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Summary

新生児 (0 日) マウス肝左葉部分切除の新しい方法を紹介します。この新しいプロトコルは、急性肝障害や新生児の設定で傷害応答勉強に適しています。

Abstract

形態学的器官再生急性組織の損失は下等脊椎動物の間で共通ですはめったに生後哺乳類で観察。70% 肝部分切除後の成人の肝再生の残り葉の代謝活性の回復が負傷した葉の形態と建築の永久的損失のいくつかのレプリケーションによって肝細胞肥大の結果します。ここでは、生理学的環境の再生に資する葉新生児の新しい手術法を詳しく説明します。このモデルは、左葉の頂点と後続の保守的な管理療法の切断を含む、主要な血管と肝臓の化学損傷、再生が発生する生理学的環境を残して結紮術の必要性を欠いています。我々 は、切断中に負傷した肝臓は肥大による臓器再生から代償成長する遷移の少年 (P7-14) マウスでこのプロトコルを拡張します。提示された、簡単な 30 分プロトコルは、再生、哺乳類で、加齢に伴う減少と推定される肝幹・前駆細胞評価のメカニズムを研究するためのフレームワークを提供します。

Introduction

臓器を再生するまたはの形と機能を復元する能力は、進化の過程で失われる主と考えられています。肥大の波および機能が、その結果、細胞分裂のいくつかのラウンドに終ってすべての残存肝細胞の動員を含む化学または物理的な外傷の急性期後大人の哺乳類の肝臓の再生の可能性が見つかってください。アーキテクチャの異なる器官^1,2,3,4,5。最近、研究は生命^6,7,8の最初の週内の傷害に新生児の哺乳類の器官の再生応答特性を始めています。これらの研究では、新生児の開発中に負傷したとき特定の哺乳類の臓器が代わりに代償的な成長または線維症^7,8形態再生対応を示しています。

最近の研究では、グローバルな構造と機能の両方の再生が早期新生児期^6,7,8中に発生することを示しています。確立された肝障害プロトコルを含む化学傷害またはエタノール^9,10,11, アセトアミノフェン^{12,13,14,15 の管理}、四塩化炭素^16,17,18,1970% 肝部分切除^4,20,21, または左の除去と中央の葉。化学管理肝細胞死につながるが、しばしばミクロ構造とマクロ構造はそのまま残ります。形態学上の再生は、肝全体のアーキテクチャが消失しないよう容易にこのコンテキストで勉強できません。70% 肝部分切除は出血を止めるために必要な主要な血管の縫合結紮を伴いますが、血管の永久的な停止、非生理的な環境を残します。さらに、このメソッドは、大人の齧歯動物にのみ使用されています、新生児への応用が技術的に非常に困難であります。これを念頭において、新生児の P0 マウスで左葉の頂点の 20-30% を除去する手法を開発した (図 1 a-1 b)。このメソッドは、手術に保守的な低侵襲、技術的に挑戦し、総発生する再生のための部屋を去る血管の結紮せず形態の損失に 。以下に示す結果のステップバイ ステップ プロトコルできます出生後の人生の初期段階で新生児再生は哺乳類を研究するために新生児マウスに肺葉切除を行う研究者。このメソッドの人生の後の段階の間に、肝臓で使用されることができます再生医療と幹細胞生物学、比較研究に明確なアプリケーションも備わっています。

最も一般的な急性肝障害の研究は、化学的に誘発された損害、成人の肝臓切断または 70% 肝部分切除です。化学的損傷はしばしばアセトアミノフェン、四塩化炭素、またはエタノール、静脈内投与、腹腔内や口腔管理を含み、比較的簡単かつ非侵襲的損傷モデルです。前述したように、肝細胞の細胞死が多くの場合葉質と柔組織構造形態再生についての主張をするが難しく、そのまま化学的損傷の結果。化学的損傷しばしば肝血管を中心にサイトや特定の細胞傷害を研究する有用な手法となって、また困難、血管から遠いことに位置しています可能性があり、可能性があります他の集団全体の臓器レベルで調査するには再生に貢献します。これらの制限にもかかわらず化学的損傷では、有用で関連性高い生理学的損傷モデルがまだ残っています。

大人 70% 肝部分切除は、肝血管の結紮左と中央の葉の除去を含みます。肝切除への応答はよく特徴付けられる: 切断された肝臓 14 日ポスト 70% 肝部分切除は、残り右と尾状葉の肝細胞として元の無傷の葉の著しく異なるアーキテクチャを開発肥大と細胞分裂^4、5のいくつかのラウンドを受けます。これは、質量の喪失や機能、構成しますが、2 つの切断された葉を再生成する失敗し、したがって総形態を置き換えません。その結果、70% 肝部分切除への傷害応答は限られた再生と代償成長機構の研究に有用です。

ここでは、我々 は完全に新生児の肺葉切除のためのプロトコルをについて説明します。手順には、適切な動物の選択と準備、手術フィールドの準備、手術と回復が含まれます。最適化、これらの各手順の適応プロトコルのさまざまなアプリケーションの必要があります。

ただし、異なる細胞集団と再生のメカニズムを研究する我々 も使用様々 な Cre をかくまっているマウスを含む様々 なトランスジェニック動物、広く実行して野生型 c57bl/6 j 子犬 (JAX 000664) 上でこのプロトコルを最適化し、CreERT2 遺伝子および/またはノック アドイン (018867, Axin2^CreERT2 JAX とSox9^CreERT2 JAX 018829) 虹と mTmG システム (R26^VT2/GK3などの蛍光レポーターとの組み合わせでR26^mT/mG)^22,23します。 異なるマウス系統のこの方法を変更する必要が見つかりません、存続の結果または再生の可能性に差は認められなかった。

系統の異なる動物の使用、に加えてまた 4-ヒドロキシ タモキシフェンや 5-エチニル-2 ‘-デオキシウリジン (EdU) などの小分子を投与した新生児マウスに部分的な小葉肝切除を実行しました。ジメチルスルホキシド (DMSO) とエタノールは、そのコーン油は罹患率の重要な原因が分かった、溶剤として使用されました。それ以外の場合、小分子の腹腔内投与は生存率や再生結果を与えないことがわかった。このプロトコルが再生のさまざまな側面を調査する他の小さな分子用適応されると見込んでいます。

新生児マウス手術は技術的に困難なことができ、動物取り扱いと顕微解剖に特別な専門知識を必要があります。畜産専門知識が母体の共食いを避けるために必要手術後、即時回復期間中に。

Protocol

すべての動物実験は、評価と認定の研究所動物ケア国際 (AAALAC) とスタンフォード大学実験動物管理パネルのための協会のガイドラインに厳密に従って行われました。ケア (APLAC) (プロトコル番号 #10266) アメリカ合衆国やヨーロッパの動物福祉法ディレクティブ 2010年/63/EU。プロトコルはドイツ、バイエルン州政府の動物実験の倫理委員会によって承認され、ない許可を受け取った: 55.2-1-54-2532-150-2015。

1. 動物の準備

1. 加熱パッドの適切な寝具を備えた空のケージを準備します。
2. 手袋で動物に触れる、前に手袋の上に母親の寝具をこする。
3. 空のケージに、母親との場所からすべての子犬を削除します。母のベッドの一部を取り外し、子犬と空の檻の中。
4. 手術野から独立した、きれいな、乾燥のケージに母親を配置します。
5. 外科分野の準備の前にドン新しい、クリーンな滅菌手袋。

2. 手術フィールドの準備

1. 10 mL のピペットを使用して、10 cm シャーレにリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 10 mL を追加します。
2. 10 cm シャーレに betadine またはそれと同等の反腐敗溶液 2 mL のピペットします。
3. 外科領域に切り裂くスコープを配置します。スコープ ランプを解剖し、外科医の快適さに光のレベルを調整します。子犬は、解離の範囲ランプの下に手術のフィールドに配置できます。子犬の腹側表面に影の有無によっては、十分な光を確認できます。
4. イソフルラン麻酔室を準備 (材料表参照) 鼻の円錐形の。商工会議所は、尿または糞便の証拠せず洗浄する必要があります。外科領域に切り裂くスコープ下鼻の円錐形と関連付けられているチューブを配置します。酸素と鼻の円錐形にのみイソフルランのフローをそらします。
5. およそ 37 ° c. に設定されて加熱パッドと術後回復領域を準備します。術後の回復は、加熱パッドの上に置かれたガーゼの 4 個ので構成されます。可能であれば、母の香りを維持するために尿、糞便、寝具母のガーゼをこする。
   注: それは温度を制御しにくく、熱ランプを使用する無分別です。高温は、新生仔マウスの死になります。
6. 準備し、オートクレーブとすべての手術器具を滅菌します。必要なツールが含まれて: ミクロ解剖はさみ、ミクロ解剖鉗子、ガーゼ、止血、任意 6-0 モノフィラメント非吸収性縫合糸です。手術器具は、任意のガラス ビーズ滅菌装置と resterilzed をすることができます。

3 肺葉切除

1. その戻ると軽くテーピングの場所にその手足鼻の円錐形に置くことで子犬を麻酔します。子犬は、酸素濃度が 5% イソフルランを受け取るべき。
   1. つま先ピンチ テストによって検証することができますに座って 5 分または適切に麻酔まで子犬を許可します。
   2. カルプロフェン皮下切開前の 5 mg/kg を注入します。
      注: 30 分より貧しい結果を 30 分以上の全身麻酔下での新生児で生じることよりも、全体の手術する必要がありますもはやかかります。縫合糸による皮膚涙を最小限に抑えるため閉鎖前に皮膚の濡れと徹底的なフィールドの準備から手術の長さを最小限に抑えるための対策を講じる。
2. 優しく betadine で濡れている小さいガーゼパッドと後部の腹部壁をきれいに。1 分の乾燥に betadine を許可します。
3. ミクロ解剖はさみ鉗子と胸郭のすぐ下に左鎖骨 0.5 cm 切開を確認します。優しく鉗子を使用して肌を離すし、腹腔 (参照してください図 1左とセンター) に 2 番目のより深い切開を作る
4. 優しく腹腔の左葉の頂点を強制的に戻って、ミクロ解剖ハサミ、鉗子の鈍端を使用して腹部の両側から側圧を適用します。左葉の左の頂点をする必要があります簡単に可視化された (図 1右)。
5. 根尖切断し、削除する組織の量の重量を量る。
   1. 左葉の頂点から組織の希望の金額を切断し微小解剖はさみを使って優しく。
   2. 1.5 mL チューブに切断された組織の場所は、PBS でいっぱい。分析用天秤を使用して切断された組織の重量を量る (材料の表を参照してください)。
      注: はバランスにガーゼや紙の作品を置き、それを風袋します。ガーゼや紙の切断された組織を配置し、その質量を測定します。
   3. ドライアイス凍結切片の分析のために最適な切削温度 (OCT) 化合物の室温 1 時間で 2% パラホルムアルデヒドで切断領域と場所を修正します。任意の標準のクライオスタットを用いた切断 7-10 μ m セクションによって凍結切片を分析します。
6. 腹腔内に左葉を置き換えるガーゼの圧延ピースを使用して、優しく。出血が止まるまでの空洞にガーゼを残してください。
7. ガーゼを外し、PBS を浸したガーゼで手術の部位とその周辺を濡れています。
8. 実行しているステッチと非吸収性縫合糸、6-0 のモノフィラメント外科サイトを閉じます。腹膜と皮膚は別々 に閉じる必要があります。
   注: は、縫合糸による涙を最小限に抑える PBS を浸したガーゼで優しく皮膚をぬれ可能性があります。
9. 優しくは徹底的に PBS を浸したガーゼで子犬をきれいにし血液や betadine の遺体がないことを確認します。浸したガーゼのパッドと傷印血や betadine をきれいにやさしくスクラブします。
   注: これは、母は不十分な清掃される場合子犬を共食いが特に重要です。
10. 鼻の円錐形から子犬を外し、母の糞便および尿中にさらされているガーゼのパッドを含むリカバリ領域の上に置きます。子犬が回復、空の檻の中の子犬を母のベッドに置き換えます。
    注: は、熱ランプを使用しないでください。熱ランプの使用は、過熱する新生児を可能性があります。
11. 子犬の必要な数の手順を繰り返します。すべての子犬を使用できますが、一般的に運営の子犬と一緒に交換する床上でないいくつかの子犬を残すことをお勧めです。
12. 母親の檻の中で母親の寝具で同時にすべての子犬を置き換えます。

4. 回復と分析

1. マウスを毎日フォロー アップ。
   1. 傷口が閉じられてを確認し、存在する場合任意の死んだ子犬を削除します。
   2. 傷が再開する場合、以前記述、および繰り返し手順 3.12 3.8 として外科サイトとリカバリ領域を準備します。
   3. 手順 carpofen 皮下 24、48 h の 5 mg/kg を注入します。
   4. 56 日以上の子犬に従ってください。
2. 安楽死は二酸化炭素 (CO₂) 露出と頚部転位によって術後日の必要な量の後。
   1. 誘導にマウスを配置/安楽死室とマウスまで CO₂の有効化は、呼吸を止めます。
   2. 頚部転位により安楽死を確保します。前面の指と親指を使ってマウスの背首に押し下げ、尾にプルダウン他の手を使用して。
3. 全体肝en のブロックを削除し、それの重量を量る。
   1. 慎重に各葉を分離し、個別に重量を量る。
      注: は、横隔膜と肝とポータルの血管を細かくして肝臓を削除します。その近位添付ファイルで各葉を慎重に解剖して互いの葉を区切ります。
4. 肝臓全体の質量に切断された左葉の質量を比較することにより再生の範囲を決定します。無傷の左葉は肝臓全体の約 30% です。

Representative Results

Discussion

急性肝障害は、化学 (アセトアミノフェン、エタノール、四塩化炭素)、または外科的モデル (70% 肝部分切除) を使用して伝統的に研究されています。70% 肝部分切除後再生応答は、グローバル肝細胞肥大や複数回の細胞分裂^4,5の特徴づけられています。出血を止め、しかし、このモデルに制限が再生のための異常な環境を残した主要な血管を結紮する必要があります。多くの研究はそのために発生する再生のための場所の総建築を残して、化学的損傷を外傷急性期の他の低侵襲モデルを採用しています。最近、Porrelloらとチャンらは、心、桁のヒント、および耳^7,8急性傷害後著しく異なって新生児再生応答を実証しています。彼らの結果を並列表示の結論は、肝がまた新生児の生活⁶の異なる再生現象を受けます。主要臓器における複数同じような所見と出生後の開発の初期の段階で再生幹細胞生物学のための潜在的な意味を持つ新興分野であります。

新生児部分的な小葉肝切除から早期死亡はしばしば不十分な回復、主要な出血、または母親の怠慢から来ています。述べたように以前は、回復のための熱ランプなど高強度熱ソースの使用、術後死につながる可能性があります。新生仔マウスは、人生の最初の 2 週間、少なくとも母親に依存しています。同時に母がしばしば無視や彼女の感覚異常 (血液または他の化学薬品の香り) など^24,25場合彼女の若者を共食い。したがって、新生児が徹底的に手術後掃除され、任意の不快な香りをマスクする母体の寝具でこすったこと非常に重要です。これらの問題を適切に対処、生存率は 100% を達することができます。母体の共食いが問題になる場合、子犬は彼女自身の子犬いくつかの代理母とケージに配置できます。この場合は、前の手順で代理母の寝具を使用します。

新生児の左葉とそれに続く再生の 20-30% の切除はほとんどない左葉のみに固有のものです。現在、このメソッドは、中央値を公開すると、左側にのみテストされていますより多くの後部右と尾状葉大きな開腹手術を施行し、出血のリスクが高いと、間接的に母体の共食いのリスクが高い結果が必要になる、新生児。ただし、新生児の再生のメカニズムが肝臓内で異種かどうかは重要な問題に対処すると他の肝葉を尋問するこの議定書手術調整を行ってくださいので。

これらの新生児肝切除の調査からの結果は、再生が発生することができる期間 (P0 P7) を示しています。同様の肝切除は若年マウス (P7、P10、P14) に行われているし、実証傷や線維化、マーキング、切断が発生した明確な領域と完全に再生で起因しません。肺葉切除した若年マウスの傷害応答は初期の研究では、新生児と若年マウスと臓器や組織を再構成する能力の損失との間の再生の可能性に疑義の焦点ではないが建築はどの機構幹または前駆細胞による新生児の再生が発生するを理解するため不可欠になります。

以前新生児再生肝臓だけでなく建築と構造で同じように表示、また関数によって区別されていないを確認しました。蛍光は、グルタミン合成酵素 (GS)、carbamoylphosphate 合成酵素 (CPS)、チトクローム p450 2E1 無傷の葉と比較して再生領域内で似たような分布を示すよう機能肝酵素の汚れ。ただし、再生成された新生児の二次再生可能性がテストされていません。56 日間の回復を許可する新生児マウス、無傷のコントロールから生理学的区別大人 70% 肝部分切除に続く古典的な再生応答が起こるそうです。しかし、この肝再生は、しばしば肝細胞枯渇による制限、したがってシリアル肝切除部分の小葉肝切除に続く重要な研究になります。

Materials

<strong>Animals</strong>
Mother with litter of day 0 neonatal pups (any strain)
Surrogate mother and surrogate litter (optional)
<strong>Name</strong>	<strong>Company</strong>	<strong>Catalog Number</strong>	<strong>Comments</strong>
<strong>Standard Reagents</strong>
Phosphate Buffered Serum (PBS)
Providine-iodine or equivalent antiseptic solution
<strong>Name</strong>	<strong>Company</strong>	<strong>Catalog Number</strong>	<strong>Comments</strong>
<strong>Surgical Equipment</strong>
Dissecting microscope	Zeiss	ZEMSDV4L MFR # 435421-9901-000
3mm straight spring micro scissors	Vannas	72932-01
5SF Forceps	Dumont	11252-00
Straight Kelly forceps	Grainger	17-050G
Heating pad	Sunbeam	000771-810-000
Isoflurane	Abbott Labs	0044-5260-05
Rodent Anesthesia System	Kent Scientific	1205S
Gauze, 10.16 x 10.16cm	Fisher Scientific	13-761-52
<strong>Name</strong>	<strong>Company</strong>	<strong>Catalog Number</strong>	<strong>Comments</strong>
<strong>Standard Equipment</strong>
1.5ml microcentrifuge tube	Eppendorf	22363204
6-0 monocryl sutures	Ethicon	MCP489G
Petri dish	Fisher Scientific	S35839
Pipet-Aid, Plain, 110V	Drummond	4-000-110
Mettler Toledo NewClassic ME Analytical Balances	Fisher Scientific	01-912-402
Low Cost Induction Chamber	Kent Scientific	SOMNO-0730