クロルピクリンとフッ化水素誘起角膜上皮細胞傷害のための高スループット SiRNA スクリーニング

サマリー

高スループットと小さな抑制 RNA スクリーニングはより急速に化学角膜上皮傷害の分子機構を解明するために助けることができる重要なツールです。ここで、開発と露出モデルとフッ化水素とクロルピクリンによる角膜上皮障害の高スループット スクリーニング法の妥当性を提案します。

要約

化学物質を急速に重要な組織の損傷を与える可能性があるために、毒性物質による眼障害は真眼緊急です。毒性物質による角膜損傷の治療法は、これらの傷害を治療するために特定の治療法が存在しないため、一般に支持。トリートメントや露出の世話をする治療薬を開発する努力をこれらの傷害の分子・細胞メカニズムを理解する重要なことです。提案する高スループット小さな抑制 RNA (siRNA) スクリーニングの利用がより急速に化学角膜上皮傷害の分子機構を明らかにすることができる重要なツールをすることができます。siRNA は、二本鎖 RNA 分子長 19-25 のヌクレオチドと転写後サイレンシング mRNA を低下させる経路を利用、siRNA に相同性があります。特定の遺伝子の表現の結果の減少は、細胞に対して、毒性物質、遺伝子の機能を確認するために毒性物質の露出した細胞で研究できます。開発と検証暴露モデルの in vitroのハイスループットス クリーニング (HTS) フッ化水素 (HF) とクロルピクリン (CP) による眼損傷のための方法は、この記事で掲載されています。我々 はこれらの 2 つの有効成分を選択、私たちの方法は、毒性物質の曝露プロトコルに変更を加える他の有効成分の研究に適用されます。SV40 large T 抗原 SV40 HCEC は研究に選ばれたひと角膜上皮細胞ラインを不死化。細胞生存率及び il-8 産生は、スクリーニングのプロトコルのエンドポイントとして選択されました。毒性物質の暴露の開発に関連付けられているいくつかの課題、高温超伝導の研究に適した培養技術が表示されます。これらの毒性の高温超伝導モデルの確立化学眼傷害のための潜在的な治療のメカニズムやけがの画面を理解するそれ以上の調査が可能です。

概要

化学物質を急速に重要な組織の損傷を与える可能性があるために、毒性物質による眼障害は真眼緊急です。残念ながら、毒性物質による角膜損傷の治療法は、これらの傷害を治療するために特定の治療法が存在しないため、一般に支持のみです。現在の治療戦略は非特定、潤滑剤、抗生物質などの局所治療が主に含まれています、cycloplegics 続いて抗炎症薬 (例えばステロイド) 一度角膜^{1 を epithelialized、再 ,2}。最高現在治療オプションは、にもかかわらず長期予後不良進歩的な角膜混濁と血管新生の^2,の³のためであります。

動物モデルは、化学的毒性を調査し、傷害のメカニズムを理解する伝統的に使用されています。ただし、動物実験は時間がかかり、高価です。動物テストを削減する取り組みもあります。たとえば、欧州連合 REACH 規制 (EC 1907/2006 年) 動物実験を減らすため規定しています。規定には、動物テストおよび動物に提案するテストを実行する前に欧州化学物質庁から承認を得ることを避けるために、企業がデータを共有する要件が含まれます。リーチの規定の下で動物実験は最後の手段にする必要があります。また、動物で化粧品のテスト廃止欧州の化粧品規制 (EC 1223/2009) があります。3 r の原則に導かれるとき、動物実験が行われる (絞り込み、削減、および交換)、非動物の代わりを使用して、慈悲深い動物の研究を行って、使用する動物の数を減らすためのフレームワークを提供します。可能な限り。これらの理由から、毒物学の分野は、毒性の分子メカニズムに洞察力を提供することができますしより高いスループット⁴で行うことができますの in vitroアッセイを採用を求めています。これは機能的な毒物学アプローチの化学だけではなく機能別に毒性が定義されています。さらに、機能的な一歩を踏み出したトキシコゲノミクスを求める特定の遺伝子毒性⁵の効果を果たす役割を理解します。SiRNA 技術の応用、毒性物質を分子・細胞応答の遺伝子の機能を調べる画面を高スループットで行うことができます。siRNA は、長いポスト転写遺伝子サイレンシング経路すべて哺乳類セル⁶に存在する活用 19-25 のヌクレオチドは、二本鎖 RNA の分子です。これらは総合的作られて、特定の遺伝子をターゲットに設計されています。SiRNA は処理セルに導入されたとき、ガイド鎖一本鎖 RNA によるサイレンシング複合体 (RISC) が読み込まれます。SiRNA は、mRNA 分子の相補的な領域に RISC を指示し、RISC の mRNA の低下します。これは特定の遺伝子の発現の減少の結果します。特定の遺伝子の表現の結果の減少は、細胞に対して、毒性物質、遺伝子の機能を確認するために毒性物質の露出した細胞で研究できます。このようなアプローチは、リシン感受性のメカニズムと CYP1A1^7,8の AHR 依存型誘導をさらに理解するために使用されています。

化学テロのリスク評価 (CTRA) リストおよび有毒工業化学物質 (TIC) のリストは、その毒性やテロ、戦争、または産業事故イベント⁹にリリースされる可能性に基づいて選択化学物質を明細が。SiRNA のハイスループットス クリーニング (HTS) トキシコゲノミクスでハイリスクのテロ事件で使用する識別されている CTRA リスト毒性の研究アプローチを適用しています。伝統的な毒性化学物質が生物に悪影響を理解しようとしています。しかし、我々 は通知におそらく、治療薬や治療法の開発を目的として傷害のメカニズムを理解しさらに願望を持っている分子治療の開発の対象にすることができますを発見します。いくつかの方法でこの努力は、siRNA スクリーニングおよび薬剤の発見プロセス¹⁰に基づくセルの試金の使用に類似した考慮されるかもしれない。主な違いは、我々 のアプローチでそれはやや毒性物質曝露の治療のため治療価値の高い特異なターゲットがあるだろうと考えにくいに対し、その創は通常治療探索対象が単数形を求めているでしょう。我々 は、毒性物質の露出のための効果的な治療法のパラダイムが高い治療価値を達成するために多面的なアプローチを必要とし、トキシコゲノミクス解析を用いたデータは極めて効果的な治療パラダイムを通知ことがあることを予測します。

ベンチトップ オートメーションは、医薬品やバイオ テクノロジー産業の外の所に高スループット方法論をもたらします。当研究所での in vitroの研究は歴史的に低スループット^11,12,13である伝統的なアッセイをされています。過去数年間で私たちの研究室は、siRNA スクリーニングを実行する卓上型ロボットの使用に移行しています。ここで、眼細胞モデルの精緻化と体外の開発露出の手法を提示水素フッ化物 (HF) とクロルピクリン (CP) siRNA スクリーニングに適した。私たちの目標は、これらの毒性に対して細胞傷害を調節する分子を識別することです。我々 が選択した siRNA ライブラリのターゲットには、G タンパク質共役型受容体、蛋白質キナーゼ、プロテアーゼ、ホスファターゼ、イオン チャネル、および他の潜在的 druggable ターゲットが含まれます。HF および CP は蒸気暴露^9,14を介して眼傷害の最大のリスクを提示する研究の産業事故の ToxNet レポート CTRA リスト エージェントを相互参照によって選ばれました。CP (化学式 Cl₃CNO₂、CAS 番号 76-06-2) もともと、第一次世界大戦¹⁵で催涙ガスとして使用されました。それは現在として殺虫剤、殺菌剤、殺¹⁶農業燻蒸と関数として使用されます。フッ化水素 (HF) は、石油精製所、¹⁷有機化合物の電気化学的フッ素化アルキル化を含むプロセスで使用されます。HF (化学式 HF、CAS 番号 62778-11-4) ガスであるが、形式で水溶液はフッ化水素酸 (HFA、CAS 番号 7664-39-3)。したがって、我々 は我々 の細胞で HFA を使用する選出露出モデル。SV40 large T 抗原 SV40 HCEC は研究に選ばれたひと角膜上皮細胞ラインを不死化。細胞死および炎症性応答の細胞傷害に関与している目標を反映する必要がありますので、細胞生存率及び炎症性マーカー IL 8 はエンドポイントとして選択されました。具体的には、ターゲットは、毒性物質の露出の保護の役割を果たすことが、細胞死および炎症性サイトカイン産生増やす必要があります対象式は、siRNA によって阻害されるとき。否定的な役割を果たす目標の真反対のでしょう。また、露出、および細胞死経路への介入が向上臨床^2,18後角膜病理学の役割を果たすに慢性的な炎症が表示されます。

プロトコル

1. セルの文化の維持

1. 成長セル行 SV40 HCEC 37 ° C、5% CO₂15% ウシ胎児血清 (FBS)、DMEM F 12 の 90% 湿度 1 %l-グルタミン、10 μ g/L 上皮成長因子 (EGF)、5 mg/L インスリン。
2. 密度が決して文化保守中に 80% を超えていることを確認する細胞株 (播種) によってすべての 3 〜 4 日の通路します。
3. 37 ° C で 8 分以上の剥離液 (14 mL すべて 150 cm²フラスコ) と潜伏を使用してフラスコから細胞をデタッチします。
4. 細胞培養液の等量と剥離ソリューションを中和し、160 x g で 7 分間の遠心分離で 50 mL の円錐管の細胞のペレットします。
5. 再中 (すべて 150 cm²フラスコ 20 mL) 細胞ペレットを中断します。
6. 自動化されたハンドヘルド携帯カウンターと種子が 3 〜 4 日の 80% の confluency を超えることがなく成長することができます密度で新しいフラスコでセルをカウントします。

2. プレート細胞実験のため

1. その密度を確保するため位相差光顕微鏡による SV40 HCECs のフラスコは 80% 以上と一般的な細胞の健康を評価するために以下を確認してください。
2. デタッチし、ペレット、再懸濁します、細胞文化維持の手順 1.3 〜 1.6 でフラスコから SV40 HCECs を数えます。SV40 HCEC 培 0.5 μ g/mL ヒドロコルチゾン (HCORT 中) を使って、細胞を再懸濁します。
3. 使い捨ての中瓶で中に予め温めておいた HCORT 17,857 細胞/ml の SV40 HCECs の懸濁液を準備します。
   1. シード処理する板の数の細胞懸濁液の十分な量を準備します。
   2. 14 x 96 ウェル プレートを検討する siRNA ライブラリ磯野のセルの最小値をシードします。
4. 均等にセルを中断、細胞懸濁液の十分な量を注ぎ、自動液体ハンドラーの軌道シェーカー巣に貯蔵所および格納セルめっき中にプレートを温暖化、37 ° C の細胞懸濁液の入ったボトルにボトルを旋回します。プロセス。
5. 自動液体ハンドラーを使用して、70 μ L/ウェルの 96 ウェル プレート培地で 1000 細胞/ウェル (5000 セル/cm²) の密度でプレートにセルを追加します。50 μ L/s を使用して、すべてのステップのピペッティング速度。
   1. シード処理中に常に 100 rpm で軌道のシェーカーを実行します。
   2. (140 μ L ミックス ボリューム) 回 3 細胞懸濁液をミックス自動液体ハンドラーを使用します。
   3. 140 μ L の細胞懸濁液を吸引し、2 つの細胞培養プレートの各ウェルに 70 μ L を分配します。
   4. 2.5.3 と 2.5.4 の手順を繰り返して、すべてのプレートは、細胞にシードされています。
   5. シード処理中に必要に応じて、細胞懸濁液の貯蔵所を補充します。
6. プレートは、シードされている後自動液体ハンドラーから削除し、細胞文化のインキュベーターに転送する前に室温で 30 分間インキュベートします。
7. 各プレートの各ウェルの細胞密度を評価する細胞文化のインキュベーターに収容されて、任意の板を 15% 22% の合流からではないインテリアの井戸のある研究から除外自動イメージング システムを使用して次の朝。

3. siRNA を細胞を transfect します。

1. SiRNA ライブラリ プレート プレートごと 80 siRNA のターゲットを含む構成済みベンダーを取得 (図 4を参照)、1 から 12 の列を持つ空のまま。
2. 製造元の手順¹⁹によると siRNA の各ウェルの 2 pmol/μ L の最終的な集中に siRNA バッファーと siRNA ライブラリ プレートを再構築します。
3. SiRNA の 4 pmol/まあ、トランスフェクション試薬の 0.3 μ L/ウェル播種後 24 時間のセルを transfect します。トランスフェクション試薬製造元のプロトコルに従ってすべての手順を実行します (プレート レイアウト図 4を参照)²⁰。
   1. すべての自動液体ハンドラーを使用 transfections を実行して、25 μ L/s ピペッティング速度のすべてのステップ。トランスフェクションが井戸のみに対処するのに事前に構成されたヒント ボックスを使用します。
   2. 「トップ プレート セット」と呼ばれる六つのレプリケート プレートのセット使ってライブラリ プレートの半分 top を使用して (siRNA、n あたり複製 6 = 6).
   3. 「下部プレート セット」と呼ばれる六つの複製板の異なるセットを使ってライブラリ プレートの半分下の使用 (siRNA、n あたり複製 6 = 6).
   4. 「フル プレート セット」という言葉を使用すると、ライブラリの siRNA を導入されて 12 のセル板を記述します。
   5. すべての上部と下部のプレート セットのライブラリ siRNA されてにトランスフェクトした後否定的なプールの siRNA とフル プレート セットすべての版の井戸 B2 B6 を transfect します。
   6. また transfect 井戸 B2 B6 別の 2 枚の板をライブラリ siRNA を受け取りません、負プール siRNA と未露光のコントロール (トップ プレート セット 1) と下部プレート セットのいずれかとなります。
4. 穏やかなすべての時間をタップして 4 時間すべてトランスフェクション混合物が追加された後とミックス携帯文化のインキュベーターですべてのセル版を孵化させなさい。
5. 予め温めておいた HCORT の中で 2 回プレートのすべてのウェルを洗浄する自動液体ハンドラーを使用希釈 PBS で 1:5。50 μ L/s を使用して、すべてのステップのピペッティング速度。
   1. 各ウェルから 100 μ L を吸引し、廃棄物の貯留層にそれを破棄します。
   2. 各も 100 μ L/ウェルに追加に予め温めておいた HCORT 培地希釈 1:5 の PBS プレート数のための十分な量の異なる貯水池に含まれています。
   3. 各プレートの 3.5.1、3.5.2 の手順を繰り返します。
      1. 必要に応じては、廃棄物のタンクを空にします。
      2. 詰替用 HCORT 培地で希釈に応じて PBS で 1:5。
   4. 各ウェルから 100 μ L を吸引し、廃棄物の貯蔵所にそれを破棄します。
6. プレートの数のための媒体の十分な量の異なる貯水池に含まれているこの 100 μ L/ウェルに予め温めておいた HCORT 媒体でプレートのすべての井戸を再フィードします。
   1. 必要に応じて培地で貯水池を補充します。
7. 非 transfected コントロールとして井戸 C2 ・ C6 全てのプレートを使用します。
8. 井戸 B7 B11 と毒性物質の暴露の薬物および車両のコントロールとして使用する導入したすべての板の C7 C11 を維持します。

4. 再フィード セル次の日

1. 自動液体ハンドラーを使用して、プレートのすべての井戸を再フィードします。50 μ L/s を使用して、すべてのステップのピペッティング速度。
   1. 各ウェルから 100 μ L を吸引し、廃棄物の貯留層にそれを破棄します。
   2. それぞれ 100 μ L/ウェルに予め温めておいた HCORT 媒体別貯水池に含まれており、, 再給餌する板の数のための媒体の十分な量と再フィードします。
   3. 4.1.1 と 4.1.2 すべてのセル板を再フィードする必要に応じて手順を繰り返します。
      1. 必要に応じては、廃棄物のタンクを空にします。
      2. 必要に応じて培地で貯水池を補充します。

5 肯定的なコントロールの追加

1. トランスフェクション後、露出の前に 2 時間の 2 日間は、HFA のエクスポー ジャーに使用し 8 行希釈タンクの行 B に追加 HCORT 媒体の肯定的な制御 cardamonin 62.5 μ M 溶液を準備します。
   1. CP 露出準備し、SKF 86002 の 25 μ M のソリューションを使用します。
   2. 肯定的な制御テストする板の数のための十分な量を準備します。
2. HCORT 中 (車両管理) DMSO の 0.625% 溶液を調製し、同じ油層の C 行に追加します。
   1. CP 露出準備し、DMSO 0.5% 溶液を使用します。
   2. 車両制御テストする板の数のための十分な量を準備します。
3. すべてのステップに井戸 B7 B11 と各セル板の C7 C11 に正と車両コントロールを追加し、50 μ L/s ピペッティングを使用自動液体ハンドラーの速度を使用します。事前に構成されたヒント ボックスを使用すると、正と車両コントロールが表示されます井戸のみに対応します。
   1. B7 B11 と各セル板の C7 C11 の井戸から媒体の 10 μ L を取り外して、G および H 8 行希釈タンクの行にそれを廃棄します。
   2. これらの井戸に正と車両コントロールの 10 μ L を転送し、3 回をミックスします。
4. これらのセル板をインキュベーターに戻ります。
5. 5.3 5.4 にすべてのセル板が肯定的な受信するまでの手順と車両のコントロールを繰り返します。

6 培養細胞の HF 露出

注意: HFA は腐食性と急性毒性です。

1. 安全メガネ、使い捨てポリエチレン スリーブ プロテクター研究室コート ダブル ニトリル手袋を身に着けている化学発煙のフードで化学物質の暴露のすべての操作を実行します。
   1. 48% 溶液として HFA を取得します。
   2. HFA を純水で 1% に希釈し、安全を改善するために 10 mL 肉厚ポリエチレン バイアル 5 mL 因数で格納します。
   3. ピペット チップと接触して HFA と 2.5% グルコン酸カルシウム有害廃棄物ストリームで処分する前に、任意の残りの液体 HFA 貯水池を消毒します。
2. 各 siRNA の図書館調査中板、1% の 288 μ L を追加することによって 0.0036 %hfa メディア ソリューションの準備を予め温めておいた HCORT 150 mL ボトル中の 80 mL HFA。
   1. 渦巻き模様のボトルと 10 分の化学発煙のフード 37 ° C の定温器で希薄 HFA を孵化させなさい。
3. ボトルを旋回で再び HFA 培地溶液を混合し、HFA メディア ソリューションを試薬槽暖かいプレート上に追加します。
4. タンデムで働く 2 つの技術者と露出を実行します。
   1. 12 チャンネル pipettor を使用して細胞板の内部の井戸のそれぞれから正しい吸引 100 μ L の技術者を有し、技術者に左側に板を渡します。
   2. HFA の中規模ソリューションのウェルあたり 100 μ L を追加左の技術者があります。
   3. 毒性物質にさらされることは、すべてのセル板 6.4.1 と 6.4.2 の手順を繰り返します。
   4. また HFA メディア ソリューションではなく新鮮な HCORT 媒体を活用した、非公開の制御板は、6.4.1 と 6.4.2 手順を繰り返します。
5. 20 分の化学発煙のフード インキュベーターでプレートを配置し、携帯文化のインキュベーターにそれらを返します。
6. 以前にしたらすべてのプレートをさらされ、細胞文化のインキュベーターに返されるを示す肯定的な制御の追加ステップ (ステップ 5.5 5.1) を繰り返します。

7 培養細胞の CP 露出

注意: CP は急性毒性と刺激です。

1. 安全メガネ、使い捨てポリエチレン スリーブ プロテクター研究室コート ダブル ニトリル手袋を身に着けている化学発煙のフードで化学物質の暴露のすべての操作を実行します。
   1. CP を獲得します。
   2. 5 %dmso で CP を希釈し、安全を改善するために 10 mL シンチレーション バイアル 10 mL の因数で保存します。
   3. ピペット チップと接触して CP と亜硫酸水素ナトリウム 2.5% 有害廃棄物ストリームで処分する前に、残った液体 CP 貯水池を消毒します。
2. 予め温めておいた HCORT 培 x ペン/連鎖球菌とプレートの数のために予め温めておいた PBS を公開する 1 の十分な量を準備します。
3. トップ プレートのセットまたは底板セットごとに 5% の 8.04 μ L を追加に予め温めておいた HCORT 培地および 0.0008% の最終的な CP の集中のためによくミックスの 50 mL の約数に DMSO の CP。しっかりとチューブをキャップし、1 h の化学発煙のフード 37 ° C の定温器でソリューションを孵化させなさい。
   1. 媒体の 50 mL の因数を CP に追加を時間トップ プレート セットさらされて、CP が媒体の 50 mL の約数に追加された後に毒性物質正確 1 h を受け取ります底板を設定します。
4. 細胞文化のインキュベーターからトップ プレート セットと 1 非公開コントロール プレートを削除し、潜伏期間の終わりの近くの化学発煙のフードで配置します。
5. チューブを反転で CP ソリューションをミックスし、1 時間の潜伏期間の終わりに試薬リザーバーをデカントします。
6. タンデムで働く 2 つの技術者と露出を実行します。
   1. 12 チャンネル pipettor を使用して細胞板の内部の井戸のそれぞれから正しい吸引 100 μ L の技術者を有し、技術者に左側に板を渡します。
   2. CP 中規模ソリューションのウェルあたり 100 μ L を追加左の技術者があります。
   3. 毒性物質にさらされるトップ プレート セットのすべてのセル板 7.6.1 と 7.6.2 の手順を繰り返します。
   4. また CP 中規模のソリューションではなく新鮮な HCORT 媒体を活用した、非公開の制御板は、手順 7.6.1 と 7.6.2 を繰り返します。
7. 10 分の化学発煙のフード 37 ° C の定温器にプレートを配置します。
8. 1 を含む PBS および HCORT 媒体の十分な量を追加 10 分潜伏期間の終わりの近くの試薬リザーバーにペン/連鎖球菌性 x。
9. 12 チャンネル pipettor を用いたセル板から CP ソリューションを削除し、10 分潜伏期間の終わりに PBS のウェルあたり 100 μ L でそれを置き換えます。
10. すぐに PBS セル板から取り外して交換するそれの HCORT 培 1 ウェルあたり 100 μ L でペン/連鎖球菌 x。
11. また非公開の制御板の手順 7.9 と 7.10 を繰り返します。
12. セル板を標準細胞文化のインキュベーターに戻ります。
13. 下部プレートのセット手順 7.12 に 7.3 を繰り返します。
14. 前述したようにしたらすべてのプレートをさらされ、細胞文化のインキュベーターに返される肯定的な制御追加ステップ (ステップ 5.5 5.1) を繰り返します。

8. サンプルの収集とセル実行可能性の試金

1. 24 時間暴露後ブドウ糖 10 g/L を含む PBS で 0.5 mg/mL MTT 基板のソリューションの準備し、37 ° C²¹に暖かい。試金する各プレート用基板の 10 mL を準備します。
2. 試金する枚数、自動液体ハンドラーで貯蔵所に MTT 基板の解決の十分な量を追加します。
3. すべての手順のサンプルを収集し、50 μ L/s ピペッティングを用いた MTT 基板を追加する自動液体ハンドラー速度を使用します。試金する井戸だけそれらに対処するためのヒント ボックスを事前に構成します。
   1. セル板と 2 つのストレージ ・ 384 ウェル プレートの各預金 42.5 μ L の内側 60 井戸から吸引 95年 μ L の培地。
   2. すぐにセル板に MTT 基板の解決のウェルあたり 100 μ L を追加し、1.5 h の携帯文化のインキュベーターで 37 ° C でそれらを孵化させなさい。
   3. MTT 基板ソリューションに応じて貯蔵所を補充します。
4. 1 h の携帯文化のインキュベーターで 37 ° C でセル版を孵化させなさい。
5. ストレージ ・ 384 ウェル プレートをシールし、その後の分析-80 ° C で保存します。
6. すべて上部と下部プレートのセットと関連付けられた非公開コントロールの 8.3 から 8.5 の手順を繰り返します。
   1. 洗って MTT 基板の解決とプレート間の切り替え設定しますを追加するときは、複製間のヒントを再利用します。
7. 1 時間培養後自動液体ハンドラーで貯蔵所に DMSO の十分な量を追加します。
8. すべてのステップに DMSO を追加し、50 μ L/s ピペッティングを使用自動液体ハンドラーの速度を使用します。
   1. 各セル板の内側の井戸から 100 μ L を吸引し、廃棄物の貯留層に MTT 基板ソリューションを破棄します。
      1. 必要に応じては、廃棄物のタンクを空にします。
   2. 100 μ L の DMSO の各ウェルをオーバーレイします。
      1. 必要に応じてに DMSO 貯水池を補充します。
9. 3 分間プレート シェーカーでプレートを振る。
10. 570 と 690 nm プレート分光光度計を使用して吸光度を測定します。
11. 背景を減算し、未露光のコントロールによって公開された吸光度値で割って % 細胞生存率を計算します。平均非公開負プール siRNA コントロールを使用して、すべてのターゲット % 細胞生存率を計算します。

9. メジャー IL 8 濃度細胞培養上清中

1. IL 8 のいいえを使用して細胞培養上清中の濃度は、製造元の手順²²によるとビーズ アッセイを洗います。サンプルと標準曲線に対応するアッセイ プレート レイアウトを作成します。
2. -80 ° C のフリーザーからストレージ ・ 384 ウェル プレートを取り、室温で解凍、簡潔に井戸の底にサンプルを収集するためにプレートを遠心します。
3. 実行するアッセイ プレート数、キットに付属するアッセイバッファー中抗 IL 8 アクセプター ビーズ、ビオチン化抗 IL 8 抗体の十分な量を作る。アンチ IL8 アクセプター ビーズの 50 μ L とビオチン化抗 IL8 抗体アッセイバッファー 9.9 mL に 50 μ L の比率を使用します。
   1. マルチ チャンネルの pipettor を使用して、黒の 384 ウェル保存プレートにビーズ/抗体の混合物を追加します。
      1. サンプルとアッセイ プレート レイアウトに従って標準曲線の使用のために指定の井戸にアクセプター ビーズ/抗体を追加します。
      2. よく実行するアッセイ プレート数のためにつき十分な量を追加します。
4. IL-8 標準 1000 pg/mL 354 μ M を含む細胞培養培地を使用するを再構成塩化ナトリウム。実行するアッセイ プレート数のための十分な量を作る。
5. 標準曲線の 8 つの二重のシリアル希薄を作る。
6. アッセイ プレート レイアウトによると黒の 384 ウェル保存プレートの適切な井戸に 3 通標準曲線を追加します。よく実行するアッセイ プレート数のためにつき十分な量を追加します。
   1. 354 μ M を含む細胞培養液を同様に、追加のバック グラウンド測定なしの IL - 8 塩化ナトリウム。
7. 自動液体ハンドラーを使用すると、分析を実行できます。事前に構成されたヒント ボックスを使用すると、アッセイ プレート レイアウト指定井戸のみに対応します。50 μ L/s を使用して、すべてのステップのピペッティング速度。
   1. アクセプター ビーズ抗体の混合物の 8 μ L を白の 384 ウェル浅いよくアッセイ プレートの井戸に転送します。
      1. サンプルとアッセイ プレート レイアウトに従って標準曲線の指定井戸にのみ追加します。
   2. 2 μ L の標準曲線をアッセイ プレート レイアウトによると浅いよくアッセイ プレートの適切な井戸に転送します。
   3. 3.54 M NaCl 溶液を調製し、自動液体ハンドラーの浅部貯留層に試金する板の数のための十分な量を追加します。
   4. 4.5 μ L の NaCl 水溶液をストレージ ・ 384 ウェル ブラック プレートのサンプルに転送することによって標準の曲線と一致するサンプルの塩濃度を調整します。
   5. 3 回 30 μ L の混合量を使用してサンプルをミックスし、浅い白サンプルの転送 2 μ L よくアッセイ プレート アッセイ プレート レイアウトによると。
      1. サンプル プレートの間にヒントを変更します。
   6. 室温で暗闇の中で 1 時間インキュベートします。
   7. 実行するアッセイ プレート数、アッセイバッファーでアクセプター ビーズの十分な量を作る。アッセイバッファー 12.3 mL にセカンダリ アクセプター ビーズを 200 μ l 添加の割合を使用します。
   8. マルチ チャンネルの pipettor を使用して、黒の 384 ウェル保存プレートにセカンダリ ビーズを追加します。
      1. サンプルとアッセイ プレート レイアウトに従って標準曲線の使用のために指定の井戸にセカンダリ ビーズを追加します。
      2. よく実行するアッセイ プレート数のためにつき十分な量を追加します。
   9. 自動液体ハンドラーを使用すると、白の 384 ウェル浅いよくアッセイ プレートの井戸にセカンダリのビーズの 10 μ L を転送します。
      1. サンプルとアッセイ プレート レイアウトに従って標準曲線を受けた井戸にのみを追加し、各プレート間ヒントを洗浄します。
   10. 室温で暗闇の中で別の時間孵化させなさい。
8. アッセイ プレート プレート シールをオフし、アッセイと互換性のあるプレート リーダーを使用してスキャンをシールします。スキャンに 550 ms 測定時 180 ms 励磁時間と検出器プレート間 0.2 mm を使用します。
9. IL 8 試金から raw データをスプレッドシートにインポートします。
10. IL 8 の試金の標準曲線の自動曲線を使用し、pg/mL 各サンプルのために生データを変換します。

結果

露光法の開発

私たちは洗練され、ひと角膜上皮細胞線 SV40 HCEC 高温超伝導の研究で使用するための適合性を評価します。SV40 HCEC SV 40 大 T 抗原を用いた不死化された層から発掘 Pal²³からの贈り物だった.簡潔にここに提示する露出方法論開発の検討も多くの変数があった、だから、信じて我々 の調査結果のいくつかのサンプルはより広範に適用される可能性がありますだけに複数の有害物質が表示されます。

スパイクまたは媒体の交換によって毒性物質の暴露

我々 は当初媒体最終曝露濃度を達成するために 96 ウ...

ディスカッション

ここ HF および CP の傷害の研究のためのモデルをスクリーニングする高スループット角膜上皮細胞の開発に、私たちの方法と結果を述べる。HF 傷害の主な siRNA 画面から結果を提案する.TIC の傷害の研究のための高温超伝導モデルの開発に多くの課題があった。我々 は細胞培養モデルの HF、HFA または CP の研究に関連する文献で見つけることができる方法は、少しの助けのだった。フッ化物イオンのほとんどの in vitro研究口腔細胞と (例についてを参照してください^28,29) HF や HFA ではなく、フッ化ナトリウムを利用します。Pesonenらによる気道上皮細胞の体外露出 CP へのいくつかの方法論を公開されています。³⁰します。 最終的には、我々 の特定のメソッドに見つかりません HF、HFA または CP の高温超伝導研究と課題と必要な高温超伝導体開発でこれらの有効成分の研究に関連した変数の大半に関連文...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Bravo リキッドハンドリングプラットフォーム	Agilentまたは同等の	G5409A
Bravo プレートシェイカー	Agilentまたは同等の	オプション 159
Bravo 96LT 使い捨てチップヘッド	Agilentまたは同等の	もの オプション 178	96チャンネル大型チップピペッティングヘッドユニット
Bravo 96ST 使い捨てチップヘッド	Agilentまたは同等の	オプション 177	96チャンネル小型チップピペッティングヘッドユニット
Bravo 384ST ディスポーザブルチップヘッド	Agilentまたは同等品	オプション 179	384チャンネル スモールチップピペッティングヘッドユニット
Bravo 96 250 μL 滅菌バリアチップ	Agilent または同等品	19477-022
Bravo 384 30 μL 滅菌バリアチップ	Agilentまたは同等品	19133-212
Bravo 384 70 μL 滅菌バリアチップ	Agilentまたは同等の	もの 19133-212
EnSpire マルチモードプレートリーダー	Perkin Elmer または同等の	もの 2300-0000	AlphaLISA アッセイ検出器 高出力レーザー励起
IL-8 (ヒト) AlphaLISA 検出キット	Perkin Elmer または同等の	AL224F	ノーウォッシュビーズベースのアッセイ
ProxiPlate-384 Plus white 384-shallow well microplates	Perkin Elmer または同等の	6008359
Lipofectamine RNAiMAX	Invitrogen または同等の	13778500	トランスフェクション試薬
Opti-MEM 1 Reduced Serum Medium	Invitrogen または同等の	31985070
TrypLE Express	Gibco または同等の	12605010	細胞剥離ソリューション
IncuCyte Zoom	Essen Instruments または同等の	ESSEN BIOSCI 4473	インキュベーター付き自動顕微鏡
クロロピクリン	トリニティ 製造または同等の	N/A	急性毒性および刺激性
DMEM-F12 細胞培養培地	Invitrogen または同等の	11330-057	HEPES を含む
ウシ胎児血清	Invitrogen または同等	品 1891471
ヒト上皮成長因子 (細胞培養グレード)	Invitrogen または同等品	E9644-.2MG
組換えヒトインスリン (細胞培養グレード)	Invitrogen または同等	品 12585-014
ペニシリン-ストレプトマイシン溶液 (細胞培養グレード)	Invitrogen または同等品	15140122
ヒドロコルチゾン(細胞培養グレード)	シグマまたは同等の	H0888-10G
グルコース (細胞培養グレード)	シグマまたは同等の	G7021
PBS (細胞培養グレード)	Sigmaまたは同等の	P5493
siRNA	Dharmaconまたは同等の	各種
チアゾリルブルーテトラゾリウムブロマイド	Sigmaまたは同等の	M5655	MTTアッセイ基質
siRNA	バッファーThermoまたは同等の	B002000
96ウェル細胞培養プレート	コーニングまたは同等の	CLS3595
T150細胞培養フラスコ	コーニングまたは同等の	CLS430825
BSL-2細胞培養フード	Nuaireまたは同等の	NU-540
300 mL ロボットリザーバー	サーモまたは同等の	12-565-572
96個のバッフル付き自動化リザーバー	サーモまたは同等の	もの 1064-15-8
500 mL 滅菌使い捨て保存ボトル	コーニングまたは同等の	CLS430282
マイクロプレートヒートシーラー	サーモまたは同等の	AB-1443A
マイクロプレートヒートシールホイル	サーモまたは同等の	AB-0475
カルダモニン	トクリスまたは同等の	2509	抗炎症剤、ポジティブコントロールSKF
86002 として使用。	Tocris または同等の	2008	抗炎症剤、ポジティブコントロールとして使用
DMSO	Sigma または同等の	D8418
48% フッ化水素酸	Sigma または同等の		339261 腐食性および急性毒性
1000 μL シングルチャンネルピペッター	レイニンまたは同等	17014382
200 μL シングルチャンネルピペッター	レイニンまたは同等	17014391
20 μL シングルチャンネルピペッター	レイニンまたは同等	17014392
1000 μL 12チャンネルピペッター	レイニンまたは同等	品 17014497
200 μL 12チャンネルピペッター	レイニンまたは同等品	17013810
20 μL 12チャンネルピペッター	レイニンまたは同等品	17013808
ピペッターチップ 1000 μL	レイニンまたは同等	品 17002920
ピペッターチップ 200 μL	レイニンまたは同等の	17014294
ピペッターチップ20 μL	レイニンまたは同等	品
	ジェームズタウン メタルプロダクツ
384ウェルサンプル保存プレート	サーモまたは同等の	262261
塩化ナトリウム	シグマまたは同等の	S6191
50 mL コニカルチューブ	サーモまたは同等品	14-959-49A
セロロジカルピペット 50mL	コーニングまたは同等品	07-200-576
血清ピペット 25 mL	コーニングまたは同等品	07-200-575
血清ピペット 10 mL	コーニングまたは同等品	07-200-574
血清ピペット 5 mL	コーニングまたは同等品	07-200-573
SV40-HCEC 不死化ヒト角膜上皮細胞	N/A	N/A	これらの細胞は市販されていませんが、記事「
Sceptor Handheld Automated Cell Counter	Millipore」または同等の	PHCC20060
GeneTitan Multi-Channel (MC) Instrument	Affymetrix または同等の	00-0372
Affymetrix 24- and 96-array plates	Affymetrix または同等の Affymetrix または同等の Afymetrix 901257	; 901434
Draegger の記事で引用されている研究者から入手できます。チューブ HF	Draegerまたは同等の	8103251
Draegger チューブ CP	Draeger または同等の	8103421
Draegger ポンプ	Draeger または同等の	6400000
クリア プレート シール	Resesarch Products International または同等の	202502
試薬リザーバー	VistaLab Technologies または同等の	3054-1000
Xlfit	IDBSまたは同等の	N/A	Excelアドインを自動カーブフィットに使用