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方法論記事

ショウジョウバエのティッシュの最小限の量を使用してのグリセリンの繊維でミトコンドリアの酸素消費量の測定

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DOI：

10.3791/57376

⸱

2018年4月7日

 ,  ,  ,  , 
1Département de chimie et biochimie, Université de Moncton, 2Département de biologie, Université de Moncton

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

本稿で、ショウジョウバエのグリセリン thoraxes による高解像度の呼吸の酸素消費量を測定する方法を説明します。この手法は古典的なミトコンドリアの分離法と比較して組織の最小限の量を必要として得られた結果、もっと生理学的に関連します。

要約

ショウジョウバエ、キイロショウジョウバエ代謝の研究のための新たなモデルを表します。確かに、ショウジョウバエは、構造の人間の臓器に相同性を持つし、非常に節約された代謝経路を持っている時間の短い期間で別の基礎的メカニズムの研究を可能にする比較的短い寿命を持っています。しかし、意外な細胞の代謝、ミトコンドリア呼吸に不可欠なメカニズムの 1 つは徹底的に触れられていないこのモデルです。ショウジョウバエにおけるミトコンドリア呼吸の測定は通常非常に多数の個人を必要とし、得られた結果が再現性が高いのでそうです。ここでは、ショウジョウバエから組織の最小限の量を使用してミトコンドリアの酸素消費量の正確な測定を許可する方法を説明します。この方法では、thoraxes を切除し、両方鋭い鉗子で機械的と化学的にサポニン、異なる化合物は細胞膜を通過し、ミトコンドリア呼吸を調節することができますグリセリンです。透過処理、したプロトコルが、ランプといくつかの阻害剤に彼らの対応だけでなく、異なる基質を酸化する電子輸送システム (ETS) の異なる複合体のキャパシティを評価する実行されます。このメソッドは、ミトコンドリアがまだ他の細胞成分との相互作用とミトコンドリアの形態が保存されているので、それはもっと生理学的に関連するとミトコンドリアの分離を用いた方法と比較して多くの利点を示します。また、サンプル準備の速度が速い、得られた結果が再現性が高い。ミトコンドリア呼吸性と代謝の研究のためのモデルとしてショウジョウバエの利点を組み合わせることにより新たな洞察が、発表することができます重要な特にときハエが発生している異なる環境や病態生理学的条件。

概要

ミバエショウジョウバエは、1世紀以上の遺伝子研究のモデル生物として使用されています。この生物の研究伴性継承2、突然変異率3、ニューラル システムの開発と細胞運命決定の4の重要な基礎知識にしかつながっていないが、また最近として浮上している、アルツハイマー病やパーキンソン病の5,6などいくつかの疾患に固有のメカニズムを研究する貴重なツールです。さらに、彼らは時間の短い期間で大量に発生する可能性が、寿命が短いと老化のプロセスを勉強する人気のあるモデルです。彼らはまた、インスリン産生細胞 (β 膵細胞に相当)、脂肪体 (同様には肝と白脂肪組織として機能している)、oenocytes (肝細胞様細胞)、心臓などの臓器に相同構造を所有しているだけでなく、体液代謝産物 (脊椎動物の血に似ています)7を輸送します。また、中間代謝 (インスリン/インスリン様成長因子のようなシグナル伝達経路およびラパマイシン ターゲット TOR 経路含む) の中央の道は、また非常に節約された7です。これらの理由から、ショウジョウバエは最近8糖尿病など代謝疾患固有の病態を中心に、代謝を制御する基本的なメカニズムを記述するため悪用されています。代謝の主要なコンポーネントは酸化的リン酸化プロセス (OXPHOS) を通じて ATP 生産、ミトコンドリア複数の経路を統合し、生命の最も重要な生物学的機能のいずれかを実行します。生物の代謝の中心的な役割を考慮したそれは、ミトコンドリアの機能障害がパーキンソン病9とアルツハイマー病10のような多くの病気だけでなく、筋萎縮性側索硬化症に関与していること意外ではないです。11,12. 老化プロセスの基本的な決定要因があります。確かに、酸化損傷11を通じて高濃度の細胞に有害なことができる細胞活性酸素種 (ROS) の主要な生産者しています。高齢化はまた破損または変異ミトコンドリア DNA13mitophagy 機能障害14,15ミトコンドリア生合成16障害の蓄積に関連付けられています。ミトコンドリアは細胞の恒常性の重要要因ではまた豊富や栄養素17,18の希少性によるといくつかの細胞機能を調節する別の基板を利用することができます。

確かに、ダイエット (炭水化物、脂質および蛋白質) のさまざまな栄養素に消化され、吸収され、細胞に運ばれます。細胞質に転化し、派生の基板は NADH や FADH219などの削減の同等物を製造しているミトコンドリアのマトリックスに運ばれます。これらの削減の同等は、電子輸送システム (ETS) の異なる酵素の複合体によって酸化されてし。これらの複合体は複合体など、ミトコンドリア内膜に埋め込まれている私と複合体 II。さらに、ミトコンドリアのグリセロール-3-リン酸脱水素酵素およびプロリン脱水素酵素など他の酵素の複合体は、ETS20,21に電子のエントリの代替ルートを表します。これらの 'alternative' 複合体は昆虫、特に重要として、種に応じて彼ら積極的に参加できる呼吸20,22,23,21を増加します。これらの ETS の供給システムからの電子は、最終的なアクセプター分子酸素まで、ユビキノン、その後複合体 III にし複雑な IV が転送されます。この電子の移動は、複雑な V (図 1) で ATP を ADP のリン酸化を運転内部のミトコンドリア膜プロトン動機力を生成します。病態生理学的ミトコンドリア細胞の恒常性は、キイロショウジョウバエ関連するモデルを表しますを用いたミトコンドリア代謝の勉強の中心的な役割の様々 なメカニズムを記述する強力なツールを検討条件または細胞と環境ストレスの下で。驚くほどしかし、研究の一握りだけは実際にショウジョウバエ24,25,26のミトコンドリアの呼吸を測定しました。確かに、ミトコンドリアの酸素消費量を評価することを目指して実験はミトコンドリアの分離を必要とします。分離が一般的にむしろ大量を必要とする (活性酸素産生やミトコンドリア効率27,28のマーカーとしての P/O 率) などさまざまなミトコンドリア機能の測定のために有利、いくつか個人24,29からのティッシュ。組織や個人の多量のためのこの要件は、重要な制限要因、特にすべての個人が同じ年齢であることを考えるとできれば実験のための同性の異なる時間に呼吸のメジャーを作る最高の状態で骨の折れるポイントします。さらに、ミトコンドリアの分離は、ミトコンドリア代謝を支配する根本的なメカニズムに重要な洞察力を提供できますが、ミトコンドリアの分離に使用するメソッドはレプリケート可能な結果を得ることの難しさなどいくつか欠点を持ってください。、ミトコンドリアのネットワークおよびミトコンドリアの構造と機能29,30,31の変質の中断。

本研究の目的は、非常に少数の個人から組織の最小限の量だけを用いたショウジョウバエのミトコンドリアの酸素消費量を測定するための堅牢なプロトコルを提示することです。このプロトコルでミトコンドリアの酸素消費量測定の in situショウジョウバエ thoraxes からグリセリン筋線維29を使用して高解像度呼吸32,33,との組み合わせで構成されています34,35ですこのメソッドも古典的なミトコンドリアの分離メソッドからセルの他のコンポーネントとの相互作用としても、ミトコンドリアの構造と機能はの保存よりグリセリンに比べて利点があります。繊維29,31,36, もっと生理学的に関連するこのアプローチになります。このプロトコルで、基板 ETS のいくつかの異なる段階で酸素消費量の決定をすること、ショウジョウバエの唯一の 3 つの thoraxes で使用する高解像度の呼吸ミトコンドリア機能することができます正確に評価されます。したがって、このプロトコルはショウジョウバエ モデルの利点を生かして多くの環境または病態生理学的条件のコンテキストで代謝を制御する基本的なメカニズムに関する質問に回答キーを助けることができます。

ETS のいくつかの異なる手順で酸素消費量を測定し、どのように異なる基板を評価する呼吸、別基板 (図 1)、ランプに貢献し、阻害剤が使用される30の透過後、組織。具体的には、異なる基板上の順次追加、ETS の異なる複合体を介して電子のエントリを刺激するために実行されます。シアン化物のカルボニル、ランプ 4-(フッ素系低分子) phenylhydrazone (FCCP) は非結合呼吸を測定するための最適な濃度で追加した、すなわち、非リン酸化呼吸筋酸素消費量刺激されます。複合体 I、II、および III は ETS 非酸化反応により、残留酸素の消費量を監視する実行し、順次抑制。N, N, N の注入による複雑な IV 最大呼吸能力を評価できる最後に、'、N - テトラメチル - p-フェニレンジアミン (受けた東京都警視庁)、人工電子プロバイダーとアスコルビン酸。それはハエの発生する温度なので、24 °C で実験が行われているに注意してくださいすることが重要です。

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プロトコル

1. 試薬の調製

  1. 解剖と組織の透過の以下のソリューションを準備します。
    1. 保存液を準備: 2.77 ミリメートル CaK27.23 mM K2グリコールエーテルジアミン四酢酸、5.77 mM Na2ATP、6.56 mM MgCl2、タウリン、20 mM 15 mM Na2クレアチンリン酸、20 mM のイミダゾール、0.5 mM ジチオトレイトール グリコールエーテルジアミン四酢酸と 50 ミリメートル K-MES の pH 7.1 (格納できます。-20 ° c)。
    2. サポニン溶液の準備: 保存液の 1 mL のサポニンの 5 mg (新鮮な毎日を準備)。
  2. 呼吸の測定のための次のソリューションを準備します。
    1. 呼吸メディアの準備: 120 mM KCl、5 mM KH2PO4、3 mM HEPES、1 mM グリコールエーテルジアミン四酢酸、1 mM MgCl2、および 0.2 %bsa (w/v)、pH 7.2。
    2. 基板、ランプ、阻害剤を準備します。H2O、すべての基板を溶解し、エタノール (H2O で希釈したマロン酸) を除いて絶対に阻害剤と同様、FCCP ランプを解散します。ほとんど、基板と同様のマロン酸 (材料の表を参照) を中和します。プロトコルは、すべての濃度は、2 mL 槽内最終濃度です。

2. 準備中と高解像度計のキャリブレーション。

  1. 洗浄室、キャップ、および蒸留水 70% エタノールで 3 回と 3 回の呼吸のストッパー。
  2. ゼロ酸素濃度調整: チャンバ内呼吸媒体の 2.3 mL ピペットで移しなさい、亜ジチオン酸ナトリウム 10 mg を追加。商工会議所の最大の量は 2 mL が、2.3 mL は、維持気泡なし、ストッパーの下チャンバーを閉じるときに追加されます。ストッパーで部屋を閉じ、酸素濃度が 10-20 分調整結果の酸素消費量と酸素濃度がゼロで電極を測定します。
  3. 芳醇な水で部屋を洗って 10 分、無水エタノールで孵化させなさい蒸留水で洗い流し。
  4. 空気飽和状態における調整: ピペット 2.3 mL 呼吸室、中のストッパーを挿入、ストッパーの上に余分な培地を吸引、スペーサー、ストッパーを持ち上げます。戻過剰呼吸媒体は、部屋を閉じた後、気泡の存在を避けるために室 (合計 2 mL の体積) で。
  5. 酸素濃度 (ブルー トレース) が 250 前後安定するまで 1 時間 45 分の酸素消費量を監視 24 の ° C で nM

3. ハエや組織の透過の郭清

  1. 氷の上のすべての手順を実行していることを確認します。
  2. 同じ系統の六つの男性のハエを anaesthetize、同じ年齢、同じ食事 (野生型 w1118, 15 日齢、コーンミール培地に供給) ハエの解離を容易にするために氷の上で発生します。
  3. 飛翔筋を含む thoraxes のみを維持する (頭と腹部を削除) ハエを解剖メスと細い鉗子を使用する。この手順は、肉眼で行うことができます。先の細いピンセットで結果の thoraxes を処理します。
  4. 25 mm シャーレ、鉗子を用いた氷冷保存液 2 mL を含む 3 つの解剖 thoraxes を転送します。
  5. 先の細いピンセットで機械的に鉗子の先端を挿入、thoraxes、thoraxes を permeabilize し、繰り返し緩く接続されたネットワークを取得する組織を引き裂きます。
  6. 24 ウェル プレートでサポニン溶液と、サポニンの 62.5 μ G/ml の濃度が最終的な保存液 1 mL 12.5 μ L で 2 つの井戸を埋めます。呼吸中の 1 mL の 2 つの隣接する井戸を埋めます。
  7. 先の細いピンセットで希釈したサポニン溶液に 3 グリセリン thoraxes を転送し、軌道シェーカーで、氷の上に 20 分間の軽度の動揺と孵化します。
  8. 後者のインキュベーション後軽度の動揺、サポニンを洗うこと 5 分間氷の上で呼吸中でいっぱい隣接する井戸に繊維を転送します。

4. 乾燥減量の定量

  1. グリセリン thoraxes 吸収性の表面上の乾燥し、3-4 回はすべての水分が除去されるかどうかを確認する細い鉗子を使用してフリップします。
  2. 発振に一緒に 3 つの thoraxes の重量を量る。ミトコンドリアの酸素消費量が正規化される、得られた重みに注意してください。
  3. 氷の上、呼吸中のドロップですぐに組織を転送します。

5. 酸素消費率の定量

  1. 呼吸度計の室を開く (ストッパーを削除) し、各チャンバーに 10 mM ピルビン酸とリンゴ酸の 2 mM を追加。
  2. 呼吸の中で満たされた室に直接グリセリン組織を追加します。
  3. スペーサーを使用してストッパーを取り付けます。
  4. 60 mL シリンジと酸素タンクから直接酸素を収集し、組織中の酸素拡散が酸素消費量を制限していないかどうかを確認する各商工会議所のストッパー毛細血管を通して酸素の 2-5 mL を注入します。
  5. 商工会議所に、thoraxes が残っているかどうかを確認する各ストッパーの毛細血管にハミルトン シリンジを挿入します。
  6. 酸素濃度が約 400 室を完全に閉じる空気飽和上の酸素のレベルを達成する nM (約 160% は飽和空気) 部屋の中。
  7. 停止し、チャンバ内の空気の泡を確認するミキサーを再起動します。
  8. 組織呼吸の組織 (mg) の質量質量固有の酸素消費量 (pmol O2 consumed.s-1.mg-1組織) の表示を正常化する以前の重量を量った量を入力します。
  9. 酸素消費量が (赤いトレース) を安定して、5 mM ADP ハミルトン注射器を追加します。
  10. 各注入の後 70% エタノール蒸留水と注射器を洗い、再び水を蒸留します。
  11. 酸素消費量が再び安定、シトクロム c の 4 mM の 5 μ L を注入します。
  12. ETS のさまざまなステップでミトコンドリアの酸素消費量を評価する次の基板の連続注射を行います。
    1. 2 M のプロリンの 5 μ L を追加します。
    2. 1 M のコハク酸の 10 μ L を追加します。
    3. 1 M グリセロール-3-リン酸の 30 μ L を追加します。
  13. 0.5-1 の手順で滴定方法でランプ FCCP を注入 μ M (1 mM の溶液 2 μ L) 最適な濃度までは達された、すなわち、抑制することがなく可能な限り最高の酸素消費量を達成するために濃度 (注意:テーブルを参照してください材料の)。
  14. 完全 (ロックス) の残留酸素消費を測定するために ETS の電子流束を阻害する順番に次の阻害剤の注入など他の中ヘムオキシゲナーゼ反応すなわち非呼吸反応。
    1. 1 mM ロテノンの 1 μ L を追加 (注意:材料の表を参照してください)。
    2. 2 M のマロン酸の 5 μ L を追加 (注意:材料の表を参照してください)。
    3. 5 mM アンチマイシン A の 1 μ L を追加 (注意:材料の表を参照してください)。
  15. アスコルビン酸 0.2 mM や 0.5 mM 受けた東京都警視庁、室に順次複雑な IV による酸素消費量を測定するアスコルビン酸で始まるを追加します。
  16. 複雑な IV を阻害するアジの 20 mM を追加 (注意:材料の表を参照してください)。
  17. 信号が安定して、チャンバー スペーサーで、純粋な酸素の 2 mL を注射することによって部屋を再酸素開閉チャンバー濃度が 250-300 nmol.mL-1。
  18. 10-15 分のための信号を測定し、化学の背景、すなわち、受けた東京都警視庁の自動酸化による酸素消費量を計算します。

6. 工場の洗浄

  1. 測定後蒸留水でチャンバーを濯ぎ 1 回と 3 回 70% のエタノールのチャンバーをすすいでください。
  2. 阻害物質を不活化する 10 分の無水エタノールで孵化させなさい。
  3. 蒸留水すすぎ 3 回、70% エタノールで部屋を埋める、次利用までストッパーとキャップを交換します。

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結果

上記で説明したプロトコルを使用してミトコンドリアの酸素消費量の代表的なトレースは、図 2で提供しています。ピルビン酸とリンゴ酸グリセリン筋線維とともにチャンバーに注入、呼ばれる CI リーク呼吸、すなわち、複雑な ETS の私がによって刺激されるとき、NADH 生産にピルビン酸とリンゴ酸による酸化を介して、トリカルボン酸 (CI)。この呼吸の中にミトコンドリアの酸素は主にプロトンが ATP 合成酵素がアクティブ (リーク)30ミトコンドリアのマトリックスを膜間腔からの交差点、すなわち、プロトン リークを補うために維持されます。ADP が追加され、ATP 合成酵素が活性化、電子転送コンプレックスから同時 ATP (CI OXPHOS) に ADP のリン酸化と複雑な iv の結果私はミトコンドリアの酸素消費量を増加します。OXPHOS の結合比は CI OXPHOS/CI リークとして計算され、通常ミトコンドリアの質とミトコンドリア...

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ディスカッション

本研究では、ショウジョウバエにおけるミトコンドリアの酸素消費量の測定前の試料の調製方法を説明します。このメソッドは、期間、必要な人数の面で特に、ミトコンドリアの分離を使用してプロトコルに関連するさまざまな問題を克服するために開発されました。通常いくつかの個人から得られた組織の大規模な量を必要とするミトコンドリアの分離ではなく、この実験はいくつかのショウジョウバエの thoraxes からのグリセリンの筋線維で実行されます。このプロトコルでは、最適な結果を表示するだけ 3 人が必要です。したがって、それはより小さいグループの同じ年齢を持つハエと同性の同期を達成可能なさまざまな時点におけるミトコンドリアの酸素消費量の測定が可能です。

最初に、それは同じ年齢, 性別, ひずみのショウジョウバエを使用することが重要、結果 (図 6) の低可変性を得るため同じ条件で育った呼吸に変わる可能性が年齢、性別、遺伝子型とハエのダイエット。このプロトコルの実行の最も重要なステップは、thoraxes の透過プロシージャです。組織の劣化を避けるためにすぐに進むことが大切...

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開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

この研究は、国立科学工学研究協議会 (レベル、探索許可) およびユニヴェルシテ ・ ド ・ モンクトンから NP に補助金によって賄われていた。1塩基変異は、健康研究 (機構)、ニュー ・ ブランズウィック州イノベーション財団 (NBIF) およびユニヴェルシテ ・ ド ・ モンクトンのカナダの研究所から資金調達のサポートを確認したいと思います。EHC の作業をサポートするには、カナダ、脳カナダ、レベル、カナダ乳がん基金、ニュー ・ ブランズウィック州技術革新基金、ニューブランズウィックの健康研究財団のアルツハイマー協会とユニヴェルシテ ・ ド ・ モンクトン。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
高解像度呼吸計 Oxygraph O2KOroboros Instruments, Innsbruck, Austria10022-02Startup O2K respirometer kit
 
O2K滴定セット Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria20820-03Hamilton syringes with different volumes
 
DatlabソフトウェアOroboros Instruments, Innsbruck, Austria20700Software for data acquisition and analysis
 
先端の細い反磁性鉗子VWR82027-400
 
Secura225D-1S-DQESartorius AG, Goettingen, GermanySemi-micro balance (複数社から配布) 
 
Drosophila melanogaster野生型 w1118Bloomington Drosophila stock Center, IN, USA
保管条件: 24 >C
エチレングリコール-ビス(2-アミノエチルエーテル)-N,N,N′,N′-四酢酸Sigma-AldrichE4378EGTA
保存条件: RT
KOHSigma-AldrichP1767注意: 金属に対して腐食性、急性毒性、 皮膚腐食、深刻な眼の損傷、急性水生毒性.
保存条件:RT
CaCO3Sigma-AldrichC4830
保存条件:RT
Na2ATPSigma-AldrichA2383
保存条件:-20°;C
MgCl2.6H2OSigma-AldrichM9272
保存条件:RT
タウリンSigma-AldrichT0625
保存条件:RT
Na2PhosphocreatineSigma-AldrichP7936
保存条件:-20°C;C
イミダゾールSigma-AldrichI5513
保存条件: RT
DithiothreitolSigma-AldrichD0632
保存条件: 2-8 °C;C
MES水和物Sigma-AldrichM8250
保存条件:
キラジャ樹皮からのRTサポニンSigma-AldrichS7900Saponin
保存条件:RT
溶液調製:保存液1mLに5mg。毎日新鮮なものを準備します。
KClSigma-AldrichP9541
保存条件: RT
KH2PO4Sigma-AldrichP9791
保存条件: RT
HEPESSigma-AldrichH3375
保存条件: RT
BSASigma-Aldrich05470
保存条件: 2-8 °C
Na2S2O4Sigma-Aldrich157953二チオン酸ナトリウム.注意:自己発熱物質および混合物、急性毒性、急性水生毒素慢性水生毒性.
保存条件:
RTピルビン酸ナトリウムSigma-AldrichP2256ピルビン酸
保存条件:2-8°C;C
溶液の調製:ミリQ水中。毎日新鮮なものを準備します。
L-(-)-リンゴ酸Sigma-AldrichM1000リンゴ酸
保存条件:RT
溶液調製:ミリQ水。KOHで中和し、-20°Cで保存します。
アデノシン5'-二リン酸一カリウム塩水和物シグマ-アルドリッチA5285ADP
保存条件:-20>C
溶液の調製:ミリQ水中。KOHで中和し、-80°Cで保存します。
馬の心臓からのシトクロムcSigma-AldrichC7752シトクロム c
保存条件: -20 >C
溶液の調製:ミリQ水中。-20°Cで保管してください。
L-プロリンSigma-AldrichP0380プロリン
保存条件:RT
溶液の準備:ミリQ水。-20°Cで保管してください。
コハク酸ナトリウム二塩基性六水和物Sigma-AldrichS2378コハク酸
保存条件:RT
溶液 調製:MilliQ水で。HClで中和し、-20°Cで保存します。
sn-グリセロール3-リン酸ビス(シクロヘキシルアンモニウム)塩Sigma-AldrichG7886セロール-3-リン酸
保存条件:-20°C;C
溶液の調製:ミリQ水中。HClで中和し、-80°Cで保存します。
シアン化カルボニル4-(トリフルオロメトキシ)フェニルヒドラゾンSigma-AldrichC2920FCCP。注意:急性毒性、皮膚感作性、慢性水生毒性.
保存条件:RT
溶液調製:無水エタノール中。ガラスバイアルに-20°Cで保存します。
ロテノンシグマ-アルドリッチR8875注意:急性毒性、皮膚刺激性、眼刺激性、特定の標的臓器毒性(呼吸系)、急性水生毒性、慢性水生毒性.
溶液調製:無水エタノール中。-20°Cの暗いバイアルで保管します。
マロン酸Sigma-AldrichM1296マロネート。注意:急性毒性、深刻な眼の損傷.
保存条件:RT
溶液の準備:MilliQ水で。KOHで中和します。毎日新鮮なものを準備します。
Streptomyces sp由来のアンチマイシンA。Sigma-AldrichA8674アンチマイシン A. 注意: 急性毒性、急性水生毒性、慢性水生毒性.
保管条件: -20 >C
溶液の調製:無水エタノール中。-20°Cで保管してください。
N,N,N′,N′-テトラメチル-p-フェニレンジアミンSigma-AldrichT7394TMPD
保存条件:RT
溶液調製:MilliQ水で。暗いバイアルで保存してください -20°C。
(+)-ナトリウムL-アスコルビン酸Sigma-AldrichA4034コルビン酸塩
保存条件:RT
溶液の準備:MilliQ水で。暗いバイアルで保存してください -20°C。
NaN3Sigma-AldrichS2002アジ化ナトリウム.注意:急性毒性(経口および経皮)、特定の標的臓器毒性(脳)、水生毒性、慢性水生毒性。
溶液の調製:MilliQ水で。-20°Cで保管してください。
グリアス

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