方法論記事

カスパーゼ活性化分子蛍光補完への道をライトアップ

DOI：

10.3791/57316

⸱

2018年3月5日

 , 
1Department of Pediatrics, Division of Hematology-Oncology, Baylor College of Medicine, 2Department of Pediatrics, Division of Hematology-Oncology and Department of Molecular and Cellular Biology, Baylor College of Medicine

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルを記述するカスパーゼ分子蛍光補完 (BiFC);自分の活性化の最初のステップであるイニシエーター カスパーゼの誘起近接を視覚化に使用することができますイメージング ベースのメソッド。

要約

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カスパーゼのプロテアーゼ族は、アポトーシスと自然免疫で重要な役割を再生します。これらのうち、イニシエーター ・ カスパーゼと呼ばれるサブグループこれらの経路でアクティブにする最初のです。このグループ含まれてカスパーゼ-2,-8,-9 と炎症性カスパーゼ、カスパーゼ-1、-4 と-5。イニシエーター ・ カスパーゼはすべて活性化プラットフォームと呼ばれる特定の多蛋白質複合体への募集、次二量体化によって活性化します。カスパーゼ分子蛍光補完 (BiFC) は、カスパーゼはイニシエーター カスパーゼの活性化プラットフォームや結果に募集を視覚化に使用されるイニシエーターに溶ける蛍光蛋白質を分割イメージング ベースのアプローチ誘導近接。この蛍光は、イニシエーター ・ カスパーゼ活性化のために必要な初期手順の 1 つの読み出しを提供します。異なる顕微鏡ベースのアプローチの数を使用して、このテクニックがカスパーゼ活性化のサイズとカスパーゼ活性化の数の速度と同様に、人口レベルでカスパーゼ活性化の効率の定量的データを提供できます。セルごとに複合体。

概要

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カスパーゼのプロテアーゼ家族はアポトーシスと免疫1における重要な役割を知られています。重要性のため決定するとき、どこで、どのように効率的に特定のカスパーゼを活性活性化経路カスパーゼのメカニズムに重要な洞察力を提供することができます。ここで説明したイメージング ベースのプロトコルは、カスパーゼ活性化カスケードの最も早いステップの可視化を実現。 にします。この手法は動的蛋白質: 蛋白質の相互作用のドライブのカスパーゼ活性化で活用します。

カスパーゼは、2 つのグループに分けることができます: イニシエーター ・ カスパーゼ (カスパーゼ-1、-2、-4、-5、-8,-9,-10-12) と死刑執行カスパーゼ (カスパーゼ-3、-6、-7)。死刑執行カスパーゼは、前もって形成された二量体として細胞内に存在、大小サブユニット2間の乖離によってアクティブ化されます。アクティブになったとき、彼らはアポトーシス3の結果を多くの構造および調節蛋白質を切断します。イニシエーター ・ カスパーゼは最初カスパーゼ経路でアクティブにし、一般に死刑執行カスパーゼの活性化を誘発します。死刑執行のカスパーゼとは対照的イニシエーター ・ カスパーゼは二量体化4,5によってアクティブ化されます。この二量体は、活性化のプラットフォームとして知られている特定の大きな分子量複合体に非アクティブなモノマーの採用によって促進されます。活性化プラットフォームのアセンブリは、特定の蛋白質: 蛋白質の相互作用のシリーズによって支配されます。これらは、保存されている蛋白質相互作用モチーフ proform イニシエーター ・ カスパーゼの存在によって仲介される、死ドメイン (DD)、死のエフェクター ドメイン (DED) およびカスパーゼ募集ドメイン (カード) 6 (図 1 a)。活性化のプラットフォームは、受容体タンパク質とアダプター蛋白質に通常含まれます。受容体は、リガンドの結合するにより、多数の分子の重合における立体構造変化を誘発する有効になります。受容体、どちらかを募集するカスパーゼ直接または順番に、カスパーゼをもたらす複雑なアダプター分子。したがって、多数のカスパーゼ分子二量体化を許可する近接になります。これは誘導近接モデル7として知られています。二量化、一度、カスパーゼ活性酵素4,8を安定させるのに役立つ自動処理を受けます。たとえば、Apaf1 アポトソームのアセンブリは、シトクロム c がミトコンドリアの外膜透過 (MOMP) と呼ばれるプロセス内のミトコンドリアからのリリースで、以下によってトリガーされます。Apaf1 は、順番カードの両方のタンパク質9の存在によって媒介される相互作用を介してカスパーゼ 9 を募集します。同じような蛋白質の相互作用は、CD95 死の複雑なシグナルを誘導する (ディスク); カスパーゼ 8 の活性化につながるアセンブリカスパーゼ-2; をアクティブにすることができます PIDDosome様々 なインフラマソーム錯体カスパーゼ 1 の活性化10、11,12を開始します。したがって、イニシエーター ・ カスパーゼは、誘起近接と二量体化、活性化は発生しませんなしに共通のメカニズムによって特定の活発化のプラットフォームに募集しています。

カスパーゼ分子蛍光補完 (BiFC) はまずこのイニシエーター カスパーゼの活性化を測定するために開発されたイメージング ベースのアッセイ カスパーゼによる近接活性化プラットフォームを次の直接可視化が可能アセンブリ。このメソッドは、分割蛍光タンパク質金星の性質を活用します。金星は明るく、2 つの非蛍光性と少し重複フラグメントに分割でき、黄色い蛍光蛋白質 (YFP) のより多くのあるバージョン: ヴィーナス (金星 N または VN) と金星 (ヴィーナス C または VC) の C 末端の N 末端。これらのフラグメントは、フォールディングし、近接13時に蛍光になる能力を保持します。金星の各フラグメントは、カスパーゼ活性化プラットフォームへのバインドの最小の部分であるカスパーゼの prodomain に融合されます。これにより、カスパーゼ酵素活性は保持されません、したがって内因性イベントに関連付けられているダウン ストリーム イベントの同時分析が可能です。金星の断片フォールディング カスパーゼ prodomains 活性化プラットフォームを採用し、誘起近接を受けるとき。(図 1 b)。金星の生じる蛍光性は、正確かつ具体的に細胞レベル下のローカリゼーション、速度、および単一細胞におけるイニシエーター カスパーゼ活性化プラットフォームのアセンブリの効率を監視する使用できます。標準蛍光顕微鏡、共焦点顕微鏡で得ることができる画像データとを含む各種の顕微鏡のアプローチの数を合わせることができる: リアルタイムでカスパーゼ活性化を追跡するタイムラプス イメージング細胞レベル下のローカリゼーションの正確な決定のための高分解能イメージング終点の活性化効率の定量化。

この手法は、カスパーゼ 214の活性化を調査する最初に開発されました。2 カスパーゼの活性化のプラットフォームは、PIDDosome と考えられている中から成る PIDD (死ドメインと p53 誘導された蛋白質) 受容体とアダプター RAIDD (RIP 関連する ICH-1/CAD-3 死ドメインの相同タンパク質)、PIDDosome 独立 caspase-2 活性化が報告されています。カスパーゼ 2 追加のアクティブ化プラットフォームに15、16が存在することが示唆されました。カスパーゼの活性化プラットフォームの完全なコンポーネントを知らず、にもかかわらずカスパーゼ BiFC 法はカスパーゼ 2 シグナル伝達経路の分子レベル14,17の成功の尋問のため許可されています。我々 はまた、正常に炎症性カスパーゼ (カスパーゼ-1、-4、-5、-12) この議定書を適応している18と、原則として、同じアプローチは、同様に残りのイニシエーター ・ カスパーゼのそれぞれを分析するのに十分なはず。このプロトコルは、合わせることができる同様に二量体化が主要な活性化信号が他の経路を調査します。例えば、Janus のキナーゼ (JAK) 19によってリン酸化、次二量体化 STAT 蛋白質が活性化します。したがって、STAT の活性化だけでなく、動的蛋白質の相互作用によって調整される他の多くの経路を視覚化する BiFC システムを使用可能性があります。次のプロトコルは、画像集録および解析のためのセルに記者の導入のための手順や方法論を提供します。

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プロトコル

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1. 細胞や培養皿の準備

注: 組織培養層流フードの 1-3 の手順に従います。手袋を着用します。

  1. ガラス底培養皿を使用している場合は、フィブロネクチンとガラスをコートします。プラスチック製の食器を使用して手順 1.2 を省略します。
    1. フィブロネクチンの 0.1 mg/mL の溶液を作る: 9 mL の 1x PBS で 1 mg/mL フィブロネクチン溶液 1 mL を希釈します。
    2. 0.5-1 の各ウェルのガラス底をカバー フィブロネクチンの mL と室温で 1 5 分間インキュベートします。
    3. ピペットを使用して、フィブロネクチン ソリューションを収集、4 ° C で保存
      メモ: フィブロネクチン ソリューションを複数回使用できます。
    4. 1-2 mL の 1x PBS、一度ガラスを洗浄し、PBS を離れて吸い出しなさい。
  2. (別大きさで分類された井戸に使用する細胞数の表 1参照) 適切な細胞の培養基の 2 mL で 6 ウェル プレートのウェルあたり 1 x 10 の5セルをプレートします。安定 (ディスカッションを参照) カスパーゼ BiFC コンポーネントを表現する細胞ラインを使用している場合、2 x 10 の5セルをプレートし、治療手順 (手順 3) に進みます。
  3. 組織文化のインキュベーターで 37 ° C で一晩シャーレに付着します。

2. トランスフェクション細胞のカスパーゼ BiFC コンポーネントを紹介するには

  1. 適切なトランスフェクション試薬で細胞を transfect します。
    注: このプロトコルは、最小限の毒性のために最適化された Lipofectamine 2000 の指示をについて説明します。このプロトコルは、LN18 細胞 MCF7 細胞、Hela 細胞で正常に使用されています。追加場合、トランスフェクション試薬は製造元の指示に従って、必要に応じて最適化します。
    1. 生殖不能の管に低下した血清中メディアの 750 μ L にトランスフェクション試薬の 12 μ L を追加します。
    2. 5 分間室温でインキュベートします。
    3. 追加 10 ng 記者プラスミド (蛍光蛋白質、例えば赤い蛍光蛋白質 [RFP] transfected セルにラベル付けするプラスミド) のために導入するのにも、各滅菌 1.5 mL チューブに。
    4. 20 追加各カスパーゼ BiFC プラスミドの ng (例えば、20 カスパーゼ-2 prodomain [C2 プロ] ng-VC と 20 ng C2 Pro (ヴァイオリン) の) 各管 (表 2) に。
    5. 低下した血清中のメディアを追加することにより 100 μ L の総ボリュームまで各チューブをもたらします。
    6. P200 ピペットを使用して、追加のトランスフェクション試薬溶液 100 μ L ステップ 2.1.2 からプラスミドの混合物に滴状に。
    7. プラスミド トランスフェクション試薬ミックス室温で 20 分間、インキュベートします。
    8. メディアや吸引でピペットを使用してセルからの吸引し、井戸の横にそっと血清無料メディアの 800 μ L をピペット p1000 ピペットを使用しています。
    9. P200 ピペットを使用して、各ウェルに滴状 DNA 脂質複合体の 200 μ L を追加します。
    10. 3 h の 37 ° C で培養孵卵器内のセルを孵化させなさい。
    11. ように注意して、単層を混乱させる、ピペットで吸引を使用して吸引により DNA 脂質複合体を含む血清無料メディアを削除します。
    12. 各ウェルの側を軽く下に予め温めておいた (37 ° C) 完全な成長媒体の 2 mL のピペットします。
  2. 最適な蛋白質の表現のための 24-48 時間培養のインキュベーターで 37 ° C でセルを孵化させなさい。

3. カスパーゼ活性化の誘導

  1. 薬やカスパーゼ活性化約 24 h 後トランスフェクションを誘導する刺激を扱います。
    1. 目的に薬物濃度予め加温 (37 ° C) イメージング メディア (Hepes [20 mM, pH 7.2 7.5] と 2-メルカプトエタノール [55 μ M] 補足の完全な成長媒体) とミックス優しくを追加 (表 3)。
    2. 吸引や吸引でピペットを使用してセルからメディアと井戸の横にそっと 3.1.1 から溶液 2 mL ピペット ピペットを使用して、その後。
    3. 未処理のコントロールと 1 つの井戸に薬物なしのイメージング メディアを追加します。
  2. 37 ° C で培養のインキュベーターで細胞をインキュベートかコマ撮り実験手順 4.3 に進みます。

4.カスパーゼ BiFC データ集録

  1. 単一の時間ポイント獲得のカスパーゼ BiFC
    1. 顕微鏡と蛍光光源の製造元の指示に従ってを入れます。
    2. RFP フィルターとレポーター遺伝子蛍光焦点の下のセルを検索します。
    3. 手集計カウンターを使用すると、視野の RFP 陽性の細胞のすべてをカウントします。数を記録します。
    4. 同じ視野を維持しながら GFP フィルター (または YFP フィルター使用可能な場合) に切り替えるし、緑も赤血球の数を数える手集計カウンターを使用して、(金星陽性)。金星陽性赤血球のみが評価されることを確保するため 2 つのフィルターを切り替える前後。レコード番号 (図 3)。
    5. 各プレートの 3 つの個々 の領域の少なくとも 100 の RFP 陽性細胞を数えます。
    6. 各エリアで金星正トランスフェクション細胞 (すなわち緑も赤細胞) の割合を計算します。標準偏差を取得する結果の割合を平均します。
  2. カスパーゼ BiFC の 3次元イメージング
    1. 製造元の指示に従って顕微鏡をオンにし、集録ソフトウェアを起動します。
    2. 60 x 63 x 石油目的を選択し、目的に油の滴を配置
    3. 正しいプレート ホルダーを使用して顕微鏡ステージの培養皿を配置します。
    4. 落射蛍光光源や顕微鏡アイピースや共焦点レーザーとコンピューターの画面のいずれかを使用して、目的のフィールドに移動します。
    5. RFP レーザやフィルターを使用してレポーター蛍光に焦点を当てます。
    6. 落射蛍光は、この時点までに使用されている場合、共焦点レーザー光源を切り替えるし、カメラによって獲得されたと集録ソフトウェア コンピューターの画面上で表示されているセルのライブ イメージを視覚化します。
    7. ジョイスティック コントロールとフォーカス ホイールを使用して、微調整やセルの位置、フォーカス、ファインダーの中央にあるセル。お互いから分離され、重複していないセルを選択します。
    8. 実験用に最適な設定を決定するための出発点として、金星の RFP 割合のレーザー出力の 50%、100 ms で露光時間を入力します。
    9. ライブ キャプチャおよび検査結果の画像と両方のチャネルの付属表示ヒストグラム。
    10. 信号が少なく、イメージ作るは難しいが場合、は、画像の信号までの増減割合レーザー力および/または露出時間が長くなるよさそうです。
    11. 信号が飽和しないを確認します。顕著なピークは、各蛍光表示されるかどうかを確認する表示ヒストグラムを検査します。ピークを包含する全体のヒストグラム表示場合、は、低いレーザー力と露出設定 (図 2) を入力します。
    12. 信号の特定を確実に同じ条件の下で制御 (未処理または非導入) の細胞を可視化します。
      注: 単色形質転換細胞は、クロス オーバーの制御にも使用できますが、信号が空間的に異なる (例えば細胞質とミトコンドリア) 場合これは必要ではありません。
    13. 選択または顕微鏡のソフトウェアで Z スタック モジュールを開きます。
    14. フォーカスつまみを使用して、セルの中心に対応する焦点の位置を近似します。
    15. セルが表示されなくなるまで、1 つの方向でピントを調整、トップの位置とこれを選択します。
    16. セルが再び表示されなくなるまで反対方向にフォーカスを調整し、下の位置としてこれを選択します。
    17. 最適ステップ サイズ (通常約 20 μ m) を選択し、自動的に上部と下部の位置の間 20 μ m の手順のそれぞれで各チャンネルで 1 つの画像を取るためにカメラを指示する集録を開始します。
    18. (図 4、映画 1) 3 D のイメージを再構築するのに 3 D レンダリング ソフトウェアを使用します。
  3. カスパーゼ BiFC のタイムラプス イメージング
    1. 実験する前に少なくとも 1 時間は顕微鏡をオンにし、37 ° C に温度を設定
    2. 40 x、60 x 63 x 石油目的を選択し、目的に油の滴を配置します。
    3. 正しいプレート ホルダーを使用して顕微鏡ステージの培養皿を配置します。
    4. CO2発生源が利用できる場合は、プレート ホルダー上に CO2配信デバイス (通常提供する CO2管に接続されているプレキシ ガラス蓋) を置きます。CO2レベルを 5% に設定し、ソフトウェア内から CO2のコント ローラーをオンにします。CO2発生源が利用できない場合 20 mM Hepes にメディアをバッファーが含まれます。
    5. Transfected セルのフィールドに移動し、カメラによって獲得されたと RFP レーザーを使用して、コンピューター画面上の獲得ソフトウェアによって表示されているセルのライブ イメージを視覚化します。
    6. 次の手順 4.2.8-4.2.12 RFP レーザーのレーザー パワーと暴露時間割合の設定を入力します。蛍光信号を検出することができるしながらこれらの値をできるだけ低く保ちます。
    7. 肯定的な制御を使用してサンプル (例については表 3を参照) で、以下 YFP レーザ光のレーザー パワーと暴露時間割合の設定を入力する手順 4.2.8-4.2.12。金星信号を検出することができるしながらこれらの値をできるだけ低く保ちます。
    8. プレートの各ウェル、記者を表現する 1 つまたは複数のセルを含む別の位置の数を選択します。
    9. 取られるフレームの時間経過および合計数の各フレーム間の時間間隔を入力します。次のフレームが行われる前にすべての選択した位置を取得する時間があることを確認します。
    10. 各位置に再アクセスして、修正し、必要に応じてフォーカスを更新します。
    11. 外部振動や温度の変化に起因する焦点のドリフトを修正するにフォーカス ドリフト補正システム (ある場合) をオンに。
    12. コマ撮りを開始し、データを保存します。
    13. (図 5、映画 2) 利用のイメージング ソフトウェアを使用してデータを分析します。

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結果

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カスパーゼ 2 BiFC による DNA 損傷の例は図 3に示します。カンプトテシン、トポイソメラーゼ私阻害剤は DNA の損傷・ カスパーゼ-2 の活性化を誘導するために使用されました。BiFC プローブを細胞に表現をし、セルの合計数を視覚化するために、赤の蛍光タンパク質 mCherry は記者として使用されました。金星蛍光グリーンでは、大涙点を表すカスパーゼ 2 近接を誘発します。金星-陽性細胞の割合を決定するため、これらの細胞を数えることができます。細胞内局在についての結論は、このようなイメージからも可能です。例で示すように、細胞質17のように核小体もカスパーゼ 2 誘導近接が検出されました。カスパーゼ活性化複合体の細胞内分布の高解像度の可視化を提供するために単一セルの 3 次元でイメージを作成できます。図 4は、このような 3 D 画像を表現する 2 つの方法を示しています。最初はセルの 3 D 再...

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ディスカッション

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このプロトコルでは、カスパーゼによる近接を測定する蛍光タンパク質を分割の使用について説明します。それは非常に明るく、非常にあると、巻き戻しである高速13分割金星この方法を選ばれました。したがって、カスパーゼ タンパク質相互作用ダイナミクスの実時間推定に近い金星カスパーゼによる近接時に巻き戻しの分析を提供できます。金星は金星 (ヴィーナス N または VN) から成るアミノ酸 1 173 の N 末端、2 少し重複フラグメントに分割され C 末端フラグメント (金星 C または VC) から成る残留 155-239。その他の分割の蛍光タンパク質が存在するが、分割 mCherry など、いくつかは 2 h まで巻き戻し21の 4 ° C で培養を必要とします。追加の分割蛍光タンパク質セルリアン (シアンの蛍光タンパク質のバージョン) を分割を含むと遠赤の分割 mLumin がまだこのコンテキスト13,22でテストされます。最終的に...

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開示事項

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著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この技術の開発に貢献した Bouchier ・ ヘイズ ラボのすべての前メンバーを確認したいと思います。この仕事の一部 LBH テキサス子供病院小児パイロット賞によって資金を供給されました。Joya チャンドラ (MD アンダーソン、ヒューストン、テキサス州) は、彼女のチームと共同で公開されているデータを含むようにアクセス許可を感謝いたします。記述されている試薬の開発は NIH (NIAID P30AI036211、NCI P30CA125123 傘下 S10RR024574) とジョエル ・ m ・ Sederstrom の援助からの資金とフローサイトメトリーおよび薬の Baylor の大学で細胞選別コアによって支えられました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
6ウェル コーティングされていない No. 1.5 20 mm ガラス底皿MattekP06G-1.5-20-F
ヒト血漿フィブロネクチン精製タンパク質ミリポアFC010-10MG
DPBSシグマD8537-6x500ML
リポフェクタミン 2000 試薬Invitrogen11668019
OPTI MEM I31985088
C2-Pro VCプラスミドAddgene49261
C2-Pro VNプラスミドAddgene49262
LBHから要請により入手可能な炎症性カスパーゼBiFCプラスミド
HeLa細胞から入手可能 安定的に発現するC2-Pro BiFC成分LBH
DsRed水戸プラスミドClontech632421蛍光レポーターとして使用できる同様のプラスミドは、Addgene
HEPESInvitrogen 15630106
2、Mercaptoethanol、1000XInvitrogen21985023
、q-VD-OPHApex BioA1901
LBH、、 にあります

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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