このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。

方法論記事

ゼブラフィッシュ胚における細胞光電を介して次の心内膜組織運動

6.2K 閲覧数

⸱

DOI：

10.3791/57290

⸱

2018年2月20日

 ,  ,  ,  , 
1Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire, 2UMR7104, Centre National de la Recherche Scientifique, 3U964, Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, 4Université de Strasbourg

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

このプロトコルは楓生活の心内膜細胞の蛍光タンパク質の光変換の方法を記述するゼブラフィッシュ胎児房室管、心臓房室弁開発中心内膜細胞の追跡を有効にします。.

要約

胚発生に伴う細胞細胞行動のダイナミックな変化を受けるし、発生生物学の分野の基本的な目標は、これらの変更の背後にある細胞の論理を読み解きます。発見と蛍光タンパク質の開発が格段に動的変更の私達の理解光学的細胞や組織を強調表示する方法を提供します。ただし、光電、微速度顕微鏡観察およびそれに続く画像解析は、脳や目など臓器の細胞動態を暴くで非常に成功する証明が、このアプローチは通常使用されないため心臓の開発で心臓のサイクル中に心臓の急速な動きによってもたらされる課題。このプロトコルは、2 つの部分で構成されています。最初の部分では、photoconverting とその後中ゼブラフィッシュ房室運河 (AVC)、心臓房室弁開発心内膜細胞 (内分泌かく乱化学物質) を追跡する方法について説明します。正確な光電場所を取るために薬で心臓を一時的停止メソッドが含まれます。心は再開できる発達時間後の時点で photoconverted 内分泌かく乱化学物質の高分解能イメージングのため心臓が再び停止するまでに薬物および萌芽期の開発の除去時に鼓動が通常どおり続行されます。プロトコルの 2 番目の部分は、二次元の地図に立体構造から蛍光信号をマッピングすることにより幼胚の胚で AVC の photoconverted または非 photoconverted 領域の長さを定量化する画像解析法をについて説明します.一緒に、プロトコルの 2 つの部分は、起源とゼブラフィッシュ AVC と房室弁をし、変異体、morphants、またはと扱われている胚を研究するため適用できる可能性のある細胞の挙動を検討する 1 つをことができます。AVC および/または弁の開発を妨害する試薬です。

概要

ゼブラフィッシュは現在体内細胞および進化のプロセスを勉強する最も重要な脊椎動物モデルの一つです。これがゼブラフィッシュの光透過性の主因と遺伝学は、遺伝子を含む光学的手法を適用するための強力なモデルはそれにこうしてエンコード光応答性タンパク質技術1。心臓の研究に固有のゼブラフィッシュを受け取る拡散を介して十分な酸素ハートビートなしも突然変異体は発達遺伝子および摂動の影響に関する分析を許可、開発の最初の週を生き残ることができるようにほとんどの脊椎動物2で可能ではない心臓の形態形成に関する血流。

ゼブラフィッシュの心臓の管は 24 時間ポスト受精 (hpf) によって形成されます。その形成直後後心臓の管は、積極的に暴行を開始します。36 で hpf、明確な収縮心室から心房を分離します。収縮のこの地域は、立方形態3房室運河 (AVC) とこの地域の変更細胞扁平上皮の形態から呼び出されます。ゼブラフィッシュ房室弁の形態形成開始 48 時間前後は、受精を投稿します。5 日ポスト受精、2 つの弁尖は、AVC に拡張し、4心周期の間に、心室から心房への血液の逆流を防ぐ。AVC と弁形成過程における細胞の追跡を介して伝統的なタイムラプス顕微鏡5,6セルに従うことが困難な心の急速な打撃としては困難です。このプロトコルは、スティードら2016年7から適応で楓の蛍光蛋白質の表現に使用されるなTg (fli1a:gal4FFubsUAS:kaede)8ゼブラフィッシュ遺伝子組換え回線を使用する方法を記述します。血管内皮細胞は、心内膜を含みます。36 55 の hpf と発生時間の特定ポイントで photoconverted 内分泌かく乱化学物質の高分解能イメージングの内分泌かく乱化学物質の正確な光電に暴行、心臓を一時的に停止、薬 2, 3-butanedione-2-ジアセチルモノオキシム (BDM) が使用されます。以前、内分泌かく乱化学物質 photoconverted このメソッドを使用してが変換されていない近所の人たちと区別することができますまま光電7時間後 5 日間以上に示されています。このプロトコル 48 より若い胚における内分泌かく乱化学物質 photoconverted の画像解析に使用するメソッドの詳細も hpf は、AVC 開発 (Boselliらプレスで)9中に組織の動きに従う正常に使用されています。我々 は、読者がこのプロトコルを有用見つける AVC とバルブの開発、正常な胚、変異体、morphants、または薬剤を投与した胚を研究するため願っています。ゼブラフィッシュの開発中に蛍光タンパク質を用いた細胞追跡に関連する一般的なプロトコル、ロンバルドら、2012年10投稿記事をご覧ください。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

プロトコル

1. 金型の製作やアガロースをマウント

  1. 3 D プリンターまたは伝統的な機械的ワーク ショップ ツールを使用して図 1に示す寸法の金型を作成します。
  2. 35 mm プラスチック製取り付け皿に溶かし 1% アガロースゲルの約 1.5 mL のピペットします。金型と agarose の間の空気を避けるために世話液体の agarose のプラスチック金型を配置します。4 ° C で皿を配置、agarose 硬化 (この所要時間約 5 分) まで待つプラスチック金型を削除します。
  3. 後で使用できるマウント料理を保存するには、カバー、ふた付き皿を皿とパラフィルムでしっかりと蓋をラップします。取り付け皿を格納、ことができます蓋面 4 ° C で最大 5 日間を下
  4. 事前に 1.5 mL で 0.7% 低融点アガロースの因数を 1 mL エッペン チューブ取り付けの日に使用準備します。
    注: パラフィルムがしっかりと料理の周りラップされていない場合、水が蒸発する、取り付け皿の agarose の井戸が時間の経過とともに変形をします。

2. 光変換の胚を取得

  1. Tg (fli1a:gal4FFubsUAS:kaede)異なる線し、約 200 胚胚中 28.5 ° C で暗闇の中での成長ゼブラフィッシュのラインを交差させる方法の詳細については、ゼウス科学教育データベース11を参照してください。
  2. 5 時間後、24 時間前に、1-フェニル-2-チオ尿素 (PTU) 色素形成を防ぐために胚を扱う (0.003% 胚中 PTU)。
  3. 明るい緑の蛍光性を表現する表示される光電、蛍光万国実体写真下画面胚、選択 5 健康な胚の開始前に約 1 時間。Photoconverting 非特異的細胞で楓を避けるために胚の周囲の光への露出を避けるために胚を視覚化するときの強度の低い光の使用お勧めします。

3. 埋め込み

  1. メディアのマウントの 10 mL を準備: 0.02 %tricaine と 50 mM BDM 胚中。
  2. 取り付け皿にメディアをマウントの 2 mL を追加でき、agarose に拡散して解決のための 15-30 分。
  3. 一方で、約 5 分の 70 ° C の熱ブロックに管を置くことによって 0.7% (LMP) 低融点アガロースの 1 mL の約数を溶かします。
    1. わずかに冷却する LMP agarose のため待機し、低融点アガロースのチューブに 8 mg/mL tricaine ソリューションを 25 μ l 添加し 1 M BDM 溶液 40 μ L を追加します。上下、ピペッティングによるミックスは、液体状態で LMP アガロースを保つために 38 ° C の熱ブロックにチューブを転送します。
  4. ペトリネットの胚を損傷しないように注意を取って、鉗子を用いた顕微鏡下で事前に選択された胚を胚中、慎重に dechorionate と料理します。
  5. メディアのマウントの 2 mL を含む別の皿に胚を転送します。
    1. 胚の心を停止する時 (約 5-10 分を取る)、取付に胚料理、彼らは 25 度の角度でうそをつくように鉗子を使用して井戸に胚を手配転送ツインテールだけでなく、上向き卵黄の深部に向かって指しています。
    2. 胚が大体の場所でメディアを削除、tricaine と、BDM を含む 0.7% LMP agarose の 〜 200 μ L に胚を埋め込むし、胚の位置を再調整は、必要に応じて左右に胚を傾斜します。
  6. LMP agarose セット (所要時間約 5 分) は、メディアをマウントを料理に追加されるまで待ちます。胚は、photoconverted をする準備が整いました。
    注: tricaine と、BDM 胚を麻酔してそれぞれ胚の心臓を停止する使用されます。マウント メディア イメージング、前日を準備することができますが、メディアを光から保護してください。
    注: は胚の正しい位置 photoconvert たいセルへ明確なレーザーのパスを許可することが重要です。レーザー光は、胚に到達するまで旅行する必要はありません、胚は光電後簡単にマウントされませんすることができます、ので、井戸の開始の近くに胚の頭を位置します。

4. 光電

  1. 装備されて、405 (ライカ SP8) のような正立型共焦点顕微鏡の 488 nm nm と 561 nm レーザー ソースを見つける胚白色光 (明視野観察) と対物レンズに透過心による (ライカ HCX IRAPO L、25 × 0.95 エヌ ・ エイのような目的)。561 nm レーザー (すなわち、~ 5% 強度、589 728 nm での DPSS 561 レーザー) を用いた赤い楓蛍光性をチェックします。その後、488 nm レーザー (すなわち、~ 5% 強度、502-556 nm に設定器で 30 mW マルチライン アルゴン レーザー) を用いて心内膜を視覚化します。
  2. 顕微鏡集録ソフトウェアに「縛る」モードを入力します。両方 488 の ~ 1% のレーザー出力を選択して nm と 561 nm のレーザーです。
  3. 興味の面に焦点を当てる、その後、405 nm のダイオードを用いた photoconvert 細胞レーザー スキャン、投資収益率を 3 倍の 25% レーザー出力で利益率 (ROI) の地域を選択します。不十分な楓は、投資収益率で photoconverted をする必要があります、405 nm レーザー領域の上 3 回再びスキャンします。僅かにこの手順を繰り返します。
  4. ソフトウェアに「TCS SP8」モード戻るし、、561 を使用して z スタックを取得 nm、488 nm レーザーの順番に。画像処理速度を上げるため 'の双方向' オプションを選択することを確認します。
    メモ: どのくらいそれは photoconvert にかかるし、それぞれの胚をイメージが違います。心臓の鼓動が正常な心臓弁の開発にとって重要である、それを意味する必要はありません時間を photoconvert すべて 5 胚場合でも 30 分以上停止して心を維持しないように知られています。
    注: 使用 PMT 検出器、光電過程光電後しばらくお勧め 'カウント' モードに設定ハイブリッド検出器を使用します。これは、ハイブリッド検出器より敏感なより良い品質の画像を作り出すことができるが露出オーバーで簡単に破損しているためにです。

5. photoconverted 胚のアンマウント

  1. 光電後に、、LMP アガロースを破るし、胎児をやさしく吸う胚の頭の上に少しだけ押しにガラス ピペットを使用します。
    1. ガラス ピペットから胚を胚媒体 (媒体を含んでいる BDM を洗い流す) に PTU を含む 35 mm のペトリ皿に取り出します。
    2. PTU と胚媒体を含んでいる 6 ウェル プレートには井戸に胚を転送します。このステップの間に胚のノートを保つことを確認は、これは後で発達段階で photoconverted のセルの位置を関連付けるに不可欠なまあに入ります。
  2. 今では、胚は、BDM 含む媒体から削除されます、彼らの心は戻り胚胚は通常を開発し続けることを許可するように 28.5 ° C で暗闇の中を約 5 分で再び暴行を始めるべきです。

6 その後の胚の段階で photoconverted 細胞のイメージング

  1. 必要な段階では、心臓を停止させるし、胚が胚を追跡する別のマーク付きの料理で BDM と見なす必要がある重要な違いがこのプロトコルの手順 3 の下のような胚を再埋め込みます。
  2. 62 までの胚の hpf 561 を使用して心内膜の z スタックを取得 nm、488 nm の赤と緑の蛍光信号をそれぞれ。62 より古い段階で胚の hpf、多光子を使用してレーザー セット 940 nm 488 nm レーザーではなく緑の楓をイメージします。

7. 画像解析による胚下 48 hpf

注: AVC の組織の動きが複雑な三次元構造を分析することは困難にすることができます。2 つの非 photoconverted 領域または 2 つの photoconverted の地域間 avc 非 photoconverted 領域の長さ間の AVC の photoconverted 領域の長さを定量化することができます上に立体の構造をマップするが望ましい、二次元の地図。Photoconverted 胚の画像取得 48 前に hpf は、次の方法を使用して分析できます。

  1. Matlab または任意の同様のソフトウェアで取得した画像をインポートします。
  2. 投資収益率、すなわち、心内膜を手動で外縁し、この地域外の信号を削除するマスクを適用します。
  3. 心内膜上の点を識別し、3 次元にそれらをプロットする画像を輝度しきい値を適用します。アトリウムとソフトウェアの消去コマンドを使用して心室に興味のポイントを手動で消去することによって、AVC の狭いとほとんどストレートの部分に対応する箇所を特定します。
  4. ように入手された AVC を表す点に合わせてシリンダーを使用します。
  5. いくつかのサンプルを比較するための参照システムを定義します。たとえば、参照系の原点と z 軸として装着シリンダーの軸として AVC ポイントの重心を採用します。
    1. 心臓 (心房または心室筋) の同じ側に正の z 位置が常に対応していることを確認します。
    2. X y 平面上の AVC ポイントのプロジェクトし、それらに合わせて楕円を使用してください。
    3. 楕円の長軸と参照系の y 軸が平行し、正の y 値は胎児に関して AVC 内部側に対応心内膜ポイント z 軸の周りを回転します。
  6. 半平面を回転させることにより得られるいくつかの面で三次元データセットをカット、AVC をセグメント化、{y = 0、x > 0} z 方向で。
    1. これらの平面の隣接ピクセルの強度をプロジェクトし、一貫した方法で、内皮を定義します。たとえば、手動でからラインを描く、心房内皮の半分の厚さで AVC の心室側に。
    2. 表面と AVC を表すスプライン ツールボックスを使用して 3 次元スプラインと内皮を表すラインのポイントを補間します。
      注: 分割の精度とこのステップの時間消費の両方切断面の数を決定します。通常、飛行機 8、良い結果を達成するために十分であります。
  7. 円筒座標を使用して AVC 表面の各ポイントの方位の位置を定義します。
    1. 各方位の位置でサーフェス間の連続する点の円弧の長さを計算することによって、AVC の表面に沿ってパラメトリック曲線を定義します。
    2. 各のパラメトリック曲線曲線ゼロに AVC の中心に最も近いポイントを定義します。AVC のポイントはこうしてパラメトリック曲線上の方位の位置とその位置によって完全に説明しました。
  8. ポイントのパラメトリック位置を使用して二次元のイメージに、AVC を展開します。
  9. バイナリ イメージの閾値のエッジとして、photoconverted の強度と非 photoconverted チャンネル間の比率を定量化する領域のエッジを見つけます。必要に応じて、手動で結果を修正します。
  10. 方位角の位置の関数として組織の長さを計算するためのエッジ間の円弧の長さを計算します。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

結果

48 胚 photoconverted の例 hpf 80 でもう一度イメージ化と hpf は図 2映画 1および2で示されています。405 nm の光に楓を公開すると、不可逆的変換蛍光赤フォームにその蛍光緑の形態からの蛋白質、緑または赤いフォームのラベルの付いたセルの動作を有効にする彼らのメランジに尊重します。弁形成の間に近所の人。それは 48 の hpf AVC のいくつかの photoconverted 細胞が後で急増し、弁尖の片側に主に住んでいた後に見ることができます。

Photoconverting 内分泌かく乱化学物質、心房と心室は図 3に示す後 36 hpf 胚の説明画像解析法を適用することによって達成することができます結果の例です。AVC のセグメンテ...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

ディスカッション

光電のタイミング: 96 でも内分泌かく乱化学物質の鮮やかな表現が楓のまま hpf、胚が大きくなると、レーザー光を拡散させるより楓の限られた光電をより困難になり、AVC に達する前にそれに注意してください。At 萌芽期段階の 55 以降 hpf、心室と心房のバルーニングもの光電用バイオレット レーザー ビームが心房または心室のどちらかを最初の通過せず AVC 細胞を達することができないということ。これは 55 を超えて、hpf、photoconvert、AVC の内分泌かく乱化学物質を 1 つする必要がありますも photoconvert 心房と心室に追加内分泌かく乱化学物質。

BDM と tricaine: 内分泌かく乱化学物質の正確な光電暴行から心臓を一時的に停止する必要があります。BDM (2, 3-butanedione ジアセチルモノオキシム) は、心筋収縮12を抑制するよく知られている電気収縮ランプです。我々 は、この議定書の対象となっている胚の形態の違いを観察しないと通常成長されている...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

開示事項

利害の対立が宣言されていません。

謝辞

我々 はこのプロトコルで記述されている金型を助けるためバジーレ Gurchenkov ナタリー Faggianelli、デニス · Duchemin アン ロール Duchemin を感謝したいです。この作品は FRM (DEQ20140329553)、(ANR-15-CE13-0015-01、ANR-12-ISV2-0001-01) ANR、エンボ若い調査官プログラム ERC CoG N ° 682938 欧州共同体によってサポートされない Evalve ・ グラント ANR-10-LABX-0030-INRT、フランスの州の資金管理ANR-10-アイデックス-0002-02 というラベルの付いたフレーム プログラム Investissements d'Avenir の下のアジャンス ナシオナル デ ラ凝った。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
素材
魚の飼育や卵の採集に必要な装備(詳細はゼブラフィッシュBook22を参照)。
実体顕微鏡
正立共焦点顕微鏡(488 nm、561 nm、405 nmで動作するレーザー、調整可能な多光子レーザー、およびライカHCX IRAPO L、25倍、N.A.0.95対物レンズを装備)ライカライカSP8
ヒートブロックThermoScientific88870001
35 mm x 10 mm組織培養皿ファルコン353001
6ウェルプレートファルコン353046
ペトリ皿
ガラス
ピペット
モールド
<ストロング>試薬
8 mg/mL トリカインストック溶液 
1 M BDM ストック溶液
UltraPure 低融点アガロースInvitrogen16520-050
アガロースロンザ50004
PTU (1-フェニル-2-チオ尿素)Sigma AldrichP7629
胚培地: 30x ストック溶液
ソフトウェア解析、カーブフィッティング、バイオフォーマットツールボックスを搭載したstrong>
MatlabMathWorks
8 mg/mL Tricaine Stock solution
200 mg of tricaine powder (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonic acid)Sigma-AldrichE10521
25 mL Danieau
pH 7に調整し、分量して-20°Cで保存します。C 
1 M BDM原液
1 g BDMSigma-Aldrich112135
10 mL ddH2O
Aliquotおよび-20°Cで保存してください。C
胚培地:30倍ストック溶液
50.7 g NaClSigma-Aldrich7647-14-5
0.78 g KClSigma-Aldrich7447-40-7
1.47 g 硫酸マグネシウムSigma-Aldrich 7487-88-9
2.1 g 亜硝酸カルシウム四水和物Sigma-Aldrich13477-34-4
19.52 g HEPES (4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸)Sigma-Aldrich7365-45-9
pH 7.2 に調整し、室温
しますMold
PlasCLEAR 樹脂アシガ
プラス39 フリーフォームピコ3DプリンターAsiga
で保存

参考文献

  1. Chow, R. W., Vermot, J. The rise of photoresponsive protein technologies applications in vivo: a spotlight on zebrafish developmental and cell biology. F1000Res. 6, (2017).
  2. Sehnert, A. J. Cardiac troponin T is essential in sarcomere assembly and cardiac contractility. Nat Genet. 31, 106-110 (2002).
  3. Peal, D. S., Lynch, S. N., Milan, D. J. Patterning and development of the atrioventricular canal in zebrafish. J Cardiovasc Transl Res. 4, 720-726 (2011).
  4. Boselli, F., Freund, J. B., Vermot, J. Blood flow mechanics in cardiovascular development. Cell Mol Life Sci. 72 (13), 2545-2559 (2015).
  5. Steed, E., Boselli, F., Vermot, J. Hemodynamics driven cardiac valve morphogenesis. Biochim Biophys Acta. , (2015).
  6. Boselli, F., Vermot, J. Live imaging and modeling for shear stress quantification in the embryonic zebrafish heart. Methods. , (2015).
  7. Steed, E. klf2a couples mechanotransduction and zebrafish valve morphogenesis through fibronectin synthesis. Nat Commun. 7, 11646(2016).
  8. Herwig, L. Distinct cellular mechanisms of blood vessel fusion in the zebrafish embryo. Curr Biol. 21 (22), 1942-1948 (2011).
  9. Boselli, F., Steed, E., Freund, J., Vermot, J. Anisotropic shear stress patterns predict the orientation of convergent tissue movements in the embryonic heart. Development. , (2017).
  10. Lombardo, V. A., Sporbert, A., Abdelilah-Seyfried, S. Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development. J. Vis. Exp. (67), (2012).
  11. JoVE Science Education Database. Biology II: Mouse, Zebrafish, and Chick. Zebrafish Breeding and Embryo Handling. , JoVE. Cambridge, MA. (2017).
  12. Watanabe, Y. Inhibitory effect of 2,3-butanedione monoxime (BDM) on Na(+)/Ca(2+) exchange current in guinea-pig cardiac ventricular myocytes. Br J Pharmacol. 132 (6), 1317-1325 (2001).
  13. Jou, C. J., Spitzer, K. W., Tristani-Firouzi, M. Blebbistatin effectively uncouples the excitation-contraction process in zebrafish embryonic heart. Cell Physiol Biochem. 25 (4-5), 419-424 (2010).
  14. Pestel, J. Real-time 3D visualization of cellular rearrangements during cardiac valve formation. Development. 143 (12), 2217-2227 (2016).
  15. Swinburne, I. A., Mosaliganti, K. R., Green, A. A., Megason, S. G. Improved Long-Term Imaging of Embryos with Genetically Encoded alpha-Bungarotoxin. PLoS One. 10 (8), e0134005(2015).
  16. Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139 (17), 3242-3247 (2012).
  17. Marchant, J. S., Stutzmann, G. E., Leissring, M. A., LaFerla, F. M., Parker, I. Multiphoton-evoked color change of DsRed as an optical highlighter for cellular and subcellular labeling. Nat Biotechnol. 19 (7), 645-649 (2001).
  18. Dempsey, W. P. In vivo single-cell labeling by confined primed conversion. Nat Methods. 12 (7), 645-648 (2015).
  19. Mohr, M. A., Pantazis, P. Single neuron morphology in vivo with confined primed conversion. Methods Cell Biol. 133, 125-138 (2016).
  20. Mohr, M. A., Argast, P., Pantazis, P. Labeling cellular structures in vivo using confined primed conversion of photoconvertible fluorescent proteins. Nat Protoc. 11 (12), 2419-2431 (2016).
  21. Mohr, M. A. Rational Engineering of Photoconvertible Fluorescent Proteins for Dual-Color Fluorescence Nanoscopy Enabled by a Triplet-State Mechanism of Primed Conversion. Angew Chem Int Ed Engl. 56 (38), 11628-11633 (2017).
  22. Dempsey, W. P., Fraser, S. E., Pantazis, P. PhOTO zebrafish: a transgenic resource for in vivo lineage tracing during development and regeneration. PLoS One. 7 (3), e32888(2012).
  23. Dempsey, W. P., Qin, H., Pantazis, P. In vivo cell tracking using PhOTO zebrafish. Methods Mol Biol. 1148, 217-228 (2014).

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

再版と許可

タグ

BDM Kaede
ゼブラフィッシュ胚における細胞光電を介して次の心内膜組織運動
お問い合わせ
図書館への推薦

プライバシー

利用規約

ポリシー

著作権 © 2026 MyJoVE Corporation. 無断転載を禁じます。