウス顎下腺唾液腺を安定させるためのプロトコルについて述べる。このプロトコルは、頭部および頸部マウスの他の小さい齧歯動物の他の外分泌腺に容易に適応です。

要約

顎下腺の唾液腺 (SMG) は、生物学的研究、細胞生物学、腫瘍学、歯科学、免疫学などの様々 な分野の関心の 3 つの大唾液腺の一つです。SMG は外分泌腺の分泌の上皮細胞、芽、血管内皮細胞、神経、細胞外マトリックスで構成されています。ラット、マウス SMG の動的な細胞プロセス イメージが以前作成された、逆多光子顕微鏡システムを用いた主。ここでは、直立した多光子顕微鏡システムを生体内イメージングのための麻酔下のマウスのマウスの SMG の安定化と手術の準備のための簡単なプロトコルについて述べる。我々 は内因性の代表的な生体画像セットを提示し、に対して転送蛍光細胞、血管や唾液管フィブリル型コラーゲンを視覚化する第 2 高調波発生のラベルを含みます。合計では、私達のプロトコルは生体イメージング免疫学の分野でよく使用される正立顕微鏡システムでマウス唾液腺の手術準備のためことができます。

概要

唾液は消化酵素として抗菌物質^1,2を提供する食品を注油、口腔管の粘膜の表面を保護する外分泌腺から分泌されます。口腔粘膜に散在の小唾液腺、に加えて、位置^1,2によると主要な腺、舌下腺, 顎下腺, 耳下腺, として識別の 3 つの両側セットがあります。ピラミッド状の上皮細胞がフラスコ状嚢 (腺) に編成または筋上皮細胞と基底膜に囲まれた demilunes 唾¹の漿液性と粘液の成分を分泌します。彼らは最終的に単一の排泄ダクト¹に参加するまで横紋筋性ダクトに結合する介在部に腺下水管の狭い内腔領域。SMG の主排泄管ウォートンのダクト (WD) と舌下涙丘^3,4に表示されます。SMG 上皮区画は、したがって、マニホールド ターミナル エンドポイント、ブドウ^1,5,6のバンドルに似た高い葉状構造を表します。SMG ....

プロトコル

すべての動物の仕事を動物実験のための州委員会によって承認されており、連邦政府のガイドラインに従って実施します。

1. マウスを麻酔します。

1. 白衣、手袋など保護具を着用します。
2. ケタミン、キシラジンと作業濃度 20 mg/mL と 1 mg/mL の生理食塩水をそれぞれ混ぜます。在庫を腹腔内注入 (i. p.) 8-10 μ L/マウスの g で。ケージに戻るには、マウスを置きます。
   注: このプロトコルは、C57BL/6 背景を持つ 6-40 週齢の雌雄マウスのテストされています。
3. 2.5 mg/ml アセプロマジン ソリューションを準備し、30 μ L i. p.、(75 μ g/マウス) ケタミン ・ キシラジン投与後 15 分を注入します。
4. 5-15 分後に、、反射など足や角膜反射の逃避反射を制御することにより十分な麻酔と鎮痛を確認します。
5. 実験の全体の持続期間の間約 30 分毎に制御反射します。ケタミン ・ キシラジンを皮下注入 1.5 μ L/g マウス、すべて 60 分またはそれ以前の場合、反射は正。
   注: イソフルランなどの吸入麻酔はマウスの固定のため、このプロトコルでは使用できません。

2. 動作領域から毛皮を削除します。

1. 約 5 mm 両方の耳....

結果

このプロトコルでは、ほぼ全体背や腹側の SMG の画像をことができます。また、ビューのフィールドには、細胞構成⁴の SMG とは少し異なります舌下腺の唾液腺も含まれています。両方の腺はフィブリル型コラーゲンによってカプセル化され、葉に細分されます。ほとんど 14 システム 2^nd高調波信号を測定することによってフィブリル型コラーゲンのラベル画像を作り出すことができるが、通常蛍光分子は細胞および細胞レベル下の構造の可視化に必要な。例えば、2^nd高調波信号との組み合わせで緑の蛍光蛋白質 (GFP) 発現のユビキタス トランスジェニックは、形態学的特徴によって腺、ダクト、SMG の血管を特定するのに足りる。このセットアップは、特定の細胞のサブセットを識別する細胞型特異的発現と形質転換蛍光マーカーを観察する使用ことができます。図 2は、結合組織の ofCOL1A1 GFP レポーターを表現する線維芽細胞のような細胞ネットワークを示.......

ディスカッション

このプロトコルでは、免疫学の分野でよく使用されます直立の非線型顕微鏡を用いたマウスの顎下腺と舌下腺唾液腺の生体内イメージングのための簡単な方法を提供しています。メソッドは、頭頸部領域の他の外分泌腺のイメージングのために合わせることができます。例えば、私たちの研究室は (図示せず) 類似している方法で、涙腺のイメージングを実行しています。

偶発的な組織の損傷が発生することができますのでこのプロトコルの最も重要なステップは、SMG の周りの結合組織を除去します。SMG の主な血液供給への損傷は、SMG 組織が低酸素になるので、実験の即時の終了を必要とします。SMG は組織自体が破損している場合は通常出血凝固して自然停止します。ただし、それは傷害トリガー無菌性炎症と炎症性サイトカインのリリース³⁰、実験的読み出しに影響を与える可能性があります考慮する必要があります。一般的なしかし、以下の重要な合併症はマイクロサージャリーの中には、生理食塩水の貯留層における漏れです。リークの発生を最小限に抑えるために常に乾燥、毛のない肌にグ.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ナルケタン 10 % (ケタミン) 20ml (100 mg/ml)	ベトキノール	3605877535982
ロンプン 2% (キシラジン) 25 ml (20 mg/ml)	バイエル	680538150144
生理食塩水 NaCl 0.9%	B. ブラウン	3535789
プレキラン 1% (アセプロマジン) 10 ml (10 mg/ml)	ファトロ	6805671900029
電気シェーバー	ウォール	9818L	または類似品
毛クリーム	Veet	4002448090656
デュラポア サージカルテープ (2.5 cm x 9.1 m と 1.25 cm x 9.1 m)	デュラポア (3M)	1538-1
デュラポア サージカルテープ (2.5 cm x 9.1 m と 1.25 cm x 9.1 m)	デュラポア (3M)	1538-0
瞬間接着剤 ウルトラゲル、瞬間接着剤	Pattex、Henkel	4015000415040
顕微鏡カバー スライドガラス 20 mm と 22 mm	メンゼル-GLä	ser631-1343 / 631-1344
用グリース60 g glisseal N	ボーラー(VWRサプライヤー)	DECO514215.00-CA15
外科用ハサミ	ファインサイエンスツール(F.S.T)	14090-09	または類似の
ファインフォーセプス	ファインサイエンスツール(F.S.T)	11252-20	または類似の
綿棒	ミグロス	617027988254	または類似の
Gauze Gazin 5 x 5 cm	Lohmann and Rauscher	18500	または類似の
実体顕微鏡	Leica	MZ16	または類似の
Texas Red dextran 70kDa	分子プローブ	D1864
カスケード ブルー デキストラン 10kDa	invitrogen	D1976
二光子システム	LaVision Biotec	TrimScope I および II	または類似の
XLUMPLANFL 20x/0.95 W 対物レンズ	オリンパス	n/a	またはその他の水浸対物レンズ
デジタル温度計	Fluke	95969077651

脱実験室