大量の骨髄前駆細胞と新規セルソーティング戦略を使用してマウスの骨髄から樹状細胞前駆体の生成

サマリー

ここを識別し、分離 GM-CSF 駆動高速セルの並べ替えを使用して骨髄の細胞数が多いためメソッドを提供します。5 つの異なる集団 (一般的な骨髄前駆細胞、顆粒球/マクロファージ前駆細胞、単球、単球由来マクロファージおよび単球由来の Dc) は、Ly6C と CD115 の式に基づいて識別できます。

要約

単球由来樹状細胞の (研) 顆粒球マクロファージコロニー コロニー刺激因子 (GM-CSF) を使用してマウスの骨髄から生成された文化は、前に認めよりコンピューターが混在する最近認識されています。これらの文化は、日常的に、研も単球由来マクロファージ (moMac)、および単球なども、いくつかの発展途上の細胞に含まれています。このプロトコルの目的は、固有の機能をさらに調査する場合がありますので、彼らが発展するにつれてこれらの文化内にある多くの細胞型の分離・同定のため一貫した方法を提供することです。ここに示す並べ替えの戦略は、どちらとして表され、一過性細胞によって彼らは GM 主導 CSF のカルチャーで開発の Ly6C と CD115、式に基づいて 4 つの集団にまず細胞を分離します。これらの 4 つの集団には、一般的な骨髄前駆細胞または CMP (Ly6C-、CD115-)、顆粒球・ マクロファージ前駆細胞または GMP (Ly6C +、CD115-)、(Ly6C +、CD115 +)、単球と単球由来マクロファージ moMac (Ly6C-、CD115 +) が含まれます。CD11c、Ly6C-、CD115-人口内の 2 つの集団を区別するために並べ替え方法も追加されます: CMP (CD11c-) と研 (CD11c +)。最後に、2 つの集団が内 Ly6C-、CD115 + 人口 MHC クラス II 式のレベルに基づいて更に区別されます。MoMacs 単球由来 DC 前駆体 (べき乗剰余 moDP) 表現上の MHC クラス II MHC のクラス II の低レベルを表現します。このメソッドは、様々 な機能と発達的分析のための十分な数字でいくつかの発達の異なる集団の信頼性の高い分離できます。我々 は 1 つのようなの機能読み出し、認識分子パターン (PAMPs) 刺激に対するこれらの細胞型の差動応答を強調表示します。

概要

サイトカインによるマウス骨髄細胞培養顆粒球マクロファージコロニー コロニー刺激因子 (GM-CSF) 広くメソッドとして生成される単球由来樹状細胞 (研; として知られている炎症性 DC) 多数^{1、 2,3,4,5}。これらの細胞は、樹状細胞 (DC) 関数^6,7,8の研究の様々 な非常に便利されています。通常、これらのマウス骨髄細胞培養は、6-8 日、樹状細胞機能⁵研究されます。これらの文化くらいと考えられていたほとんど均質な差別化研の大半から成る。最近では、この 6-8 日間の培養期間の終わりに、ある差別化された単球由来マクロファージ (moMacs) ^9,10,11の大規模なサブセットと同様に、実際に多くの研が明らかになった。当社独自の調査はさらに研前駆体 (べき乗剰余 moDP)、単球などの以下の先進細胞の他のサブセットは、7 日間¹⁰後も低周波で文化に残ることを示すこれらの調査結果を拡張しています。したがって、このシステムによって生成された細胞を用いて樹状細胞 (DC) 機能の研究は感謝して以前よりも種類の細胞のより広範なコホートの応答を反映できます。

GM CSF 生成研分化^12,13,14の最終段階でこれらの細胞の機能に関するの研究から多く学びました。しかし、我々 はこれらの発達の経路について以下は細胞の^2,,1516と発揮する特定方法と時期のなどの機能大幅理解: 病原体関連分子に対する反応性パターン (PAMPs)、貪食能、抗原処理とプレゼンテーション¹³、および抗菌活性。従来 Flt3L 駆動 DC 前駆細胞および前駆物質の多数の隔離のためのプロトコルは、報告された¹⁷をなっています。Carboxyfluorescein サクシニミジルエステル (CFSE) を使用して、これらの異なる集団の分離が実現された-染色骨髄細胞 (分裂細胞を追跡) して 3 日間の Flt3L 文化。セルされ系統陽性細胞の枯渇、CD11c 式¹⁷に基づく前駆細胞および前駆体の個体群に分類します。GM 主導 CSF のカルチャーで DC の初期の前駆細胞を識別するために Leenen のグループによって別アプローチ CD31 と Ly6C ¹⁸に基づいてセルを並べ替えることでした。当初の目標は、前駆細胞と GM 主導 CSF 研の前駆体を得るための同様のメソッドを作成することでした。GM-CSF によって生成された特定の細胞の種類によるアプローチと戦略開発の序盤とそれ以降の段階で表現された分子の式に基づいてを並べ替えを適応しました。我々 は最終的にことを決定した Ly6C、CD115 (CSF 1 受容体)、CD11c ¹⁰型用のこれらのセルを区別するため最高のマーカー。

ここでは、GM-CSF による分化の経路に沿って開発のいくつかの異なる段階で細胞の分離法を提案する: 一般的な骨髄前駆細胞 (CMP)、顆粒球・ マクロファージ前駆細胞 (GMP)、単球、単球由来マクロファージ(MoMac) および単球由来 DC (研)。MoMac 人口さらに分離できますベース MHC クラス II 式のレベルで明らかに研前駆体人口 (べき乗剰余 moDP) ¹⁰。高速蛍光活性化セル (FACS) の Ly6C、CD115、および CD11c 表現に基づくこれらの 5 個体群を分離する戦略を並べ替えを利用します。そう、種緑化刺激への応答を明らかに機能アッセイにおけるこれらの細胞の検討を示します。

プロトコル

すべての動物の仕事は、ケアと国立衛生研究所の実験動物の使用のためのガイドに記載されている推奨事項に従ってオーバーン大学機関動物ケアおよび使用委員会によって承認されました。

1. 骨髄コレクションのための準備

1. ロズウェル パーク記念研究所 (RPMI) 1640 培 50 μ M 2-メルカプトエタノール、0.22 μ m フィルター真空フラスコ単位の先頭に、2 mM グルタミン 10% ウシ胎仔血清のソリューションを追加することによって 250 mL 完全なメディアを準備し、真空を適用します。
   注: 完全培地は 4 ° C で最大 2 ヶ月間保存できます。
2. 150 mL 滅菌 H₂O の 500 mL フラスコ 100% エタノールの 350 mL を混ぜて 70% エタノール溶液を準備します。
3. 4 ° C に設定する遠心
4. 70% エタノールではさみ、メス、鉗子を滅菌します。
5. 血清ピペットを使用して、3 つの 60 mm のペトリ皿に mL の完全培地 5 を追加します。
6. 血清ピペットを使用して、50 mL の円錐管に完全なメディアの 30 mL を追加します。

2. マウス骨髄細胞のコレクション

1. 安楽死に関する 2013 アメリカ獣医医学連合 (AVMA) ガイドラインの定める規則に従い CO₂麻酔による c57bl/6 マウスを安楽死させます。
2. 削除し、後ろ足をストリップします。
   1. 75% エタノール、後ろ足と胴体を飽和し、湾曲した組織用のハサミで股関節の周りの皮膚から浅いカットを作る。明らかに筋肉、足首に向かってヒップから皮膚を引っ張ってしっかりと鉗子を使用して。皮弁を削除するのにには、はさみを使用します。
   2. 大腿骨・股関節のすぐ上の骨を介して切断して後ろ足全体を削除します。
      注: 滅菌領域、に加えてエタノールきれいな切口を提供する援助、サンプルを汚染から髪を防止します。
   3. 足は、骨髄採取のための新しい場所に転送されます、もし完全なメディアの足が水没します。
3. 滅菌バイオ セーフティ キャビネットでの作業、事前に準備されたペトリ皿のいずれかに足を転送します。
4. だけをカットするはさみを使用、足首から下の慎重にできるだけ筋肉や弾性結合組織の多くを削除します。洗浄の骨を 2 番目の準備されたペトリ皿に転送します。
   注: すべての筋肉を削除する必要はありませんがあまりにも多くの残りの組織が難しく骨髄を洗い流す。
5. 大腿骨、膝および脛骨を区切ります。
   1. 鉗子を使用して、膝で脚を保持し、骨髄を探します。
      注: 骨髄は骨空洞は大腿骨と脛骨の端の方の上部の内側にかすかな赤い線として表示する必要があります。
      1. 3 つのカットを次のようにするはさみを使用して、します。
         1. 脛骨骨髄が最後に表示される場所のすぐ上をカットします。
         2. ひざの関節のすぐ下をカットします。
         3. ちょうど膝上カットします。
         4. 股関節を大腿骨に接続したまま、股関節のすぐ下をカットします。
      2. ペトリ皿に 3 つの断片を返し、もう一方の足でこの手順を繰り返します。
6. 大腿骨と脛骨から骨髄をフラッシュします。
   1. 23 G 針を用いて 50 mL のコニカル チューブとキャップから完全なメディアは、10 mL シリンジを入力します。
   2. 第 3 準備ペトリ皿上鉗子で骨を持ち、骨運河に針を挿入、を通じて (そのままの「プラグイン」、またはいくつかのクラスターとして現れることがあります) 細胞をフラッシュ メディアをプッシュします。骨ないより多くの色を見ることができるまで繰り返します。必要に応じて、メディアで注射器を補充します。
7. 骨端をつぶします。
   1. 2 番目のシャーレで鉗子を膝のキャップをしっかりし、注射器の先端で膝をマッシュ アップします。骨端が赤いされなくなるまで続けます。
8. 注射器を使用して、50 mL のチューブに 2 番目と 3 番目のシャーレからセルを転送します。上下に軽くピペッティングして塊を解散。泡を生成しないようにします。4 ° C で 250 x gで 10 分間遠心します。
9. 赤い血液細胞を溶解させます。
   1. 血清ピペットで上澄みを取り外して、フリックすることでペレットを取り除く部屋の温度で 1 分の ACK (アンモニウム塩化カリウム) 換散バッファーの 1 つの mL での孵化によって赤血球を溶解させます。
   2. 血清ピペットを使用して、40 mL の HBSS (ハンクス平衡塩溶液) バッファーを追加します。
10. 血清ピペットを使用して、フィルター処理セルが 70 μ m の細胞ストレーナー新しい 50 mL の円錐管に。4 ° C で 250 x gで 10 分間遠心します。
11. 血清ピペットを使用して、40 ml の完全なメディアの上澄みと洗浄のセルを削除します。4 ° C で 250 x gで 10 分間遠心します。
    注: この段階で系統の肯定的なリンパ球は FACS または磁気コラムの浄化によって削除できます。しかし、リンパ球は文化の長期的を保持されません。欠席しているほぼすべての肯定的な細胞の数が多いが前のヴィヴォ骨髄における Ly6C CD115 個体群の存在が、日ごとに 5 (図 2)。
12. 血清ピペットを使用して、上清を除去し、10 ng/ml の 1 x 10⁶セル/ml の密度で遺伝子組換えマウス GM-CSF の完全なメディアの骨髄細胞の培養します。
    注: 通常、4 x 10⁷総細胞が赤血球溶解後収穫できます。しかし、期待 2 x 10⁷として少し初心者のため、最大 5 x 10⁷セル経験豊富な収穫のため。
13. 血清ピペットを使用して、組織培養プレートにセルを転送し、, 5% CO₂の 37 ° C で。各シード 24 ウェル プレートを用いた場合の細胞懸濁液 2 mL でも。
14. すべての 48 時間は、メディアの半分を削除して置き換える新鮮な完全なメディアと GM-CSF 血清ピペットを使用します。
    注: 文化を 9 日に維持できます。しかし、時間をかけて組成を変更します。詳細については、セクション 3 を参照してください。

3 種の日を選択します。

1. セル人口の組成物は、時間をかけて変更、任意のセルの最大数を生成する日を選択します。
2. 1 x 10 の⁷セルごと GM-CSF の文化の 3、5、および 7 日後各人口の期待されるセル収量記事並べ替えのテーブル 1を参照してください。

4. 戦略の染色

1. セルの小さい因数を使用すると、コントロールのサンプルを準備できます。無染色調節、補正制御サンプルごとに、1 つだけの蛍光抗体で染色し、蛍光マイナス 1 を制御する全ての抗体は、そのチャンネルの非特異蛍光用のコントロールの 1 つを除いて追加。プライマリだけで、セカンダリだけで、間接的なラベリングを使用して含まれている場合、両方のプライマリとセカンダリです。
   注: フィコエ リスリン (PE)、アロフィコシアニン (APC) タグ抗体、最小限の出血をはっきりと分離併用可能です。ただし、螢光色素のオプションが限られている場合 CD115 は、Ly6C は非常に高いレベルで表現しながら比較的低レベルで表されます。したがって、明るい螢は反 CD115、望ましい、反 Ly6C 螢で出血を防ぐために選択されます。
2. 50 mL の円錐管に牛胎児血清の 3 ml チルド ダルベッコ リン酸緩衝生理食塩水 (DPBS) 97 mL を混合することによって 100 mL の FACS 洗浄バッファー (FWB) を準備し、氷浴中で配置。
3. やさしく、しかし徹底的にピペットの上下に緩く付着性のセルを除去するのに細胞にピペットを使用します。
4. 血清ピペットを使用して、50 mL の円錐管にセルを転送します。4 ° C で 250 x gで 10 分間遠心します。
   1. セル容量は、50 mL を超える場合、チューブの必要な数のセルに転送し、染色の段階で結合します。
5. 優しく、上澄みを離れて注ぎ、血清ピペットと FWB の 30 mL を追加することによって小球形にされた細胞を洗浄します。4 ° C 10 分で 250 × gで遠心分離し、洗浄を繰り返します。
   注: 高い細胞死が予想される場合細胞による洗浄が可能で FWB 0.5% 牛胎児血清 (FCS) と低い。これは細胞の凝集を防ぐ。
6. 中断し、抗体の製造元の指示に従って細胞を染色します。
   1. FWB の 1 mL に 5 x 10 の⁷セルの中断および反 Ly6C とアンチ CD115 (研究員の選択) の fluorophores が付いている分類の各 2 μ を追加します。さらに (両方とも Ly6C - と CD115-) 研から CMP を区別する抗 CD11c 抗体の 2 μ g を追加 (CMP は CD11c^-; 研は CD11c⁺)。氷の上で 30 分間インキュベートします。
      注:図 3は、Ly6C PE と CD115 APC を使用して生成されました。
7. 血清ピペットを使用すると、250 × g 10 分のための 4 ° c で、FWB と遠心分離機の 10 mL を追加します。
8. 優しく、上澄みを離れて注ぎ、血清ピペットと FWB の 30 mL を追加することによって小球形にされた細胞を洗浄します。4 ° C 10 分で 250 × gで遠心分離し、洗浄を繰り返します。
9. 細胞を中断する前に徹底的にペレットを取り除くためチューブをフリックします。血清ピペットを使用して、1 x 10⁷セル/FWB、mL でセルを中断し、35 μ m の細胞のフィルターをフィルター処理します。血清ピペットを使用してポリプロピレン チューブにフィルターが適用されたセルを転送し、ソートする準備ができるまで氷の場所します。
   注: ポリプロピレンを使用できない場合は、蛋白質のコーティング (脱脂乾燥したミルクまたは FCS) ポリスチレン管は結合を減らすために使用できます。

5. 設定コントロールのサンプルに基づいてゲート

注: 高速流れの圧力による細胞破壊を防ぐためには、細胞選別の 100-130 μ m ノズルを使用します。

1. 無染色のコントロールを実行 (手順 4.1 参照)、セルソーターを小さな破片 (低前方散乱; を除外するゲートを適用し、FSC) と非常にきめ細かい (ハイサイド散布。SSC) 粒子。
   1. 後の段階の (単球、moMac/MoDP 研) を分析するには、だけより大きいセル (高 FSC) を含めるためのゲートを適用します。
   2. 生存の汚れを使用している場合 (図 1に例を示します) ステンド グラス、非実行可能なイベントを除外するこれらを使用します。
2. 、セルソーターを単一蛍光コントロールのサンプルを実行し、必要に応じて補正を調整します。
3. 多重ラベル サンプルのサンプルを実行します。4 つの異なる集団を観察: Ly6C + CD115-(適性)、Ly6C + CD115 + (球)、Ly6C-CD115 + べき乗剰余 (moMacs/moDP) と Ly6C-CD115 - (Cmp/moDCs)。4 つの主要な人口のそれぞれを分離するゲートを適用します。
   注: Cmp と研 Ly6C CD115 表現型を共有します。しかし、彼らは CD11c 表現に基づいて区別することができる: MoDCs は CD11c 表現に対し、CMP は CD11c を欠いています。

6. 隔離集団のコレクション

1. 採血管準備の少なくとも 20% を達成するために十分な FCS を追加最終濃度がいっぱい。たとえば、5 mL の管を使用している場合、並べ替えの前に FCS の 1 mL を追加し、5 mL の容量に達したときにチューブを削除します。
2. 膜の売り上げ高および抗体の吸収を防ぐためには、並べ替えで 4 ° c (混合および並べ替え) すべてのサンプルを保持します。
   1. できない場合は、可能な限り氷に並べ替えられ、必要に応じてソーターに因数を転送するセルを含むチューブを保ちます。
   2. さらに、氷の 20-30 分ごとに並べ替えられたサンプルを転送します。
3. 必要なセル数が収集された後は、新しい円錐管にセルを転送するのに血清ピペットを使用します。4 ° C で 250 x gで 10 分間遠心します。
   1. 各収集された人口からの小さい因数の並べ替え後解析と純度を確認します。
4. 上澄みを除去、FWB 10 mL、4 ° C で 250 x gで 10 分繰り返し、合計 2 つの洗浄の間遠心で中断します。
   注: それはペレットを外れなしすべての上澄みを除去することは困難することができます。真空ラインにピペット チップを取り付けると、除去に役立ちます。このオプションが利用できない場合は、ペレットの解離の場合新鮮なチューブに上清を収集することをお勧めします。
5. 2 番目の洗浄後、上清を削除します。
6. ユーザーの実験的なデザインは、セルは再培養する順序を決定する手順 2.12-2.14。それ以外の場合、セルは、即時の分析に使用される場合、は、目的のプロトコルに従ってセルを準備します。
   注: 機能分析の典型的な例は、図 4に含まれます。

結果

可能であれば、実行可能な細胞として分析に利用できる多くのチャンネルを維持するために定期的にに基づいて選ばれた前方および側面の散布図、(典型的なゲート ドット プロット図 1 aのすべてに適用される) 非常に小さいと非常に細かいイベントは除きます。このゲートの戦略はを確実に死んだ細胞を除外されている場合を決定するには、我々 は 7 アミノ酸アクチノマイシン D (7 AAD) (図 1 b) と汚れます。7AAD 汚れの膜透過性による死者と死細胞の DNA と実行可能なセルは除外。典型的な FSC/SSC ゲートが骨から新鮮な隔離されたセルに適用されたとき、GM-CSF 培養骨髄細胞を収穫後 (PH) と 1、3、および 5 の博士セルをすぐに分析され PH すぐに行ったの 7 AAD 陽性細胞の約 10% を持っていた骨髄 (図 1、収穫後)。死んだ細胞のような割合も日 1 (12%) と (<...

ディスカッション

このプロトコルは細胞機能体外、または注入の生体内の生化学的アッセイを含む分析のいくつかのタイプの十分な数の GM 主導 CSF 前駆細胞および前駆細胞型の分離を促進します。このメソッドより一般的に信頼性の高い分離とこの経路のそれらの分化細胞の種類と同様に、開発の早い段階で細胞の同定を可能にする単球由来樹状細胞の開発の分野で重要な進歩を表します先行研究で分離されました。

前駆細胞と骨髄体外から生成の前駆物質の分離以前のプロトコルは、増殖前駆細胞¹⁷を識別する CFSE 染色や^{18 骨髄系細胞のマーカーとして CD31 と Ly6C 染色上に依存しています。}.君主によって記述されたプロトコルを汚す CFSE は Flt3L 駆動 DC 前駆細胞と前駆体¹⁷の世代で使用するために設計されました。GM-CSF 文化システムでこのアプローチを試みた、2 つの主要な問題が発生しました。CFSE やや...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
RPMI 1640	Corning	15-040-CV
Fetal Calf Serum (FCS)	HyClone	SV30014.04	は完全培地を補完し、FWB
GlutaMAX	Gibco	35050	完全培地を補完
2-メルカプトエタノール (2-ME)	MP バイオメディカル	190242	完全培地を補完します
75 mM 真空フィルター	Thermo Scientific	156-4045	完全なメディアを滅菌するには
ACK 溶解バッファー	ロンザ	10-548E	赤血球を溶解
HBSS バッファー	コーニング	21-020-CM	赤血球溶解後に白血球を救助する
リン酸バッファー生理食塩水 (PBS)、ダルベッコの	ロンザ	17-512F	はエンドトキシンフリーでなければなりません。C
35 &マイクロ;m細胞	フィルターFalcon	352235	サイトメーターを通過する前に凝集塊をバラ
GM-CSF	Biosource	PMC2011	使用可能濃度 10 ng/mL
組織培養処理プレート	VWR	10062-896	採取後の骨髄細胞用
Anti-Ly6C, Clone HK1.4	Biolegend	128018
Anti-CD115, Clone AFS98	Tonbo Bioscience	20-1152-U100
Anti-CD11c, Clone HL3	BD Biosciences	557400	CMPとMoDCを区別するには
MoFlo XPD フローサイトメーター ベ	ックマン・コールター	ML99030
BD Accuri C6	BD Biosciences	660517
100% エタノール	Pharmco-Aaper	111000200CSPP
60 mm ペトリ皿	Corning, Inc	353002
50 mL コニカルチューブ	VWR	21008-242
C57BL/6 マウス	ジャクソン研究所	000664	女性; 生後10-20週
バイオセーフティフード	Thermo Scientific	8354-30-0011
10 mL シリンジ	BD Biosciences 301604
23 G ニードル	BD Biosciences	305145
Centrifuge 5810 エ	ッペンドルフ	22625501
FlowJo Software v10	BD Biosciences	Version 10	flowjo.com