カエノラブディティス ・ エレガンスにおける縦断的イメージングのためのマイクロ流体プラットフォーム

サマリー

この記事では、カスタム マイクロ流体デバイスを用いた個々 のワームのライブ イメージングを示しています。デバイスに複数のワームは個別に分離室、さまざまな生物学的プロセスの多重縦監視を許可に限定されます。

要約

過去 10 年間でマイクロ流体技術小動物、線虫、線虫などの研究に適用されているし、便利なライブ イメージング プラットフォームの正確な制御のための機能を提供すると役に立つことがわかりましたリアルタイムでの実験条件。この記事では、WormSpa、以前発行したカスタム マイクロ流体デバイスを用いた個々 のワームのライブ イメージングを示しています。デバイスに複数のワームは個別に分離室、さまざまな生物学的プロセスの多重縦監視を許可に限定されます。機能を示すためには、病原性細菌を持つデバイスに感染していたワームと産卵および免疫応答遺伝子発現の動態は個人で継続的に監視された原理実証実験を行った動物。シンプルなデザインとこのデバイスの操作では、マイクロ流路を用いた実験で以前経験がないユーザーに適してください。このアプローチは明確に定義された条件の下で生物学的過程の縦断的観察に興味がある多くの研究者に有用であることを提案します。

概要

環境条件の変化は、誘導と特定の遺伝子^1,2発現の抑制を伴う遺伝的プログラムの活性化につながる可能性があります。これらの運動の変化組織同じ動物と異なる動物間の間で変数があります。このような遺伝的プログラムの研究したがって個々 の動物の縦画像および環境条件の正確な動的制御を提供するメソッドを呼び出します。

近年、マイクロ流体デバイスの応答とワーム、はえ、水クマより^{3,4,5,6などの小動物の行動の多くの側面を研究に使用されています。 7}。アプリケーションがあります、たとえば、深い表現、光の化学刺激に対する応答における神経活動の記録と歩行などポンプ^8,9,10モーター動作の追跡^,11。

マイクロ ベースのアプローチは、環境手がかり、ローカルの微小のメンテナンスを可能にする柔軟な設計の正確な動的制御などへの応答の長期縦断的イメージングに恩恵を受ける可能性があります多くのプロパティを保持します。別の四分の一、およびイメージングのための有利な属性で個々 の動物。しかし、彼らの幸福に有害影響を最小限で長い時間のため流体チャンバーで動物を維持するは、実験の実行だけでなく、マイクロ流体デバイスの設計で特に注意を必要とする課題です。

ここで我々 は WormSpa、線虫の縦断的イメージングのためのマイクロ流体デバイスの使用を示します。⁵個々 のワームが部屋に閉じ込められました。ワームは、十分に供給し十分に健康を維持し、ストレスを軽減するために積極的、チャンバーの構造によって、ワームの卵を産むは液体や細菌懸濁液の定低流量を保証します。デザインのシンプルさと WormSpa の操作は、自分の研究計画にこのデバイスを組み込むマイクロ流路中は以前の経験を持つ研究者をようにします。

プロトコル

以下のプロトコルは、WormSpa⁵ワームの縦画像の説明したマイクロ流体デバイスを使用します。(リクエストの作成者から入手できる CAD ファイルから始まる) WormSpa の作製は簡単ですが、いくつかの専門知識が必要です。ほとんどの場合、中核施設やそのようなサービスを提供する商業企業は、作製を行う容易にことが。機能の高さは 50 μ m であることを指定するのには、デバイスを製造するときを確認します。

1. 実験装置

1. 電動ステージと倒立蛍光顕微鏡のマイクロ流体デバイスをマウントします。
2. 顕微鏡に近い軌道シェーカーを配置、シェーカーから振動顕微鏡に直接影響しないかどうかを確認します。たとえば、光学テーブルとの接触を一切壁に固定棚にシェーカーを置きます。
3. 軌道のシェーカーにシリンジ ポンプを配置します。それは揺れながらプルプルしないので、シェーカーにポンプをテープします。

2. マイクロ流体環境の準備

注: 実験中に 4 つの注射器に接続している注射器のチューブを介してマイクロ流体デバイス図 1で説明したよう。この手順では、これらの注射器の準備について説明します。特に記述がない限り、タウトをせずできるだけ短く注射器チューブを維持します。

1. アウトレットの注射器と注射器チューブを準備します。この注射器 (図 1では、S1) は後で注射器の管を通って装置のコンセントに接続され、デバイスから出てくる流体の一時ストレージに使用します。
   1. アダプター針を針 (金属部分) のみを維持する 20 x 1/2 インチのシリンジの先端のプラスチックの部品を削除してください。プラスチックや金属パーツをペンチで押しそれらを引き離すようにします。針の残りのプラスチック残渣は、ブンゼン バーナーと焼くことができます。
   2. ペンチでその 2 つの端を押しながら実験のセットアップの幾何学によると針を曲げます。ここで説明した設計、その真ん中に針を 〜 110 ° の角度に曲げ、最も便利です。
   3. アダプター針半分の方法をチューブに差し込みます。他の半分は後でデバイスに接続されます。注射器のチューブ リーク (たとえば、0.86 mm の内径と外径 1.32 mm チューブ) なし 20 G シリンジの先端と互換性があります。推奨チューブの長さは、~ 50 cm です。
   4. 10 mL ルアーロック シリンジをシリンジ チューブ 20 x 1/2 インチ シリンジ チップを介しての他の (開いている) 端に接続します。
2. バッファー入口注射器を準備し、チューブを注射器します。これらの注射器の 1 つ (図 1の S2) が行くデバイスおよび注入の流れを制御する流体の貯水池として使用されます。その他の注射器 (図 1の S3) はバッファー交換に必要な手順 3.2 で説明したよう。
   1. 注射器チューブ (図 1) を介して同じ弁三方弁に直接 10 mL ルアーロック シリンジ (S2) を接続し、別の注射器 (S3): シリンジ チップを介してチューブに S3 を接続し、バルブを介して別のシリンジの先端にチューブを接続します。
      注: これらの材料は、接続されている順序は関係ありません。
   2. 三方弁の残りのポートに注射器のチューブを接続します。ステップ 2.1.2 のように別のアダプターの針を準備、注射器管のもう一方の (オープン) の端に針を半分の方法を差し込みます。
   3. S3 が閉じている間、2.2.2 のステップと S2 で注射器管が接続されているようなバルブを設定 (図 1)。
3. ワーム入口の注射器と注射器チューブを準備します。この注射器 (図 1の S4) がデバイスにワームを読み込むために使用されます。
   1. 10 mL ルアーロック シリンジ (S4) に長い注射器のチューブを接続します。読み込み用に使用する流体の量からこのチューブの長さを決定します。たとえば、100 cm のチューブの液体 2 mL 以上をサポート (また、手順 4.2 を参照)。
   2. 2.1.2 の手順のように別のアダプターの針を準備し、片方注射器管の他の (開いている) 最後に針の半分。
4. すべての注射器とチューブ S 中¹²回すすぎます。S 媒体、すべての空気の泡を削除に世話、注射器やチューブを入力します。
5. 装置のコンセントにコンセント注射器のチューブを接続します。
   1. 出口ポートに注射器管端アダプター針を差し込みます。
   2. 少し S 中はバッファー入口とワームの入口から出てくるまでにデバイスを埋めるためコンセントを通じて S 媒体の少量を注入します。
6. ピン (1/32 インチ径ステンレス鋼ダウエルピン) ワーム入口を接続しながら、デバイスのバッファー入口ポートにバッファー入口注射器チューブを接続します。
7. デバイスにバッファーの一定の流れを挿入します。シリンジ ポンプ¹³、上にバッファー入口シリンジ S2 を読み込み、S2 内の媒体は 3 μ L/分の流量でデバイスに連続的に注入するようにポンプを設定します。

3. マイクロ流体デバイスへの細菌の読み込み

1. エシェリヒア属大腸菌OP50 S 中¹²で中断を準備します。
   1. 標準プロトコル LB と単一コロニーの 50 mL の 250 mL フラスコに接種し、37 ° C で一晩インキュベート
   2. 10 分間 4000 rpm で一晩かけて培養を遠心し、S 培地 30 mL にペレットを再懸濁します。
   3. 5 μ m のシリンジ フィルターを介して懸濁液をフィルターします。600 でその光の密度によって細菌濃度を測定 nm (外径₆₀₀) 外径 φ₆₀₀ 3 濃度を調整。この高密度は、ワームの供給を維持する必要があります。
2. OP50 サスペンション デバイスのバッファーを交換します。
   1. OP50 懸濁液で満たされた清潔なシリンジ (S5) を準備します。注射器を垂直に保持し、それの上部にすべての気泡を収集する数回をタップします。
   2. デバイスへの接続を閉じますバッファー入口注射器の三方弁を切り、注射器 2 S2 と S3 を接続します。シリンジ ポンプから S2 を外します。
   3. バルブから S2 を外し、バルブに S5 を接続します。バルブを介しての S3 に S5 の上部に収集し、その少し OP50 バッファーの S3 に入るまでのすべての空気を押し出します。そう、S5 またはバルブで空気の泡が残っていないことを確認します。
   4. S3 と S5 の間の接続を閉じます、デバイスに S5 を接続し元の位置に戻る 3 方向バルブを回します。シリンジ ポンプに S5 をロードします。ポンプを保持する軌道のシェーカーを入れます。揺れの速度を約 200 rpm に設定します。
   5. 100 μ L/分の流量を設定します。デバイスでワームに到着する新しいバッファーにかかる時間は、バッファー入口注射器チューブ (上記チューブで約 5 分) の長さに依存します。高速バッファー交換が必要な場合、高い流量を用いることができます。
   6. OP50 バッファーはデバイスに広がる、かつては、流量を設定 3 μ L/分に戻します。

4. マイクロ流体デバイスにワームを読み込む

1. 小さな低結合遠心チューブ (650 μ L) を準備し、OP50 懸濁液 100 μ L でそれを埋めます。まわりの伝達の 20-30 歳同期若い成虫 (46 時間後 25 ° C での L1 幼虫逮捕) NGM (線虫成長媒体) 寒天からチューブにワームで一つずつそれらを選ぶことによって選ぶ。次の標準プロトコル¹²歳同期を行うことができます。
2. ワーム入口を埋める OP50 懸濁液管 (図 1の S4) をシリンジと注射器。ワームと流体の 〜 500 μ L の遠心管に挿入します。ワーム入口注射器管にワームを懸濁液を描画します。注射器管が十分な長さを確認 (> 1 m) S4 注射器に描かれたワームが注射器管に滞在し、そうでないとします。
3. S4 をワーム インレットに接続します。マイクロ流体デバイスにすべてのワームはワーム入口注射器管を挿入します。S4 と注射器チューブを外します。ピンでワーム入口を差し込みます。
4. 機械ポンプ (図 1) からバッファー入口シリンジ S2 を外し、別のチャネルにすべてのワームをプッシュするには、S1 と S2 を手動で制御します。S2 を押すことにより、S1 を押すと逆方向にそれらを移動が、そのチャンネルにワームを移動します。チャネルが読み込まれると、各チャネルでワームは他のワームのエントリをブロックします。
5. ワームの新しい環境に 2-3 時間の調整をしましょう。

5. イメージング プロトコルを設定

1. 安全にデバイスにあるすべてのワームを見つけるし、制御あなたの顕微鏡画像集録ソフトウェアでそれらのそれぞれの画像の位置を設定します。いくつかのケースで (例えば高倍率が必要な場合、または小さい CCD センサーのカメラを使用して) 複数の画像の位置が各チャンネルに必要。
   注: これは手動で行うことができます、いくつかのソフトウェア パッケージは画像の撮影場所の位置を一覧表示するテキスト ファイルを読み込むことができます。これらの位置は WormSpa で定期的に並べられて、ユーザーはそのようなリストを自動的に作成する (例えばPython や商用ソフトウェア) の小さなスクリプトを書くことができます。このスクリプトの正確な形式は、取得ソフトウェア (補足資料 1の例を参照) されたファイル形式によって異なります。
2. タイムラプス観察の必要な周波数を設定します。たとえば、感染症への免疫の遺伝子応答のイメージングは、フレームあたり 10 分の頻度で行われます。すべての時点ですべて必要なチャンネル (例:明視野、GFP 蛍光) を取得ことを確認します。

6. ホストに対して緑膿菌感染症

注: この手順は、特定ホスト病原体の相互作用を研究するためです。また、1 つは興味 (生物的・非生物的ストレス、薬、シグナリング分子、等) の他の環境の手がかりが含まれているバッファーを準備できます。

1. 緑膿菌PA14 SK 中¹⁴で中断を準備します。
   1. 50 ml の LB と単一コロニーの 250 mL フラスコに接種し、37 ° C で一晩インキュベート
   2. 50 mL の LB のと、文化の別の 250 mL フラスコに接種し、37 ° C で一晩インキュベート
   3. 10 分間 4000 rpm で一晩かけて培養を遠心し、SK 培地 10 mL にペレットを再懸濁します。細菌の濃度を測定し、OD₆₀₀に濃度を調整 = 4。
   4. きれいなフラスコに懸濁液を転送し、37 ° C 24 時間と揺れながら 24 時間は、25 ° C で孵化させなさい。この手順は、アッセイの¹⁴を殺す標準平板培養ステップを模倣します。
   5. 5 μ m のシリンジ フィルターを介して懸濁液をフィルターします。これはデバイスを目詰まりから細菌の凝集を防ぐためです。
2. ステップ 3.2 のように同じ手順に従って PA14 サスペンション デバイスで OP50 サスペンションを交換してください。10 時間のイメージングを維持します。

結果

プロトコルで説明されているようにデバイスに読み込まれた (46 時間ポスト L1 幼虫逮捕 25 ° C で)¹²歳同期の若い大人ワーム。ワームは、病原体に対する動物の反応の縦断的測定を有効にする別のチャネルで個別に位置していた。実験が成功したら、ほとんどのワームは、実験の期間の彼らのチャネルに残る。この場合、動物を積極的に検索する必要がある、画像パスに彼らのチャネルを置くだけで、各ワームの画像。図 2Aデバイスの 10 時間にわたって 1 つの代表的なワームの明視野画像を示しています。ワームは、チャネル内に閉じ込められて、彼らは移動することができますアップおよびダウン ストリームと頭を自由に変えることができます。これは、デバイス自体がストレスの原因、動物に害を与えるまたはしないことを保証するため重要です。

我々...

ディスカッション

マイクロ ツールは、ワームの勉強に複数の利点を提供します。PDMS のイメージング デバイスは標準 NGM 寒天プレートと比較してより高い画像品質を提供しています。複数の画像は、伝統的な方法で動物をプレートから選んだし、イメージングのための顕微鏡スライドのマウントとは異なり、1 つのワームから取得できます。さらに、定数または正確な環境の構成と動物の応答間のマッピングを許可する、必要に応じて変調は、ワームが存在する微小環境を維持できます。

ここで日和見病原体膿PA14 カスタム マイクロ流体デバイス (WormSpa) を使用して複数の個々 のワームの応答をイメージングして細菌感染に対する宿主の反応の縦断的測定を実行する方法を示しました。明視野と蛍光画像は継続的な実験の摂動なしで複数回撮影されました。特に、産卵とirg 1遺伝子発現の動態が 10 分ごとに従来の^14,15間時間分解能の大幅な増加がプローブされます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
WormSpa	N/A	N/A	WormSpaのCADファイルは、Levineラボから入手できます。
複合顕微鏡	Zeiss	AxioObserver Z1	電動ステージ付き倒立型蛍光顕微鏡
シリンジポンプ	New Era Pump Systems	NE-501
Tubing	SCI Scientific Commodities Inc.	BB31695-PE/5	0.034インチ(0.86 mm) 内径 x 0.052インチ(1.32ミリメートル)O.D
シリンジ チップ	CMLsupply	901-20-050	20 ゲージ x 1/2" 鈍い先端 ステンレス鋼カニューレ
シリンジ フィルター	PALL	4650	Acrodisc 32 mm シリンジ フィルター 5 um スープル メンブレン
リンジ	Qosina	C3307	10 mL オス ルアー ロック シリンジ
3 ウェイ バルブ	コールパーマー	FF-30600-23	大口径 3 ウェイ、オス ロック、ストップコック、10/パック、非滅菌
ダボピン	McMaster-Carr	90145A317	18-8ステンレス鋼ダウエルピン(1/32インチ直径x1/2インチLg。
低結合性マイクロ遠心チューブ	Corning	CL S3206	0.65 mL 低結合スナップキャップ マイクロ遠心チューブ