急性および慢性毒性試験ターコイズ メダカによる furzeriのためのプロトコル

Summary

この作業による furzeriのターコイズのヒメダカにおよぼす単一および複合ストレスの効果を研究する、急性、慢性、多世代生物検定法について述べる.このプロトコルは、(死亡率、成長、産卵数、重量) の生活史形質と臨界温度最大研究するため設計されています。

Abstract

生態毒性の分野で新たなモデル生物であるメダカによる furzeriと急性および慢性毒性試験の適用性を実証されています。全体的にみて、有毒化合物種の感度は、または、モデルの他の種のそれより高い範囲内。

この作品では、シングル、複合ストレスに及ぼす影響(名) furzeriの急性、慢性、多世代の生物検定のプロトコルについて説明します。その短い成熟の時間とライフ サイクルのためこの脊椎動物モデルは 4 ヶ月以内成熟時間や多産などのエンドポイントの研究をことができます。継代完全なライフ サイクル暴露試験は、わずか 8 ヶ月で実行できます。この種は干ばつ耐性がある卵を作り出す年間実行可能に残るので、種の敷地内の文化は必要ありませんが、必要な場合に個人を募ることができます。プロトコルは、メジャー生活史特性 (死亡率、成長、産卵数、重量) と重要な熱の最大しています。

Introduction

戦略的に選択した毒性の種の配列の感度分布は、欧州 REACH 法案 (登録、評価、承認、および化学物質の制限) に記載されている¹をされています。急性または短期毒性試験はこの目的のため彼らは種の感度の簡単な目安として大抵使用されました。しかし、彼らの自然環境における生物は、はるかに長い期間にわたってさらされている、完全ライフ サイクルまたはさらにいくつかの世代がある影響を受ける²。また、汚染された環境で生物は通常なり相乗効果³時に、互いに相互作用があります、これで 1 つ以上のストレッサーに公開されます。したがって、安全な濃度計算に基づく、急性ストレッサー毒性試験が自然環境の毒性によって課された実際のリスクを過小評価します。それは、したがって、また欧州委員会^4、5と米国環境保護庁 (米国によって提唱される環境に関連するコンテキストでは有効成分の致死濃度の慢性的な多世代の効果を勉強することをお勧め合衆国環境保護庁)^6,7。脊椎動物の研究を中心に、脊椎動物無脊椎動物モデルと比較して比較的長い寿命のため慢性的な多世代の露出研究を実行するとき、労力、お金と時間の面でコストが高い。したがって、研究の質問に応じて、最も適切な魚モデル生物を選択することをお勧めします。さらに、幅広い脊椎動物に最も敏感な種に基づく規制を適応できる種にわたって応答の一般性をテストするために使用できます。今のところ、新しい、脊椎動物^7,8の慢性および多世代のエクスポー ジャーを実行するコストを削減する短いライフ サイクルによって特徴付けられる脊椎動物のモデル種で効率的なプロトコルを開発する必要があります。

による furzeriの青緑色のメダカは、その短い成熟の時間とライフ サイクル (生成時間 4 週間⁹未満) のためこのような長期の屋外暴露実験で使用する興味深い魚モデルです。これは、成熟時間や多産など生態学上関連するエンドポイントが他魚モデル⁷と比較して短い時間枠の内で学ぶことができますを意味します。さらに、これらの魚は、連続培養⁹の機能は不要、標準的な条件下で保存されているとき、数年間実行可能に残る干ばつ耐性、休眠卵を産みます。生態毒物学的研究、これもレプリケートする魚すべてハッチングできます同じ瞬間に異なる時間に生成される卵のバッチの中でさえ、すべての動物の時間同期の結果を意味します。暴露実験を行う研究所見る: GRZ ひずみを使用してお勧めします。この緊張は実験室の条件の下でよく行う、ホモ (性染色体) を除いて、ゲノムはよく特徴付けられて^10,11。

生態毒性試験、試験濃度の適切な範囲を選択することが重要です。いくつかの相補的な方法は、この目的のために使用できます。公称濃度範囲は、生き餌による¹²などの近縁種の感受性に基づいて設定できます。ほとんど毒性 (フィリップらに匹敵する感度を持つゼブラフィッシュ (動脈分布)²などの標準的な魚モデルの感度の範囲をベースことができますまた、[レビュー))。これらのオプションの両方との組み合わせでわずかな集中の範囲を選択する範囲の実験を見つけることを実施しなければなりません。急性テスト、研究者目指すべき濃度処理率は 100%、中間の死亡率 0% の死亡率と、毒性物質への暴露の 24 時間後。慢性的なテストでは、範囲の最高の試験濃度条件で幼虫の死亡率がこの期間中に 10% を超えないかどうかことを確認する 2 週間の実験を見つけることを実行することをお勧めします。

プロトコルは、個々 および細胞レベルでみられるストレスに関する潜在的な影響を調べる、 N. furzeri、上の水系汚染物質への急性および慢性暴露のベースラインとして使用できます。さまざまな有毒な化合物を混合または汚染とその他の自然のストレス (例えば捕食) と対話型効果を勉強して高い生態学的関連に対応するマルチ ストレス研究を実行するも使用できますまたは人為的ストレス (例えば気候変動による地球温暖化)。

Protocol

ここで説明したすべてのメソッドは、カトリック ・ ルーヴェン大学の倫理委員会によって承認されています。

1. 孵化と名 furzeriの一般的なメンテナンス

1. 準備魚の 14 ° C の温度で媒体 (pH 7) と 600 μ S/cm (24 の ° C) の伝導度に追加された標準化された塩の精製タイプ II 水を追加。
2. 標準化された条件¹³の下に格納されている見る: GRZ (ゴナ Rhe 周) 研究室行から卵を選択します。(すなわち孵化する準備ができている)、DIII 段階で卵を選択認識ゆっくりと金色の目⁹の存在によってそれらを転送ソフト ピンセットのペアを持つプラスチック製 2 L タンク (タンクあたり以上約 30 卵) に。
   注: 試験生物を健康に十分な数を持つために必要な魚の幼虫の数として 2 倍多く卵を孵化します。
3. 12 ° C で魚の中の 1 cm を追加し、水の温度を常温 (24 ° C)⁹に徐々 に収束します。魚は最初の 12 時間で孵化します。
4. 24 h 後フィード孵化ふ化Artemianaupliiの集中投与 (周波数と食品の量の詳細については、Polačikら2016⁹の繁殖のプロトコルを参照) になり、水深が 5 cm に魚中を追加します。
5. 36 時間後ふ化アルテミアノープリウスの集中投与量別孵化をフィードし、魚 10 cm の水の深さを増加する媒体を追加します。
6. 14 h:10 h の下で (例えばインキュベーター、気候ルーム、温水浴) の一定した温度条件下で魚容器を孵化させなさい: 明暗政権。
7. 実験開始前に露出露出媒体の最も高い濃度でそれらを充填し、それを残して化合物 (魚) のない複雑な魚容器は、実際のコンテナーへの有害物質の転送を制限するために一晩します。実験。
8. 孵化後 48 時間曝露実験を開始する健康的な浮揚性の幼虫を選択します。いわゆる腹スライダーの浮袋を記入し、その結果障害の浮力があることができなかったことを破棄 (継続的に底に沈む)。

2. 短期的な曝露プロトコル

注: 治療につき少なくとも 20 レプリケートします (別の jar ファイルに 20 魚) の研究者が目指すべきであります。化合物のストック溶液を調製して、溶媒を用いた場合フル コントロール治療に加えて溶剤コントロールが含まれてする必要があります。溶媒のコントロールは、最高の曝露濃度の溶剤の濃度に匹敵する溶媒の量を含める必要があります。

1. 実験容器 (0.5 L ガラス瓶) を準備するには、ラベルと、適切な露出媒体 (異なる毒性物質濃度) でそれらを充填します。正しい濃度を取得する化合物を追加します。
2. コンテナー (コンテナー単位で、個々 の監視 1 魚) に幼虫 (孵化直後 48 h) を個別に転送します。
   注: 魚は、食品と侵略のための競争などの社会的相互作用の潜在的な交絡因子を最小限に抑えるために個別に公開されます。ただし、魚は、視覚的に実験動物の使用のための倫理基準に基づき操作する許可されます。
3. 2 週間の持続期間のためのフォロー アップこの急性暴露。魚をフィード、その時に1 日、7 日/週 2 回アルテミアノープリウスの自由。
4. 水質を維持するために、化合物の分解の潜在的な影響を最小限に抑えるために、媒体一日おきを更新します。主水の変数を監視 (溶存酸素濃度は 80% を超える必要があります、600 と 700 μ S/cm、7.8 と 8.2 (CaCO₃) として硬度と pH の間 350 と 450 mg/L は、最適な飼育条件の範囲にある間伝導率の範囲(名) furzeri ⁹)。実際の化合物濃度を把握する媒体の更新の前後には、水のサンプルを取る。
5. エンドポイント
   1. 死亡、ストレスのために魚をチェック (例えば異常な動作: 逆さまに泳いで) や病気の毎日 (朝、夕方)。シェッドet al.の出版物を参照してください。(1999 年)¹²死亡、ストレスや病気の観察の詳細については。
   2. LC を計算₅₀値は用量反応曲線 (ザ ・ リッツ ・ Streibig、2005) を使用して、異なる時点での死亡率に基づいています。R v3.2.3 (研究開発コア チーム 2016) のコンゴ民主共和国パッケージにdrm機能を使用または同様の統計的アプローチ。

3. 慢性曝露プロトコル

注: を目指す実験、自然の原因による潜在的な背景の死亡率を調整するため、偏った性比の変動の可能性を最小限に抑えるための発症時 25 魚/条件の最小値 (すなわち。 加齢に伴う死亡率)。

1. (参照 1) 孵化
2. フェーズ I (2 日間孵化後-孵化後 16 日間)
   1. 2.1 2.4 で説明されている、プロトコルに従う
   2. 実験の 2 番目のフェーズでは、週 (ないのリフレッシュメント、下記参照) 中媒体が低下します。一週間化合物のような分解を可能にするための不活性の大きい容器に媒体の必要量を格納します。
3. フェーズ II (16 日孵化後-終了)
   1. 2 L の準備実験のガラスジャー錯形成によってそれら化合物。媒体は適正露出の jar ファイルを埋めるし、jar を通気する空気管を追加します。実験の残りのためのこれらの jar ファイルで個別に家魚。倫理的な基準に合わせて視覚的相互作用を許可します。
   2. 週一度メディアを更新します。ネットで魚を同じ露出媒体を含んでいる新しい瓶に転送します。各集中治療の化合物の劣化を監視する週を通して毎日水サンプルを取る。複数のストレッサーがある場合各治療のため劣化曲線テスト (例えば異なる温度の政体の化合物の毒性) を計算します。週 3 回、非生物的パラメーター (pH、温度、% 溶存酸素、導電率) を測定します。
   3. 2 日から孵化後 (dph) 23 dph まで、1 日、7 日の週アドリブアルテミアノープリウス 2 回魚をフィードします。24 dph - 37 dph からみじん切りのユスリカ幼虫広告 libitumArtemia食事を補完します。上 38 dph から 1 日、7 日の週自由ユスリカ幼虫を凍結 2 回魚をフィードします。
4. エンドポイント
   1. 毎日死亡、ストレスや病気の¹²のための魚を確認します。
   2. 成長を決定、シャーレの貯水池からの媒体でいっぱいに魚を移すことによって毎週 (9 dph - 16 dph - 21 dph -...) 体の大きさを測定します。(固定の高さ) で上から魚の 4-5 校正サイズ写真を撮るし、デジタル空間測定プログラム (例えばImageJ) を使用して分析します。
      注: 成魚、水中測定プロセス全体の中にすべての魚を維持することで処理のストレスを最小限に抑える高いペトリ皿を使用します。
   3. 男性の成熟 15 dph 以降から着色のために毎日魚を目視で確認します。婚姻色 (第二次性徴) の最初の兆候のためのひれをチェックします。これが表示されるプロキシとして男性の成熟の時間の最初の日を使用します。
   4. カップルと同じ治療グループの男性または女性の成熟の時間 (最初の卵を寄託の日) を決定するために、以降 30 dph から週 3 回非実験的男性非性欲魚。これは、3.4.5 で説明した産卵プロトコルを使用します。
   5. 多産のカップル成熟成熟した男性と女性 3 回/30 dph から一週間以降、その治療内を使用して交差方式。
      1. 産卵基質を添加した男性の水族館から露出媒体を使用して、それぞれのカップルの産卵タンク (1 L) を準備 (砂の罰金 < 500 μ m)。
      2. 産卵槽に男性と女性の両方を転送し、2 時間を生むことができます。人間の活動、またはこの処理中に産卵容器周辺障害を最小限に抑えます。
      3. その後、産卵基質の卵を旋回する水の不必要な混合せずにオリジナルの住宅容器に魚を転送優しく。
      4. 500 μ m メッシュに産卵基質を注ぐことによって卵を除外します。卵をカウントし、それらを転送 (柔らかいピンセットを使用して) ペトリ皿^9,14で湿ったピートモスに。
      5. 毎日死んだ卵を削除します。後一週間、ペトリ フィルム シール皿し、温度に格納シール制御 28 ° c の定温器および、14:10 h: 明暗サイクル DIII 相 (すなわち約 3 週間後に孵化する準備ができて) に即時の開発。長期的なストレージ、暗黒になる卵は休止状態段階に入るし、複数年の存続の 17 ° C で卵を格納します。実験のためこれらの休眠卵から魚を募集、休眠卵を 14:10 h: 明暗サイクル DIII の段階に開発できるように約 3 週間で 28 ° C 条件に転送されます。
   6. 成魚の臨界温度最大 (CTmax) (パフォーマンス¹⁵測定) を測定します。
      1. 0.33 ° C/分の一定の割合で加熱水浴を使用し、水を継続的に循環します。それぞれの個々 の魚のいくつかの 1 L 水槽を追加します。
         注: は、風呂の水でスペースの制約を与え、いくつかのシリーズで動作するように必要です。シリーズの中で条件の潜在的な違いはアカウントは考慮する必要があります 'シリーズ' ランダムな要因として、統計解析を実行するとき。
      2. 裁判を水槽の水が魚 (一般的に 28 ° C) の実験的飼育温度に達したとき、水槽に魚を追加することによって開始します。すべて 5 分のデジタル温度計 (0.1 ° C スケール) を使用して CTmax お風呂の 1 L 水槽内の温度を監視します。
      3. 魚の背腹直立姿勢を維持するために失敗した場合または^16,17を激しくけいれんを開始とき試験を終了します。限界の最大温度は、1 L の水槽で温度を測定します。魚をその実験住宅の回復のために転送します。
   7. 乾燥したそれを叩くと計量ボートに転送する実験の最後の日、魚の重量 (0.1 mg の精度) を測定します。注: すべての魚 4 時間後に腸管内の食品重量を標準化するための最後の供給を測定ください。
   8. 0.1% を使用して魚を安楽死させる Tricaine。

4. 継代露出プロトコル

注: N. furzeriの汚染物質による次世代影響を測定するには、最初の世代に上記慢性露出プロトコルに従います。

1. 週に 2 回、28 ° C で保存生産卵 (すなわち 2 番目の世代) の開発をチェック 14:10 DIII 段階で胚のペトリ皿を調べることによって h: 明暗サイクル条件 (Polačikらを参照してください。2016⁹)。各親の治療の 50 以上の複製が完全に開発されて、1.1 のプロトコルに従うそれらを孵化します。
2. 同じセットアップと親魚として治療に健康的な浮揚性の魚を公開します。

Results

2.5.2 のように銅の濃度; furzeriの急性曝露の結果が計算される、cleardose 応答の関係 (図 1) を表示します。毒性物質の濃度を増加させると死亡率の増加があります。LC₅₀値は時間をかけて減少し濃度を減少させるとより多くの時間がレプリケート死ぬの 50% の前に通過するを意味します。N. furzeri他の種と比較して種の感受性の比較だけでなく、銅の急性および慢性露出の詳細な結果を得るのためには、フィリップら2017⁷を参照してください。

トライアルの慢性露出の体の大きさや、敏感なエンドポイントです。温度¹⁸によって、魚の成長に豊富なバリエーションがあります。大人サイズが 30 ~ 50 mm このセッ...

Discussion

この仕事個人を研究する新しいバイオアッセイによる furzeri、新興のモデル生物と有害物質と他のストレス要因の長期効果を組み合わせます。示されたプロトコル (銅、カドミウム、3, 4-dichloroaniline、クロルピリホス) は有害物質の配列に種の感度計測に適用されました。その高速のライフ サイクルによりこの脊椎動物モデルにより致死の評価と継代が 4 ヶ月以内に効果します。毒性スクリーニングのためのモデルとしてこの種の魚を使用してのもう一つの主な利点は、それは耐乾性の卵を生成するという事実です。これは卵を格納またはサプライヤーからそれらを取得することも可能、高価な時間のかかる敷地内文化する必要があります。さらに、胚が孵化が必要な¹²までの数年間保存できます。

参照の有効成分の数を(名) furzeriの感度を勉強した後は、種の感度は、範囲内にあるかよりも、他の上位モデルのテスト化合物によって、種を追加できます。特にに、産卵数に及ぼす影響を測定により、学びの種の感度の比較可能性が他のモデル種...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
精製水 タイプ1(ミリQ)	ミリポア
海塩	インスタントオーシャン
2Lプラスチックタンク	SAVIC		常に制御と毒性処理のための材料を分離
1Lプラスチックタンク(産卵)	アバモプラスト		制御と毒性処理のための材料を常に分離
ネット	アクアビルゼン		制御と毒性治療のための材料は常に分離されています
2Lガラス瓶	Sepac-Flacover		と毒性治療のための材料は常に分離されています
0,5Lガラス瓶	Sepac-Flacover		制御と毒性治療のための材料は常に分離されています
アルテミア卵	オーシャンニュートリ
キロノマス	オーシャンニュートリ		冷凍
トリカイン	、シグマ、アルドリッチ
、ペトリ皿	、VWR
パラフィルム	、VWR
ピペット、	MLS
ピンセット	、FST
500&マイクロ;mメッシュふるい	/		自作
マイクロ遠心チューブ(2ml)	ブランド		に魚を保存するには
	シグマアルドリッチ		水分析用
計量ボート	MLS
ジフィー7cペレット	ジフィー
ウォーターバス	Ctmax	ギラック
	エアリキード
デジタル温度計	Testo AG	testo 926
HETO サームヒーター	アンカーシュミット
キャリブレーション済み天びん	メトラー・トレドAG
カメラ	/
カメラ用	プラットフォーム/		自作
マルチパラメータキット	HACH
冷凍庫 (-80°C;C)	パナソニック超低温冷凍庫
名前	会社名	カタログ番号	コメント
Fysio
均質化	バッファーVWR		0.1 M TRIS–HCl、pH 8.5、15 %ポリビニルピロリドン、153 &マイクロ;M MgSO4 および0.2 % Triton X-100
クロロホルム:メタノール	Sigma Aldrich
グリセリルトリパルミテート	Sigma Aldrich
アミログルコシダーゼ	Sigma Aldrich	A7420
グルコースアッセイ試薬	Sigma Aldrich	G3293
Biorad タンパク質色素	VWR
96ウェルマイクロタイタープレート	Greiner Bio-one
384マイクロタイタープレート	Greiner Bio-one
2 mlガラス管	Fiers		脂肪分析用
2,5ml エッペンドルフ管	VWR
ホモジナイザー	ウルトラターラックス TP 18/10
光分光計	無限M200 TECAN
ヒーター	Hach COD REACTOR
遠心分離機	Eppendorf Centrifuge 5415 R
Incubator	Bumako