Method Article

多重の人工細胞の微小環境配列の作製

DOI:

10.3791/57377

⸱

September 7th, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute for Integrated Cell-Material Sciences (WPI-iCeMS), Kyoto University, 2Department of Life Science and Technology, School of Life Science and Technology, Tokyo Institute of Technology, 3Biomaterials Center for Regenerative Medical Engineering, Foundation for Advancement of International Science, 4Faculty of Science and Natural Resources, Universiti Malaysia Sabah, 5Institute for Chemical Research, Kyoto University, 6Ecole Normale Supérieure

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この資料は、物理と化学の高スループット操作キューが模倣した生体内で細胞微小と多重化人工細胞微小環境 (MACME) 配列を準備する詳細な方法についてを説明します単一セルのプロファイリングとひと多能性幹細胞 (hPSCs) に最適な携帯電話環境を識別します。

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

携帯電話微小はさまざまな成長因子、細胞外マトリックスは、細胞間相互作用などの手がかりから成っています。これらの手がかりも仕組まれた、生活システムの細胞機能の調節に重要であります。研究者の数は、必要な細胞の機能と環境要因の関係を明らかにしようとしましたが多くは未知に残る。これは、主にこのような環境の手がかりの in vitroを模倣し、同時に細胞の環境手がかり別のテストに適切な方法論の不足のためです。マイクロ流路と高コンテンツの単一細胞解析、環境の異なる要因によって変更される幹細胞表現型を調べるために続いてナノファイバー アレイの統合プラットフォームを報告する.このプラットフォームのアプリケーションを示すためには、この研究は、ひと多能性幹細胞 (hPSCs) の自己更新の表現型について説明します。多重化人工細胞微小環境 (MACME) 配列の作製におけるナノファイバー配列およびマイクロ構造の作製手順を紹介します。さらに、プロファイルでは、複数の蛍光マーカー、複数の蛍光イメージング統計解析と染色細胞単一細胞の全体的な手順を説明します。

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ひと多能性幹細胞 (hPSCs)1,2限りなく自己更新し、様々 な組織の血統があり、医薬品開発、細胞ベースの治療、ティッシュ エンジニア リング、再生医療に革命を起こす可能性を分化3,4,5,6一般的な文化料理、マイクロタイター プレートは細胞の拡張のための重要な要因である範囲のナノ-マイクロ/メートル、細胞レベルでの正確な物理的および化学的細胞操作を有効にするには設計されていない。自己複製と分化。この欠点に対処するための研究は細胞の運命決定とセル関数4の調節に細胞の微小の役割を検討しました。近年、研究数の増加は、細胞の微小培養7、8を再構築するため行われています。化学9,10、11,12,13の操作を介してこれらの微小のナノ ・ マイクロ加工プロセスを確立しました。 14,15,16,17物理18,19,20環境手がかり。今までは、細胞の運命決定と単一のプラットフォームの機能に関する化学的・物理的環境手がかりの基になるメカニズムを体系的に調査への報告はありませんでした。

堅牢なスクリーニング プラットフォーム (図 1) を確立するシンプルなデザインの原則に基づいて戦略を紹介します。まず、ナノファイバー配列およびマイクロ構造体を使用して汎用性の高い、人工細胞微小を作成するための統合プラットフォームを開発する手順について述べる: 配列の多重化人工細胞微小環境 (MACME)(図 1Aおよび2 a)。ナノファイバーの配列では、ナノファイバー材料と密度のさまざまな組み合わせで 12 の異なる微小があります。静電紡糸ナノファイバーを作製する使用されました。ポリスチレン (PS)21polymethylglutarimide (PMGI)22ゼラチン (GT)23など、ナノファイバー材料が細胞接着と多能性 (のメンテナンスに影響を与える可能性があります彼らの化学的性質をテストするのには設計されていた図 2B)。エレクトロスピニング時間を変更することによって変化したナノファイバーの密度と生成されたナノファイバーの密度によると定義された (D と、リタイア = XLow/低/中/高)。ポリジメチルシロキサン (PDMS) 96 ウェル マイクロ プレートの標準寸法に沿って配置することができます 48 の細胞培養室をかくまっているマイクロ構造が構成されます。PDMS は、マイクロ流体デバイス24を作製する一般的に使用される生体適合性とガス交換ポリマーです。各マイクロ流路設計されました 700 μ m ワイドと 8.4 mm 長く (表 1) の端の 2 つの入り江があった。部屋は高さの異なる (250、500、および 1000 μ m)、初期細胞播種密度 (0.3、0.6、1.2 × 105セル/cm2)、hPSCs25 の分化、増殖、生存と相関する可能性がありますを操作するには(図 2C)。商工会議所に播種された細胞の数室床の上列密度に比例し、したがって初期細胞播種密度が異なる高さ文化区域に同じ細胞懸濁液を導入によって制御されました。すべてのチャンネルは ≥ 250 μ m 高26細胞の低酸素分圧27とせん断応力の28の影響を最小限に抑えるために設計されています。チャネル 250、500、1000 μ m の高さはここで省略表記として X と東カリブ ドル = 低中、高それぞれ。「Material_NF density_Cell 密度」として短くされた明確なナノファイバー密度と初期細胞播種密度と環境 (例えば、GT_HighNF_HighCD: 高密度 GT ナノファイバーと高い初期細胞播種によって特徴づけられる環境密度)。

その後、我々 は環境要因 (図 1B) への応答での細胞行動を体系的に調査する単一細胞解析を実行する方法をについて説明します。証拠の-概念として、hPSC の自己複製に最適な携帯電話環境を識別される、hPSC メンテナンス (図 1B)29のための重要な機能であります。イメージ ベース フローサイトメトリー、統計解析に続いてセルラ環境への個々 の形質細胞の定量的解釈ことができます。細胞機能の変化の中では、このペーパーは hPSC の自己複製を維持するための最適の条件を識別するために詳細な手順を提供します。

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. MACME アレイの作製

注: すべての材料および装置の材料表のとおりです。

  1. ナノファイバーの配列およびマイクロ構造の金型のマスクの準備
    1. ナノファイバーの配列および 3 D コンピュータ ・ グラフィックス ソフトウェア パッケージ (表 1) を用いたマイクロ構造の金型に使用されるマスクの三次元 (3 D) 画像を作成します。
      注:3 D 画像は読み取られ、3 D プリンターによって印刷されます。印刷マスクと金型ステップ 1.1.1 でグラフィック ソフトウェアを使用して定義した 3 D イメージを同じ寸法があります。
    2. マスクと 3 D プリンターを使用してこれらの設計に基づく金型を印刷します。
      注:このプロトコルでは、UV 硬化型樹脂をインク ジェットのような 3 D プリンター使用30だった。プリンターの解像度は 635 × 400 dpi と 15 μ m X、Y、および Z それぞれ、しかし、実際の X Y の解像度は約 4 倍より低かった。
  2. ナノファイバー ・ アレイの作製 (図 3A)
    1. 静電紡糸用高分子溶液を準備します。
      1. 9% (w/v)2213% テトラヒドロ フラン PMGI 液を希釈します。
      2. PS の 0.08 g を溶解 (数平均分子量 (Mn): 130,000) THF:dimethylformamide (1:1 の容積比)21、最終 1 mL (8% (w/v) PS ソリューション) までボリュームを表示する THF:dimethylformamide を追加します。
      3. 水の GT の 0.1 g を溶解: 酢酸酸: 酢酸エチル (1:1.6:2.1 容積比)、水を加える: 酢酸酸: 酢酸エチルとして最終 1 mL (10% (w/v) GT 溶液) までボリュームを持って説明23,31。
    2. ポリスチレン (PS) プレート (127.7 × 85.5 mm)、エレクトロスピニング セットアップで陰極として機能するに 5 nm の厚さで白金薄膜を入金、マグネトロンスパッタ装置を使用します。
    3. 各高分子の溶液を 5 mL 注射器 23 G ステンレス鋼の鈍針装備に読み込みます。
    4. 置き、エレクトロスピニング装置のコレクターから離れて 12 cm 付きシリンジ ポンプの針と注射器を固定します。
    5. 注射針を高電圧の電源に接続し、11 に適用する kV。
    6. 0.2 mL/h の揚水量を設定します。
    7. 30 ° C と 30 < % (v/v) で温度と湿度を保ちます。
    8. 1.2.2 のステップで準備ベース プレートにマスクを配置します。
    9. エレクトロスピニング時間を変更することによって異なる密度でマスクの穴をベース プレートにナノファイバーを作製 (例えば、20、60、90、および 180 s)。
    10. ベース プレートからマスクを削除します。
      注意してください。エレクトロスピニング GT ナノファイバーにエタノールをスプレーすると、マスクと GT ナノファイバーを剥離を避けるためにマスクを削除する前に。
    11. ナノファイバー アレイの作製が完了するまでのステップ 1.2.4-1.2.10 を繰り返します。
    12. 残りの溶剤を蒸発させる 16 h 25 ° C で乾燥器でナノファイバーの配列を配置します。
    13. 0.2 M 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) カルボジイミド塩酸塩 (EDC) と 0.2 M N-ヒドロキシスクシンイミド (NHS) 4 h2325 ° C でエタノール架橋 GT ナノファイバー。
    14. 16 h 25 ° C で GT ナノファイバー 2 回エタノール 99.5% (v/v) と真空乾燥をすすいでください。
  3. マイクロ構造の作製 (図 3B)
    1. エージェントと PDMS ベース 20 g 硬化 PDMS の 2 g をミックス (1:10 の重量比。Pre-PDMS)。24
    2. 手順 1.2 で作製した金型に pre PDMS の混合物を注ぐ。
    3. 解消ガスで 30 分間乾燥器で pre PDMS 混合。
    4. 16 h の 65 ° C のオーブンで pre PDMS 混合物を治します。
  4. MACME アセンブリの配列 (図 3B)
    1. ステップ 1.3.4 金型から、70% (v/v) エタノールできれいに治る PDMS 構造をはがします。
    2. PDMS 構造32の下側に大気中のコロナ放電を扱います。
      注:このプロトコルでは、「ハンディ」コロナ放電装置と、3 または 4 回層の表面全体にコロナを放出します。酸素プラズマ処理は、表面の接着性を変更するコロナ放電に置き換えられました。
    3. すぐにナノファイバー配列を含む PDMS 構造を組み立てます。
    4. オーブンで焼く 65 ° C で 2 日間。

2. MACME 配列に hESCs を読み込む

  1. H9 ヒト胚性幹細胞 (hESCs) の日常文化、xeno フリー セル無血清培養培地の hPSC メンテナンス33 10 μ M Y-27632 岩阻害剤34 (hPSC 培地の名前) 35 mm 細胞培養の添加を維持します。基底膜のゲルのマトリックス (MG) をコーティングした一品。
  2. 通路細胞組換えトリプシン様プロテアーゼを使用してすべての 4 から 7 日間。
  3. 10 分室への読み込みで 99.5% エタノール、MACME 配列を滅菌し、エタノールを削除します。この手順を 3 回繰り返します。
  4. 12 μ MG、10 μ G/ml ビトロネクチン (VN) を紹介してインキュベート室チャンバの表面に塗布し 1 h の 37 ° C のコントロールに 0.1% (w/v) GT 文化室。
    注:このプロトコルでは、GT、VN、MG 細胞接着および文化のための参照タンパク質として選ばれました。ポジティブ コントロールとして使用される MG と VN は hPSC の自己複製を維持するために使用される標準的な細胞培養行列なので二次元の GT コーティング (2DGT)、非コーティング (NC) のネガティブ コントロールとして使用されました。
  5. MACME 配列のすべての部屋に予め温めておいた hPSC 媒体をご紹介します。37 ° C で 30 分間部屋を孵化させなさい
  6. 洗って H9 hESC DPBS と 35 mm ディッシュに培養皿に組換えトリプシン様プロテアーゼの 0.5 mL を追加, 1 分の 37 ° C でと慎重にプロテアーゼ混合のみ培養上清を吸引します。
    注:吸引手順では、セルは分離されていません。
  7. 優しく細胞を分離し、剥離細胞を 15 mL の円錐管に転送する繰り返し皿面に対して媒体を塗布、すぐに hPSC 媒体を追加します。
  8. 3 分吸引上清 200 x g で遠心し、予め温めておいた hPSC 培地で細胞を中断します。
  9. 各流体チャンバーに細胞懸濁液 (1.2 × 106セル/mL) の 12 μ L をご紹介します。
    注:マイクロ ピペットを使用して別から 1 つのチャンバーに細胞を紹介します。室に播種された細胞の数は商工会議所の床の上の列密度に比例して、同じ細胞懸濁液からのサンプルが使用されたにもかかわらず初期細胞播種密度が制御できます。ピペッティングはゆっくり行われますを確認します。読み込み後綿の先端の棒を使用して部屋から余分なメディアを削除します。MACME 配列は一般的に使用される室のピペットと自動ピペット システムの両方と互換性のある、特別な装置は必要ありません。
  10. 4 日間のすべての 12 h と文化 hPSC 媒体を変更します。
    注:媒体の一定のボリューム (1.6、3.2、および 6.4 μ L) の明瞭なサイズのチャンバーを使用して維持されます。細胞培養培地35,36の交換を除いてせん断応力を最小限に抑えるため静的条件下で培養細胞。

3. 定量単一セルのプロファイリング

  1. プレート蛍光細胞染色
    注:     、自己更新 hPSCs の表現型の変化を分析するこのプロトコルは、このプロトコルの 3 つのキーの表現型マーカーを選択: OCT4、5-エチニル-2'-デオキシウリジン (EdU) および多能性・増殖・ アポトーシスの状態を測定するためのアネキシン V、それぞれ (図 2b)。4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)、細胞核を識別するために使用されます。OCT4 は多能性の重要な転写因子の一つであります。
    1. HPSC 培 37 ° C、30 分で 10 μ M エドゥ アルキンの MACME 配列の H9 hESCs を孵化させなさい。
    2. アネキシン結合バッファー (10 mM HEPES (pH 7.4) 140 mM の NaCl、2.5 mM CaCl2) で洗浄した後、オレンジ蛍光色素アネキシン V 共役 20 ° C 15 分で細胞を染色します。
    3. 20 の ° C、15 分間で 4% (v/v) パラホルムアルデヒドで PBS のセルを修正し、PBS のセルを 2 回リンスします。
    4. 0.3% (v/v) トリトン X-100 16 h 20 ° C で PBS を使用してセルを permeabilize します。
      注:パラホルムアルデヒド プラスチック ベース プレートと PDMS マイクロ流路構造の間の結合を弱めます。したがって、3.2.1 のステップで配列から PDMS 層の剥離は、このステップの直後にも実行できます。
    5. 20 ° C、30 分で赤い蛍光染料アジとトリス ベースの反応バッファー内セルを孵化させなさい。
    6. 16 h のための 4 ° C でのブロック バッファー (5% (v/v) ヤギ血清, 5% (v/v) 通常ロバ血清, 3% (w/v) ウシ血清アルブミン、0.1% (v/v)、Tween 20 と 0.1% (w/v) N-ドデシル-β-D-maltoside PBS) で細胞を孵化させなさい。
    7. 0.5% (v/v) トリトン X-100 ソリューション PBS の 16 h のための 4 ° C での人間の OCT3/4 抗体 (マウス IgG) 孵化させなさい。
    8. 37 ° C, 60 分で緑色蛍光色素標識ロバ抗マウス IgG (H + L) とバッファーの妨害で孵化させなさい。
    9. DAPI を PBS で 20 の ° c で 30 分間インキュベートします。
    10. PBS DAPI を PBS に置き換えます。
    11. 画像取得まで 4 ° c の MACME の配列を保持します。
  2. 画像取得 (図 4)
    1. MACME 配列から PDMS マイクロ流路構造をはがします。
    2. MACME 配列から残留の PBS を削除、セルに PBS で 90%(v/v) グリセロールを適用し、染色細胞上 coverslips を配置します。
    3. 逆さ倒立蛍光顕微鏡のステージ上のプレートを設定します。
    4. 顕微鏡のイメージング ソフトウェアによって制御されたすべてのモーターを備えられたコンポーネント (ステージ、フィルター、シャッター、およびフォーカス システム) を使用して自動的に 12 ビットのカラー画像を取得します。
      注意してください。最大照度値付近に到達するこのプロトコルで露光時間を調整 (最高輝度: 4096)、各イメージ、DAPI、OCT4、アネキシン V とエドゥの彩度なしが。
  3. コンピューター誘導画像処理や蛍光信号の定量化 (図 5)
    注:    次の細胞画像解析、前述メソッド37に基づいて実行されます。
    1. カラー画像をグレースケールに変換します。
    2. 大津法と各 DAPI イメージの単一しきい値値を計算し、前景と以下のしきい値を超えるピクセルを分類の背景として。DAPI の蛍光の強度にフォア グラウンドの値が対応することを確認します。
      注:画像解析処理を含む 5 つのステップ。DAPI の主要オブジェクトの識別画像、OCT4、アネキシン V とエドゥ画像内のセカンダリ オブジェクトの識別、およびオブジェクトの強度を測定。図 3は、画像処理の設定にグラフィカル ユーザー インターフェイス (GUI) の画像を提供します。
    3. 各画像を OCT4 とエドゥの蛍光強度を測定します。
    4. 伝搬法とアネキシン V で染色領域を識別して蛍光強度を定量化します。
  4. 3.4 単一細胞イメージングに個々 の細胞表現型を可視化する解析
    1. 中心とし、それらに等しい重量を与えるためにこれらの変数のスケーリング各形質マーカーの入力蛍光強度を標準化します。
    2. 自己組織化マップ (SOM) の解析を実行するには、統計計算とグラフィックス前研究38,39のとおりソフトウェア環境を使用します。
      1. 特徴的な 4 つ「コードブックのベクトル」4 つのマーカー DAPI エドゥ、アネキシン V、OCT4 の蛍光強度に対応する 25 SOM ノードを作成します。
      2. 各微小環境の個々 のセルを「勝利」(最も似ている) ノードに割り当てるしによると、ここで、重量は学習率加重平均を使用して勝利のノードのコードブック ベクトルが更新され、セルの周波数としてプロット (ここでは、として 0.05既定値)。
        注:未満 1000 個の細胞を含む少数の細胞を含むデータセットは SOM の統計的に関連した結果を提供しなかったため部屋からのデータを省略します。
    3. クラスタ リング ソフトウェア40ピアソン相関に基づく平均連携法を用いた SOM ノード値を持つ教師階層的クラスタ リングを実行します。
    4. デンドロ グラムとヒートマップ ビュー41にクラスタ リングのデータをレンダリングします。

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Results

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MACME アレイ: 設計と製作:ナノファイバー技術と組み合わせて、マイクロ細胞培養とスクリーニング以前 hPSC の自己複製と分化35,36 (図 1) のための最適な条件を識別するために用いられる技術を使いました。これは細胞培養チャンバーと条件が正確に制御可能な拡張可能な42,43,44 のため堅牢な高スループット細胞に基づく試金を確立することに適しています。ここでは、単純なナノファイバー堆積法、3 D プリントされたマスクとエレクトロスピニングによるナノファイバー配列が準備されました。マイクロ流体の一部は、簡単に多くの試行錯誤を通じてチャンバー構造を設計する 3 D プリン...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルは、修飾 hPSCs の維持のための堅牢な文化システムを確立する最初のスクリーニング方法をについて説明します。まず、我々 はプラットフォームとして、多様な人工 Ecm と細胞ナノファイバー配列、MACME 配列を持つ統合マイクロ流体デバイスを用いた播種量を準備する方法を説明します。第二に、定量的画像に基づく単一セル フェノタイピングだった実行50個々 の細胞成果と生化学と生物物理学的特徴によって変更の動作を評価します。このプロトコルでは GT ナノファイバーと播種密度高い初期細胞の状態で肯定的な制御 ECM タンパク質から成る環境だった、未分化状態の機能によって特徴付けられる急速な拡散45と安定した OCT4 式51。この観測は、「細胞-細胞外マトリックス」、「細胞」相互作用に関する分子メカニズムは、hPSCs の多分化能に影響を与える可能性を示されました。

この戦略は、ユーザーの目的に合わせてカスタマイズできます。たとえば、...

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Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ありがとう (名) 中辻教授京都大学 iCeMS でヒト ES 細胞を提供します。東京工業大学教授 A. 丸山をありがとうございますまた原子間力顕微鏡の使用の彼をサポートします。惜しみなく学術振興会によって提供された資金 (JSP; 22350104、23681028、25886006、および 24656502)。資金は、新エネルギー ・産業技術総合開発機構 (NEDO) テルモ ライフ サイエンス振興財団によって提供されたも。WPI iCeMS は、世界最高峰国際研究センター (WPI)、教育省、文化、スポーツ、科学、技術 (文部科学省)、日本によってサポートされます。この仕事の一部は京都大学ナノテクノロジー ハブ、日本文部科学省主催「ナノテクノロジー基盤プロジェクト」に産総研ナノ処理設備によって支えられました。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
ポリスチレン (PS)Sigma#182435平均 Mw: 290,000, 平均 Mn: 130,000
ポリメチルグルタリミド (PMGI)MicroChemG113113
ゼラチン (GT)ΣG2625豚の皮から、タイプ A
シルガード 184 シリコーンエラストマーキットDoe Corning Toray#1064291PDMS 硬化剤とシリコーンエラストマーベースは、このキットのコンポーネントです。
OpenSCADこれは、マイクロ流体デバイスの金型を設計するために使用される無料の3Dコンピュータグラフィックスソフトウェア(http://www.openscad.org/)です。
AutoCAD 2014Autodeskナノファイバーアレイの作製に使用されるマスクの設計に使用される3Dコンピュータグラフィックスソフトウェア(https://www.autodesk.com/products/autocad/overview)です。
3Dプリンター、AGILISTA-3000キーエンス
紫外線硬化型樹脂、AR-M2キーエンスアギリスタの3Dプリントに使用されています。
酢酸Sigma#338826≥99.99%
酢酸エチルSigma#270989無水、99.8%
テトラヒドロフラン (THF)Sigma#401757
MSP-30T真空装置マグネトロンスパッタリングマシン
Nunc OmniTrayサーモフィッシャーサイエンティフィック#242811ナノファイバーアレイを作成したポリスチレン製ベースプレートです。このプレートサイズは通常127.7 x 85.5 mmです。
ガン型コロナ放電機神光電機&計装CFG-500この便利なデバイスは、プロトコルのステップ1.5「MACMEアレイの組み立て」でPDMS層の底面を活性化するためのコロナを生成するために使用されます。
5mLシリンジテルモSS-05SZ
ステンレス製鈍針 (23ゲージ)Nipro#2166外径は0.6mm、長さは32mmです。
高電圧電源TechDempaz
1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide, hydrochloride同人堂W001
N-ヒドロキシスクシンイミドSigma#56480
Matrigel hESC-Qualified MatrixCorning#354277このタンパク質は、プロトコールでは基底膜ゲルマトリックスと呼ばれています。
CellAdhere ビトロネクチン、ヒト、溶液STEMCELL Technologies#07004
TeSR-E8STEMCELL Technologies#05940ヒトES細胞およびiPS細胞のメンテナンスのためのフィーダーフリー、ゼノフリー培地
Y-27632和光純薬工業#253-00513
TrypLE発現酵素(1X)、フェノールレッドサーモフィッシャーサイエンティフィック#12605028これは、接着性哺乳動物細胞の解離のための組換えトリプシン様プロテアーゼです。
Click-iT EdU イメージングキット with Alexa Fluor 647 AzidesサーモフィッシャーサイエンティフィックC10086プレート蛍光染色における増殖細胞の蛍光標識は、このキットの製品マニュアルに沿って実施しました。
Annexin V, Alexa Fluor 594 conjugateThermo Fisher ScientificA13203
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)Thermo Fisher ScientificD1306
Oct-3/4 抗体 (C-10)Santa Cruz Biotechnologysc-5279
Donkey Anti-Mouse IgG H&L (DyLight 488)abcamab96875オンプレート蛍光細胞染色に用いる二次抗体です。
ECLIPSE Ti-ENikonCFI Plan Fluor 4倍/0.13 N.A.対物レンズ(ニコン)、CCDカメラ(ORCA-R2、浜松)、水銀ランプ(インテンシライト、ニコン)、XYZ自動ステージ(Ti-S-ERエンコーダ付き電動ステージ、ニコン)、4つの蛍光チャネル用フィルターキューブ(DAPI、GFP HYQ、TRITC、Cy5;ニコン)
NIS-Elements Advanced ResearchNikon自動画像取得に用いる顕微鏡イメージングソフトウェアです。
CellProfiler, Version 2.1.0これは、細胞画像解析(http://cellprofiler.org/)用の無料のオープンソフトウェアです。
RSOM解析は、本ソフトウェアのkohonenパッケージで行います。これは無料で利用できます(https://www.r-project.org/)。
Cluster 3.0これは、オープンソースのクラスタリングソフトウェア(http://bonsai.hgc.jp/~mdehoon/software/cluster/software.htm)です。教師なし階層クラスタリングは、このソフトウェアで実行されます。
Java TreeViewこのオープンソースソフトウェア(http://jtreeview.sourceforge.net/)は、クラスタリングデータをヒートマップと樹状図として視覚化するために使用されます。
H9ヒト胚性幹細胞WiCell Stem Cell BankWA09
オン

References

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