方法論記事

嗅覚ニューロンの光刺激に対する応答のショウジョウバエ幼虫の行動を追跡

DOI：

10.3791/57353

⸱

2018年3月21日

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1Department of Biology, MS-0314, University of Nevada, 2Integrated Neuroscience Graduate Program, University of Nevada

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルは、その嗅覚ニューロンの同時光刺激に対する応答のショウジョウバエ幼虫のナビゲーション動作を分析します。630 nm の波長の光は、赤いシフト チャネル ロドプシンを表現する個々 の嗅覚ニューロンをアクティブに使用されます。幼虫の動きが同時に追跡、デジタル記録、カスタムで作成されたソフトウェアを使用して分析します。

要約

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臭気源に向かって移動する昆虫の機能は (ORNs) 一次嗅覚受容ニューロンの活動に基づいています。ORN 匂いレスポンスに関する大量の情報が生成されている特定 ORNs 行動反応を推進する上での役割のままかりです。挙動解析における合併症を生じ個々 ORNs、単一の匂いと嗅覚刺激による自然観察された変化を複製の難しさによって活性化される複数 ORNs をアクティブな匂い分子の別のボラティリティ研究室では、従来の臭気配信方法。ここでは、その ORNs の同時光刺激に対する応答のショウジョウバエ幼虫の行動を分析するプロトコルについて述べる。ここで使用される光技術 ORN 活性化の特異性や ORN 活性化の時空間パターンの正確な制御ができます。対応する幼虫の動きは追跡され、デジタル記録、カスタム ソフトウェア書かれたを使用して分析します。光刺激と匂い刺激に置き換えて、このメソッドは、幼虫の行動への影響を研究するために個々 の ORN の活性化のより正確な制御できます。幼虫に及ぼす局所介在ニューロン (LNs) だけでなく、二次投射ニューロン (PNs) の影響を研究する手法をさらに拡張できます。このメソッドはこのように嗅覚回路関数の包括的な郭清を有効にして動作応答でどのように嗅覚ニューロン活動を補完する研究に翻訳します。

概要

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ショウジョウバエ幼虫の環境で嗅覚情報を最終的に決定する幼虫の行動1,2,3,4のみ 21 機能的に異なる ORNs、活動によって検知されます。まだ、比較的少しはこれらの 21 ORNs の活動、感覚情報がエンコードされたロジックについていいます。こうして、実験的行動に各幼虫 ORN の機能の貢献を測定する必要があります。

ショウジョウバエ幼虫 ORNs の全体のレパートリーの感覚応答プロファイル詳細1,4、5、個々 ORNs 嗅覚回路を図りするの貢献研究されていますがナビゲーションの動作は不明します。幼虫の行動研究の難しさはこれまでのところ、時空間単一 ORNs をアクティブにすることができないのために発生します。21ショウジョウバエ幼虫 ORNs の 19 を明示的にアクティブに匂いのパネルは、最近は、1だった。低濃度で、パネルの各臭気物質は、その同種 ORN からのみ生理反応を引き出します。しかし、従来の動作の試金で使用される通常より高い濃度で各臭気物質は複数 ORNs1,5,6からの生理学的な応答を引き出します。さらに、このパネルで匂いは安定した臭気グラデーション7,8の形成に依存する行動の研究の解釈を複雑にする情勢に変わった。最後に、当然のことながら発生するニオイ刺激に対する実験室の条件の下で複製することは困難であるテンポラル コンポーネントが存在します。したがって、空間的で、一時的な方法で個々 の ORNs を同時にアクティブ化中の幼虫の行動を測定できる手法を開発する重要です。

ここでは、前述の幼虫のトラッキングの利点を持つメソッド1,8の試金を示しています。Gershowらに記載されている追跡アッセイは、動作アリーナ8内の臭気の安定勾配を維持するために電子制御バルブを使用します。ただし、臭気刺激セットアップを構築に関与する複雑なエンジニア リング レベルのため、このメソッドは他の所で複製することは困難です。さらに、単一 ORNs を明示的にアクティブにする匂いを使用に関連する問題が未解決のまま。マシューらに記載されている追跡分析簡単匂いの配信システムを使用しますが、生成される臭気グラデーションはテスト臭気物質の揮発性に依存してアッセイ1の長期間にわたって安定ではないです。したがって、臭気刺激を光刺激に置き換えることによって提案手法は制御 ORN 活性化の特異性の利点があり、異なる強度の臭気勾配の形成には依存しません。

私たちのメソッドは、簡単にセットアップショウジョウバエ幼虫ナビゲーションの側面を測定する際に興味を持って研究に適した。この手法は、研究者が選択の彼らのお気に入りのシステムの neuron(s) におけるCsChrimsonの発現をドライブすることができる他のモデル システムに合わせることができます。CsChrimsonは、チャネルのロドプシンの赤いシフト バージョンです。幼虫の走光性システムには見えない波長でアクティブには。したがって、特異性、信頼性、および再現性9ニューロンの活動を操作することがられます。カスタム主題のサイズの変更を考慮してソフトウェアを書かれたを変更すると、このメソッド簡単に他の昆虫の幼虫をクロールに適応できます。

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プロトコル

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1. 動作アリーナの構築と行動の分野で光刺激を有効にするハードウェアの準備

  1. 光の射さない動作アリーナを構築する 66 cm3 x 61 x 89 のディメンションを持つボックスを構築 (35"L x 24" W x 26"H) 製の黒着色されたプレキシ ガラス アクリル シート (厚さ 3 mm) (材料の表を参照してください)。このようなボックスを構築する材料はローカルのハードウェア店で利用できるべきであります。動作室 (図 1A) でテーブルの上には、このボックスを配置します。
  2. 白黒 USB 3.0 CCD カメラが装備 IR ロングパス 830 nm フィルターと 8 mm F1.4 C マウント レンズ マウント (材料表参照) ブラック ボックスの天井の中心に。場所 2 つの赤外線 LED ストリップ (材料表参照) テーブルの上に暗いアリーナ (図 1A) で幼虫を照らすために。
  3. LED プラットフォームを構築するには、22 cm × 22 cm の正方形アルミ板 (できれば任意の反射を除去するためにマット ブラック仕上げと塗装スプレー) を取得します。金属のカッターを使用して、プレートの中心部に CCD カメラの周りに合うように十分な大きさの穴をカットします。
  4. 赤 LED ストリップ ライト (材料の表を参照) と金属板をカバーしてください。シリーズの LED 光ストリップ線をはんだ付けし、ラズベリーパイ 2B マイクロプロセッサによって制御フォトカプラー リレーにストリップ線をフィード (材料の表を参照してください) (図 1Bと2)。
  5. インストールし、ラズベリーパイ プロセッサ上フォトカプラー リレーを LED ストリップに接続する前に Ubuntu の仲間/Raspian ジェシー/Linux ベース オペレーティング システムを構成します。電源を電源 LED ストリップとフォトカプラー (図 2) を添付 (材料の表を参照してください)。CCD カメラ (図 1B) の周り LED プラットフォームをマウントします。
    注: Ubuntu メイト v16.04 オペレーティング システムは自由に利用できます。Python ベースの簡単なコマンドのセットは、LED 光刺激 (構文のファイルを参照してください) のプログラム パターンに容易に適応することができます。
  6. 行動の分野での様々 なポイントで均一な照度を確保します。分光計の助けを借りて、アリーナの表面で絶対放射照度を測定し、アリーナの表面全体で ~1.3 W/m2であることを決定します。
    注: この強度で大幅な変更は認められなかった温度の実験の経過。10の別の研究は、~1.9 W/m2の高い照度を使用し、実験の過程で温度の変化は認められなかった。

2.ショウジョウバエ幼虫の挙動解析のための準備

  1. 標準的なはえの食糧にハエを維持 (材料表参照) 25 ° C、相対湿度 50-60% と 12/12 h 明暗サイクルで。
  2. CsChrimson ORNs の一組を表現するために処女の女性をUA IV CsChrimsonラインからポインタ Gal4ラインから男性にクロス (21 幼虫匂い受容体の 1 つに対応する 'X' (または) 各一意に表現される遺伝子21 対 ORNs)9,11。
    1. 代わりに、すべて 21 幼虫 ORNs でCsChrimsonを表現するためにUAS IV CsChrimsonから処女女性クロス行男性 ('同居者' はすべて 21 ORNs で表される共受容体)及び同居 Gal4ラインから。
    2. これらの実験のコントロールとしてひとりでにUAS IV CsChrimson線を使用します。
      注: ここに記載されているはえの在庫全てがブルーミントン ショウジョウバエ ストック センター (材料の表を参照してください)。
  3. クロスで男性と女性のハエはチームメイトし、48 時間卵を産むを許可した後は、新鮮なバイアルに大人を転送します。
    1. 卵を含む食品のバイアルの表面、ジメチルスルホキシド (DMSO) で溶解した 400 μ M すべて trans 網膜 (ATR) と蒸留水に溶解した 89 mM ショ糖を含んでいる混合物の 400 μ L を追加します。
      注: ショ糖の少量は、ATR ソリューションの幼生供給を推進しています。ATR は CsChrimson 式9,10の骨折に必要な補酵素です。ATR は光に敏感です。
    2. 卵を含む食品のバイアルに ATR を追加すると、さらに 72 時間暗闇の中でバイアルを孵化させなさい。
      メモ: ATR 挿入による幼虫の挙動に及ぼす影響は、この研究と上記の 2 つの研究は観察していなかった間、ATR は ATR が含まれていない上記の混合物の同じ量をテスト線をかけることによって給餌の影響を制御することをお勧めします。
  4. はえの食糧の表面から 3 齢幼虫 (産卵後 ~ 120 h) を抽出するには、高密度 (15%) ショ糖液を使用してそれらをフローティングします。マイクロ ピペットは 1000 mL のガラス製ビーカーにショ糖液の表面に浮かんで幼虫を別、P1000 を使用します。
  5. ガラス ビーカーに 800 mL の新鮮な蒸留水たびに交換することによって幼虫の 3-4 回を洗ってください。動作分析へそれらを服従させる前に 10 分間休息する幼虫を許可します。

3. 動作分析

  1. (22-25 ° C) の間の一貫性のある温度を維持動作ルーム (50 と 60 %rh) 湿度。
  2. 22 cm × 22 cm の正方形のペトリ皿に溶かしたアガロース (1.5%) の 150 mL の注入によって幼虫クロール メディアを準備します。1 つのペトリ皿アッセイ実験あたり 8-10 試験の各試験に注がれています。アガロースを固めるし、ペトリ皿で 1-2 時間動作の分析でそれらを使用する前に冷却を許可します。
    1. 準備中の 3 齢幼虫の 20 以上のシャーレ (図 1C) のセンターに移転します。そのふた付きシャーレをカバーします。CCD カメラの下で動作アリーナにペトリ皿を配置します。
      注: 実験によって動作の試金は通常実施 3-5 分。指導の手がかりを提供するアッセイで、臭気物質を使用する場合は、生成される臭気グラデーションまま約 5 分の1の安定を観察されています。長時間の試金は推奨されません。これらの時間のポイント内で幼虫脱水のためまたは長期 630 nm の赤色光の暴露からの有害な効果はみられていません。
  3. 電源 ON、850 nm 赤外 LED 光源のビデオで幼虫を視覚化します。幼虫の動きを記録する CCD カメラを起動します。
  4. ラズベリーパイ プロセッサ、プログラム赤色光刺激の適切なパターンを管理するための手順に関連付けられているソフトウェアを使用しています。
    注意: Python ベースの簡単なコマンドのセットは LED 光刺激 (構文のファイルを参照してください) のプログラム パターンに容易に適応することができます。

4. データ処理と解析

  1. Matlab のような任意の利用可能なプログラミング ソフトウェアに各試行の記録ビデオをインポートします。
  2. 時間の関数としての映画ですべての幼虫の XY 座標を取得します。追跡ソフトウェアの制限に基づいて、15-20 の 3 齢幼虫は 1 つのムービー1,8で追跡できます。
    注: 適切な条件 (構文のファイルを参照してください) に合わせて簡単に適応することができます単純な Matlab コード ('Tracklarva') のセットが提供されます。このプログラムは実験ですべての試験を組み合わせた、アッセイの全体の持続期間のためのすべての幼虫の XY 座標を出力 (次のコードの構文を参照してください)。代わりに、1 つは、研究者の自由に利用できるいくつかのオープン ソースのベースのプログラムを使用できます。例えばJAABA (http://jaaba.sourceforge.net/)12。
  3. 幼虫の軌道をプロットして幼虫の歩行の分析には、XY 座標が生成を使用します。
    1. 動作解析、シーケンス実行のターンを交互に個々 の幼虫軌跡をセグメントし、スピード、パスの曲率、針路などナビゲーション統計を使用します。
    2. 実行は、前方への動きの連続的な期間として定義されます。ターンでは、連続した実行を分離します。ターンは、軌道の向き角度に変更があったときにフラグが設定された > 45 ° (構文のファイルを参照してください)。
  4. 必要に応じて長さ、実行の方向、およびその他のパラメーターを実行、実行速度の平均値を計算します。
    注意: 幼虫の軌跡から '実行' と '停止' を抽出するための簡単な構文のセットは付属 (構文のファイルを参照してください)。単純な Matlab または Excel ベース関数を '長さの実行' '実行速度' の値を計算するための抽出されたデータに適用できる等。
  5. ± SEM. を意味それぞれの行動指標のデータを表す

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結果

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ORN 活性化の特異性を示すためには、正常に用いる 2 つの異なる ORN (ORN::7a ・ ORN::42a) の影響を判断する (Or7a または Or42a のいずれかを表現する ORNs) 活性化幼虫動作 (図 3)。個々 最近の研究と一致して幼虫 ORNs は機能的に異なる1,10,13、当社の代表的なデータを示します CsChrimson を表現する ORN::7a は、光によって刺激されたときがありますが、ランレングス コントロール動物と比較して大幅に減少。逆にとき CsChrimson を表現する ORN::42a は、光によって刺激されて、大幅な増加にあった制御動物 (図 3) と比較して実行の長さ。集合的なデータ分析から得られた幼虫トラック ~ ...

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ディスカッション

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ここでは、ショウジョウバエ幼虫嗅覚ニューロンの同時光活性化への応答挙動の測定では、方法について説明しました。前に説明したトラッキング方法1,幼虫8 ORNs をアクティブに異なる臭気配信技術を使用します。ただし、これらのメソッドは、特異性または ORN 活性化の時空間パターンのいずれかを制御できません。本手法は、ORN 活性化のより正確な制御ではなくニオイ刺激に対する光刺激を使用してこれらの赤字を克服します。

動作アリーナを構築に必要な材料は地元の金物屋で簡単に入手でき、アセンブリで最小限の労力が必要です。オプトジェネティクス モジュールを準備するために必要な電子機器も簡単に構築。説明する方法ここで赤いシフト チャネル ロドプシンをアクティブにする赤色光を使用 (CsChrimson)特定のニューロンで表されます。CCD カメラを使用し、ここで提供されているカスタム書かれたソフトウェアを用いて、対応する ORN 活性化に応えて結果...

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開示事項

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著者が明らかに何もありません。

謝辞

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この作品は、ネバダ大学リノ校からスタートアップ資金、国立衛生研究所許可番号 P20 GM103650 の下の日の出にサポートされていました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
幼虫の動きを捉えるビデオカメラ
CCDカメラ Edmund Optics106215
M52 to M55 フィルタースレッドアダプターEdmund Optics59-446
2" スクエアスレッドフィルターホルダー イメージングレンズ用 エドモンド・オプティクス59-445
RG-715, 2" Sq. ロングパスフィルターエドモンド・オプティクス46-066
<ストロング>エレクトロニクス オプトジェネティック セットアップ
ラズベリー パイ 2BRASPBERRY-PI.orgRPI2-MODB-V1.2
3チャンネル プログラマブル電源newegg.com9SIA3C62037092
8チャネルフォトカプラーリレーamazon.com6454319
630nmクアッドローLEDストリップライトenvironmentallights.com赤3528-450リール
850nmLEDストリップenvironmentallights.comwp-4000K-CC5050-60x2-kit
ソフトウェア 
MatlabMathworks Inc. (英語)
Ubuntu MATE v16.04Nubuntuhttps://github.com/yslo/nubuntu
その他のアイテム
プレキシガラス 黒 アクリルホームデポMC1184848bl
Fly food and other reagents
Nutrifly fly foodGenesee Scientific66-112
アガロース粉末ジェネシー・サイエンティフィック20-102
22cm X 22cm スクエア ペトリディッシュVWR Inc.25382-327
DMSOSigma-AldrichD2650
ショ糖Sigma-Aldrich84097
すべての網膜貫通型 Sigma-AldrichR2500
Flyies
UAS-IVS-CsChrimson ブルーミントンショウジョウバエストックセンター55134
Orco-Gal4ブルーミントンショウジョウバエストックセンター26818
Or42a-Gal4ブルーミントンショウジョウバエストックセンター9970
Or7a-Gal4ブルーミントンショウジョウバエストックセンター23907

参考文献

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  1. Mathew, D., et al. Functional diversity among sensory receptors in a Drosophila olfactory circuit. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 2134-2143 (2013).
  2. Ramaekers, A., et al. Glomerular maps without cellular redundancy at successive levels of the Drosophila larval olfactory circuit. Current biology : CB. 15, 982-992 (2005).
  3. Couto, A., Alenius, M., Dickson, B. Molecular, anatomical, and functional organization of the Drosophila olfactory system. Current biology : CB. 15, 1535-1547 (2005).
  4. Kreher, S. A., Kwon, J. Y., Carlson, J. R. The molecular basis of odor coding in the Drosophila larva. Neuron. 46, 445-456 (2005).
  5. Kreher, S. A., Mathew, D., Kim, J., Carlson, J. R. Translation of sensory input into behavioral output via an olfactory system. Neuron. 59, 110-124 (2008).
  6. Hallem, E. A., Carlson, J. R. Coding of odors by a receptor repertoire. Cell. 125, 143-160 (2006).
  7. Monte, P., et al. Characterization of the larval olfactory response in Drosophila and its genetic basis. Behav Genet. 19, 267-283 (1989).
  8. Gershow, M., et al. Controlling airborne cues to study small animal navigation. Nature methods. 9, 290-296 (2012).
  9. Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nature methods. 11, 338-346 (2014).
  10. Hernandez-Nunez, L., et al. Reverse-correlation analysis of navigation dynamics in Drosophila larva using optogenetics. eLife. 4, (2015).
  11. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
  12. Kabra, M., Robie, A. A., Rivera-Alba, M., Branson, S., Branson, K. JAABA: interactive machine learning for automatic annotation of animal behavior. Nature methods. 10, 64-67 (2013).
  13. Newquist, G., Novenschi, A., Kohler, D., Mathew, D. Differential contributions of Olfactory Receptor Neurons in a Drosophila olfactory circuit. eNeuro. 3, (2016).
  14. Schulze, A., et al. Dynamical feature extraction at the sensory periphery guides chemotaxis. eLife. 4, (2015).
  15. Tastekin, I., et al. Role of the Subesophageal Zone in Sensorimotor Control of Orientation in Drosophila Larva. Current Biology. 25, 1448-1460 (2015).
  16. Famiglietti, E. V., Kolb, H. Structural basis for ON-and OFF-center responses in retinal ganglion cells. Science. 194, 193-195 (1976).
  17. Luo, L., et al. Bidirectional thermotaxis in Caenorhabditis elegans is mediated by distinct sensorimotor strategies driven by the AFD thermosensory neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 2776-2781 (2014).
  18. Berck, M. E., et al. The wiring diagram of a glomerular olfactory system. eLife. 5, (2016).

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CsChrimson LED 3

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