高スループットと小さな抑制 RNA スクリーニングはより急速に化学角膜上皮傷害の分子機構を解明するために助けることができる重要なツールです。ここで、開発と露出モデルとフッ化水素とクロルピクリンによる角膜上皮障害の高スループット スクリーニング法の妥当性を提案します。
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この記事について
サマリー
要約
化学物質を急速に重要な組織の損傷を与える可能性があるために、毒性物質による眼障害は真眼緊急です。毒性物質による角膜損傷の治療法は、これらの傷害を治療するために特定の治療法が存在しないため、一般に支持。トリートメントや露出の世話をする治療薬を開発する努力をこれらの傷害の分子・細胞メカニズムを理解する重要なことです。提案する高スループット小さな抑制 RNA (siRNA) スクリーニングの利用がより急速に化学角膜上皮傷害の分子機構を明らかにすることができる重要なツールをすることができます。siRNA は、二本鎖 RNA 分子長 19-25 のヌクレオチドと転写後サイレンシング mRNA を低下させる経路を利用、siRNA に相同性があります。特定の遺伝子の表現の結果の減少は、細胞に対して、毒性物質、遺伝子の機能を確認するために毒性物質の露出した細胞で研究できます。開発と検証暴露モデルの in vitroのハイスループットス クリーニング (HTS) フッ化水素 (HF) とクロルピクリン (CP) による眼損傷のための方法は、この記事で掲載されています。我々 はこれらの 2 つの有効成分を選択、私たちの方法は、毒性物質の曝露プロトコルに変更を加える他の有効成分の研究に適用されます。SV40 large T 抗原 SV40 HCEC は研究に選ばれたひと角膜上皮細胞ラインを不死化。細胞生存率及び il-8 産生は、スクリーニングのプロトコルのエンドポイントとして選択されました。毒性物質の暴露の開発に関連付けられているいくつかの課題、高温超伝導の研究に適した培養技術が表示されます。これらの毒性の高温超伝導モデルの確立化学眼傷害のための潜在的な治療のメカニズムやけがの画面を理解するそれ以上の調査が可能です。
概要
化学物質を急速に重要な組織の損傷を与える可能性があるために、毒性物質による眼障害は真眼緊急です。残念ながら、毒性物質による角膜損傷の治療法は、これらの傷害を治療するために特定の治療法が存在しないため、一般に支持のみです。現在の治療戦略は非特定、潤滑剤、抗生物質などの局所治療が主に含まれています、cycloplegics 続いて抗炎症薬 (例えばステロイド) 一度角膜1 を epithelialized、再 ,2。最高現在治療オプションは、にもかかわらず長期予後不良進歩的な角膜混濁と血管新生の2,の3のためであります。
動物モデルは、化学的毒性を調査し、傷害のメカニズムを理解する伝統的に使用されています。ただし、動物実験は時間がかかり、高価です。動物テストを削減する取り組みもあります。たとえば、欧州連合 REACH 規制 (EC 1907/2006 年) 動物実験を減らすため規定しています。規定には、動物テストおよび動物に提案するテストを実行する前に欧州化学物質庁から承認を得ることを避けるために、企業がデータを共有する要件が含まれます。リーチの規定の下で動物実験は最後の手段にする必要があります。また、動物で化粧品のテスト廃止欧州....
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プロトコル
1. セルの文化の維持
- 成長セル行 SV40 HCEC 37 ° C、5% CO215% ウシ胎児血清 (FBS)、DMEM F 12 の 90% 湿度 1 %l-グルタミン、10 μ g/L 上皮成長因子 (EGF)、5 mg/L インスリン。
- 密度が決して文化保守中に 80% を超えていることを確認する細胞株 (播種) によってすべての 3 〜 4 日の通路します。
- 37 ° C で 8 分以上の剥離液 (14 mL すべて 150 cm2フラスコ) と潜伏を使用してフラスコから細胞をデタッチします。
- 細胞培養液の等量と剥離ソリューションを中和し、160 x g で 7 分間の遠心分離で 50 mL の円錐管の細胞のペレットします。
- 再中 (すべて 150 cm2フラスコ 20 mL) 細胞ペレットを中断します。
- 自動化されたハンドヘルド携帯カウンターと種子が 3 〜 4 日の 80% の confluency を超えることがなく成長することができます密度で新しいフラスコでセルをカウントします。
2. プレート細胞実験のため
- その密度を確保するため位相差光顕微鏡による SV40 HCECs のフラスコは 80% 以上と一般的な細胞の健康を評価するために以下を....
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結果
露光法の開発
私たちは洗練され、ひと角膜上皮細胞線 SV40 HCEC 高温超伝導の研究で使用するための適合性を評価します。SV40 HCEC SV 40 大 T 抗原を用いた不死化された層から発掘 Pal23からの贈り物だった.簡潔にここに提示する露出方法論開発の検討も多くの変数があった、だから、信じて我々 の調査結果のいくつかのサンプルはより広範に適用される可能性がありますだけに複数の有害物質が表示されます。
スパイクまたは媒体の交換によって毒性物質の暴露
我々 は当初媒体最終曝露濃度を達成するために 96 ウ.......
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ディスカッション
ここ HF および CP の傷害の研究のためのモデルをスクリーニングする高スループット角膜上皮細胞の開発に、私たちの方法と結果を述べる。HF 傷害の主な siRNA 画面から結果を提案する.TIC の傷害の研究のための高温超伝導モデルの開発に多くの課題があった。我々 は細胞培養モデルの HF、HFA または CP の研究に関連する文献で見つけることができる方法は、少しの助けのだった。フッ化物イオンのほとんどの in vitro研究口腔細胞と (例についてを参照してください28,29) HF や HFA ではなく、フッ化ナトリウムを利用します。Pesonenらによる気道上皮細胞の体外露出 CP へのいくつかの方法論を公開されています。30します。 最終的には、我々 の特定のメソッドに見つかりません HF、HFA または CP の高温超伝導研究と課題と必要な高温超伝導体開発でこれらの有効成分の研究に関連した変数の大半に関連文.......
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開示事項
著者が明らかに何もありません。
免責事項: この記事の見解は、著者の軍隊の部門、国防省、または米国政府の公式な方針を反映していません。この研究は NIH/NIAID と USAMRICD、間の省庁間の契約によってサポートされ、一部オークによって管理される大学院の研究参加プログラムで米国陸軍医療研究所の化学防衛する予定でリッジ米国エネルギー省と USAMRMC 間の省庁間協定により教育研究所。
謝辞
この研究によって、国家機関の健康対抗プログラム省庁間契約 # AOD13015-001 に対応しました。我々 は彼らの努力と映像制作に関する専門知識のステファニー Froberg とピーター ・ ハーストを感謝したいです。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| Bravo リキッドハンドリングプラットフォーム | Agilentまたは同等の | G5409A | |
| Bravo プレートシェイカー | Agilentまたは同等の | オプション 159 | |
| Bravo 96LT 使い捨てチップヘッド | Agilentまたは同等の | もの オプション 178 | 96チャンネル大型チップピペッティングヘッドユニット |
| Bravo 96ST 使い捨てチップヘッド | Agilentまたは同等の | オプション 177 | 96チャンネル小型チップピペッティングヘッドユニット |
| Bravo 384ST ディスポーザブルチップヘッド | Agilentまたは同等品 | オプション 179 | 384チャンネル スモールチップピペッティングヘッドユニット |
| Bravo 96 250 μL 滅菌バリアチップ | Agilent または同等品 | 19477-022 | |
| Bravo 384 30 μL 滅菌バリアチップ | Agilentまたは同等品 | 19133-212 | |
| Bravo 384 70 μL 滅菌バリアチップ | Agilentまたは同等の | もの 19133-212 | |
| EnSpire マルチモードプレートリーダー | Perkin Elmer または同等の | もの 2300-0000 | AlphaLISA アッセイ検出器 高出力レーザー励起 |
| IL-8 (ヒト) AlphaLISA 検出キット | Perkin Elmer または同等の | AL224F | ノーウォッシュビーズベースのアッセイ |
| ProxiPlate-384 Plus white 384-shallow well microplates | Perkin Elmer または同等の | 6008359 | |
| Lipofectamine RNAiMAX | Invitrogen または同等の | 13778500 | トランスフェクション試薬 |
| Opti-MEM 1 Reduced Serum Medium | Invitrogen または同等の | 31985070 | |
| TrypLE Express | Gibco または同等の | 12605010 | 細胞剥離ソリューション |
| IncuCyte Zoom | Essen Instruments または同等の | ESSEN BIOSCI 4473 | インキュベーター付き自動顕微鏡 |
| クロロピクリン | トリニティ 製造または同等の | N/A | 急性毒性および刺激性 |
| DMEM-F12 細胞培養培地 | Invitrogen または同等の | 11330-057 | HEPES を含む |
| ウシ胎児血清 | Invitrogen または同等 | 品 1891471 | |
| ヒト上皮成長因子 (細胞培養グレード) | Invitrogen または同等品 | E9644-.2MG | |
| 組換えヒトインスリン (細胞培養グレード) | Invitrogen または同等 | 品 12585-014 | |
| ペニシリン-ストレプトマイシン溶液 (細胞培養グレード) | Invitrogen または同等品 | 15140122 | |
| ヒドロコルチゾン(細胞培養グレード) | シグマまたは同等の | H0888-10G | |
| グルコース (細胞培養グレード) | シグマまたは同等の | G7021 | |
| PBS (細胞培養グレード) | Sigmaまたは同等の | P5493 | |
| siRNA | Dharmaconまたは同等の | 各種 | |
| チアゾリルブルーテトラゾリウムブロマイド | Sigmaまたは同等の | M5655 | MTTアッセイ基質 |
| siRNA | バッファーThermoまたは同等の | B002000 | |
| 96ウェル細胞培養プレート | コーニングまたは同等の | CLS3595 | |
| T150細胞培養フラスコ | コーニングまたは同等の | CLS430825 | |
| BSL-2細胞培養フード | Nuaireまたは同等の | NU-540 | |
| 300 mL ロボットリザーバー | サーモまたは同等の | 12-565-572 | |
| 96個のバッフル付き自動化リザーバー | サーモまたは同等の | もの 1064-15-8 | |
| 500 mL 滅菌使い捨て保存ボトル | コーニングまたは同等の | CLS430282 | |
| マイクロプレートヒートシーラー | サーモまたは同等の | AB-1443A | |
| マイクロプレートヒートシールホイル | サーモまたは同等の | AB-0475 | |
| カルダモニン | トクリスまたは同等の | 2509 | 抗炎症剤、ポジティブコントロールSKF |
| 86002 として使用。 | Tocris または同等の | 2008 | 抗炎症剤、ポジティブコントロールとして使用 |
| DMSO | Sigma または同等の | D8418 | |
| 48% フッ化水素酸 | Sigma または同等の | 339261 腐食性および急性毒性 | |
| 1000 μL シングルチャンネルピペッター | レイニンまたは同等 | 17014382 | |
| 200 μL シングルチャンネルピペッター | レイニンまたは同等 | 17014391 | |
| 20 μL シングルチャンネルピペッター | レイニンまたは同等 | 17014392 | |
| 1000 μL 12チャンネルピペッター | レイニンまたは同等 | 品 17014497 | |
| 200 μL 12チャンネルピペッター | レイニンまたは同等品 | 17013810 | |
| 20 μL 12チャンネルピペッター | レイニンまたは同等品 | 17013808 | |
| ピペッターチップ 1000 μL | レイニンまたは同等 | 品 17002920 | |
| ピペッターチップ 200 μL | レイニンまたは同等の | 17014294 | |
| ピペッターチップ20 μL | レイニンまたは同等 | 品 | |
| ジェームズタウン メタルプロダクツ | |||
| 384ウェルサンプル保存プレート | サーモまたは同等の | 262261 | |
| 塩化ナトリウム | シグマまたは同等の | S6191 | |
| 50 mL コニカルチューブ | サーモまたは同等品 | 14-959-49A | |
| セロロジカルピペット 50mL | コーニングまたは同等品 | 07-200-576 | |
| 血清ピペット 25 mL | コーニングまたは同等品 | 07-200-575 | |
| 血清ピペット 10 mL | コーニングまたは同等品 | 07-200-574 | |
| 血清ピペット 5 mL | コーニングまたは同等品 | 07-200-573 | |
| SV40-HCEC 不死化ヒト角膜上皮細胞 | N/A | N/A | これらの細胞は市販されていませんが、記事「 |
| Sceptor Handheld Automated Cell Counter | Millipore」または同等の | PHCC20060 | |
| GeneTitan Multi-Channel (MC) Instrument | Affymetrix または同等の | 00-0372 | |
| Affymetrix 24- and 96-array plates | Affymetrix または同等の Affymetrix または同等の Afymetrix 901257 | ; 901434 | |
| Draegger の記事で引用されている研究者から入手できます。チューブ HF | Draegerまたは同等の | 8103251 | |
| Draegger チューブ CP | Draeger または同等の | 8103421 | |
| Draegger ポンプ | Draeger または同等の | 6400000 | |
| クリア プレート シール | Resesarch Products International または同等の | 202502 | |
| 試薬リザーバー | VistaLab Technologies または同等の | 3054-1000 | |
| Xlfit | IDBSまたは同等の | N/A | Excelアドインを自動カーブフィットに使用 |
参考文献
- Randleman, B. Drugs, Diseases and Procedures. Hampton, R. , Medscape. (2011).
- Fish, R., Davidson, R. S. Management of ocular thermal and chemical injuries, including amniotic membrane therapy. Current Opinion in Ophthalmology. 21 (4), 317-321 (2010).
- Wang, X.
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再版と許可
