Method Article

同位体 2 つの安定を用いる液体クロマトグラフィー質量によってスフィンゴミエリンの定量的および定性的な方法ラベル スフィンゴミエリン種

DOI:

10.3791/57293

⸱

May 7th, 2018

 ,  , 
1Faculty of Pharmaceutical Sciences, Teikyo University

In This Article

Summary

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ここでは、提案する定量化および複数反応モニタリングを用いた各スフィンゴミエリン種を対象に、プロトコルと MS、MS、MS モード、それぞれ。

Abstract

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液体クロマトグラフィー-エレクトロ スプレー イオン化タンデム質量分析法 (ESI-MS/LC-MS) による定量的スフィンゴミエリン (SM) の質的分析の手法を提案します。SM は、それぞれ親水性と疎水性のコンポーネントとして、ホスホリルコリンとセラミドで構成される一般的なスフィンゴ脂質です。SM 種数はスフィンゴイド長いチェーンの基本 (LCB) の変化のための哺乳類の細胞内に存在し、 N-セラミドのアシル部位。本報告では、炭素と、LCB とNの二重結合の数を推定する方法を示す-アシル基が MS ・ MS/MS (MS3) 実験で、対応する製品のイオンに基づきます。加えて、我々 は SM の種を使用して 2 つ安定同位体ラベル付き SM、SM の定量に使用範囲を決定するを容易に定量分析法を提示します。本手法は、様々 な生体試料や化粧品などの工業製品で SM 種を特徴付けること役に立つでしょう。

Introduction

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スフィンゴミエリン (SM) は、哺乳類細胞における一般的なスフィンゴ脂質です。SM は合成の1細胞内と他のスフィンゴ脂質の前駆体として現在セルの人身売買と皮膚のバリア恒常性は、それぞれ2、スフィンゴシン-1-リン酸と、セラミド、免疫の重要な役割があるよう 3。したがって、SM 代謝の正確な分析は、スフィンゴ脂質の生理的および病態的役割を解明するため重要です。

SM は、セラミドとさらに、スフィンゴシンとNで構成されているセラミドの 1-ヒドロキシ グループにリンクされているホスホリルコリンから成る-アシル部位。スフィンゴシンとNの両方で炭素との二重結合の数の様々 な-アシル部位数・ セラミド (SM) 種の結果します。LC-MS/MS の最近の進歩は、SM4、5の量的・質的分析を可能にしました。定性分析の炭素数と二重結合のスフィンゴイド LCB の SM された LCB のプロダクト イオン スペクトルを割り当てることによって識別されます。しかし、 Nの構造情報-アシル基がその対応するプロダクト イオンは報告されていないので直接得られず、した....

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Protocol

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使用する前に関連するすべての材料安全データ用紙 (MSDS) を参照してください。皮膚由来の SM によるサンプルの汚染を最小限にするために手袋を着用します。この議定書は 2 mM L10% 牛胎児血清 (FBS) を添加したイーグル最小必須培地で育った HeLa 細胞に適用された-グルタミン、1,000 U/L ペニシリンとストレプトマイシン 100 mg/L。

1. 脂質試料の調製

注:、テフロン ライニングのネジキャップで試験管を含むすべてのガラスは洗剤がないことが重要です。

  1. ブライ ・ ダイアーの方法7を使用して細胞磨砕液からの総脂質の抽出
    1. 文化を削除 (またはエアコン) 10 cm 細胞培養用ディッシュ、6 mL の氷冷 PBS で 2 回リンスからメディア。
    2. P1000 ピペットで 10 cm の培養皿に 1 mL の氷冷 PBS を追加します。セルスクレーパーで細胞を収穫し、2.0 mL シリコーン プラスチック チューブに収集します。
    3. 遠心分離 (1,000 × g、5 分、4 ° C) 後に、、P1000 ピペットで上澄みを除去します。
    4. 1 mL のメタノールを追加します。渦は簡単にチューブし、200 W 浴型超音波発生装置で 5 分間の....

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Results

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化学的に合成した d18:1/24:0 SM (図 1A)、d18:1 LC ESI MS3 [M + 尿素]-を採用し、[M CH3] 24:0 SM HeLa 細胞 (図 1B) から抽出した脂質サンプルで行ったところ/-最初と 2 番目の前駆イオンとしてそれぞれ。脱スフィンゴシルフォスフォリルコリン (SPC) (449m/z ) のスペクトル強度が SM Nのより大きいことに注意してください-アシル基 (378m/z )。さらに、[M-コリン-CH3 (スフィンゴシン-1-リン酸)] に対応するスペクトル-は SM の LCB を割り当てると便利ですも。また脱-SPC (449m/z

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Discussion

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現在の質的な方法で我々 は MS3 SPC とNのプロダクト イオンを得られる-アシル部位。SPC とNの両方を正しく割り当てることが重要です-アシル部位。このため、他ホスホリルコリン含む分子は MS3製品イオンとしても検出することができますが注意する必要があります。ジアシル ホスファチジルコリン (PC) およびプラズマローゲン PC が哺乳類セルの豊富に存在し、疎水性、SM のような。したがって、前記ジアシル PC とプラズマローゲン PC 同位体 (通常13C) と理論的に検出できます同時に SM で。我々 の実験では、プラズマローゲン PC の MS3製品イオン同時に SM 分析で観察されました。SPC のスペクトル強度が SM Nのそれよりも大きいことを知っている SM の MS3プロダクト イオンを正しく選択すると便利です-アシル部位 (図 1AとB

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Disclosures

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著者は、利害の対立があるないことを宣言します。

Acknowledgements

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この作業は、教育省、文化、スポーツ、科学と技術の日本 (科研費) コンゴ (#15 K 01691) に、マルチメディアモデルシミュレーション (#15 K 08625)、武 (#26461532)、省から難治性疾患プロジェクト研究補助金から研究助成金によって支えられました。健康、労働および福祉 (武 #201510032A)。我々 はエダンズ ・ グループ (www.edanzediting.com/ac) がこの原稿の下書きを編集することをありがちましょう。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
PBSサーモフィッシャー10010023
100mm組織培養皿イワキ3020-100
セルスクレーパーイワキ9000-220
シリコン処理 2.0mLチューブフィッシャーサイエンティフィック02-681-321
試験管イワキTST SCR 16-100
テフロンライニングスクリューキャップイワキ9998CAP415-15
使い捨てガラス管IWAKI9832-1310
CAPCELL PAK C18 ACR 3 µm 内径1.5mm×内径100mm資生堂92223カートリッジホルダーにガードカートリッジを差し込み、C18カラムに連結
CAPCELL C18 MGII S-3 2.0 mm x 10mm ガードカートリッジ資生堂12197
カートリッジホルダー資生堂12415
アセトニトリル和光018-19853
2-プロパノール(イソプロピルアルコール)和光161-09163
メタノール和光134-14523
ギ酸和光066-00466
28% アンモニア水和光016-03146
ソニケーター(バスタイプ)SHARPUT-206H
ガラス試験管用ボルテックスミキサーTAITECMix-EVR
1.4mL ガラスバイアルトムシック500-1982サンプルは、スクリューキャップと8mmセプタムで密封された1.4mLガラスバイアルに-20°Cで保存します。C
8 mmセプタムTomsic200-3322サンプルを分析すると、スクリューキャップはスリットセプタム付きスクリューキャップに交換されます
1.4mmガラスバイアル用スクリューキャップTomsic500-2762
スリットセプタム付きスクリューキャップ島津製作所GLCGLCTV-803
PVDF 0.22 µmフィルターミリポアSLGVR04NL
トリプル四重極・四重極リニアイオントラップ質量分析計SCIEXQTRAP4500
プロダクトイオンスペクトルのデータ取得・解析用ソフトウェアSCIEXAnalyst
定量分析用ソフトウェアSCIEXMultiQuant
HPLCシステム島津製作所ネクセラ
ガラス瓶Sansyo85-0002
d18:1/24:0 スフィンゴミエリンAvanti極性脂質860592P
スフィンゴシルホスホリルコリンメルク567735
ウシ胎児血清サーモフィッシャー 
L-グルタミンサーモフィッシャー 
ペニシリンとストレプトマイシンSigmaP4333
グル's minimum essential mediumシグマM4655
2614007925030081イー

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Huitema, K., van den Dikkenberg, J., Brouwers, J. F., Holthuis, J. C. Identification of a family of animal sphingomyelin synthases. EMBO J. 23 (1), 33-44 (2004).
  2. Kihara, Y., Mizuno, H., Chun, J. Lysophospholipid receptors in drug discovery. Exp Cell Res. 333 (2), 171-177 (2015).
  3. ....

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