Method Article

多重の人工細胞の微小環境配列の作製

DOI:

10.3791/57377

⸱

September 7th, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute for Integrated Cell-Material Sciences (WPI-iCeMS), Kyoto University, 2Department of Life Science and Technology, School of Life Science and Technology, Tokyo Institute of Technology, 3Biomaterials Center for Regenerative Medical Engineering, Foundation for Advancement of International Science, 4Faculty of Science and Natural Resources, Universiti Malaysia Sabah, 5Institute for Chemical Research, Kyoto University, 6Ecole Normale Supérieure

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この資料は、物理と化学の高スループット操作キューが模倣した生体内で細胞微小と多重化人工細胞微小環境 (MACME) 配列を準備する詳細な方法についてを説明します単一セルのプロファイリングとひと多能性幹細胞 (hPSCs) に最適な携帯電話環境を識別します。

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

携帯電話微小はさまざまな成長因子、細胞外マトリックスは、細胞間相互作用などの手がかりから成っています。これらの手がかりも仕組まれた、生活システムの細胞機能の調節に重要であります。研究者の数は、必要な細胞の機能と環境要因の関係を明らかにしようとしましたが多くは未知に残る。これは、主にこのような環境の手がかりの in vitroを模倣し、同時に細胞の環境手がかり別のテストに適切な方法論の不足のためです。マイクロ流路と高コンテンツの単一細胞解析、環境の異なる要因によって変更される幹細胞表現型を調べるために続いてナノファイバー アレイの統合プラットフォームを報告する.このプラットフォームのアプリケーションを示すためには、この研究は、ひと多能性幹細胞 (hPSCs) の自己更新の表現型について説明します。多重化人工細胞微小環境 (MACME) 配列の作製におけるナノファイバー配列およびマイクロ構造の作製手順を紹介します。さらに、プロファイルでは、複数の蛍光マーカー、複数の蛍光イメージング統計解析と染色細胞単一細胞の全体的な手順を説明します。

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ひと多能性幹細胞 (hPSCs)1,2限りなく自己更新し、様々 な組織の血統があり、医薬品開発、細胞ベースの治療、ティッシュ エンジニア リング、再生医療に革命を起こす可能性を分化3,4,5,6一般的な文化料理、マイクロタイター プレートは細胞の拡張のための重要な要因である範囲のナノ-マイクロ/メートル、細胞レベルでの正確な物理的および化学的細胞操作を有効にするには設計されていない。自己複製と分化。この欠点に対処するための研究は細胞の運命決定とセル関数4の調節に細胞の微小の役割を検討しました。近年、研究数の増加は、細胞の微小培養7、8を再構築するため行われています。化学9,10、11,<....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. MACME アレイの作製

注: すべての材料および装置の材料表のとおりです。

  1. ナノファイバーの配列およびマイクロ構造の金型のマスクの準備
    1. ナノファイバーの配列および 3 D コンピュータ ・ グラフィックス ソフトウェア パッケージ (表 1) を用いたマイクロ構造の金型に使用されるマスクの三次元 (3 D) 画像を作成します。
      注:3 D 画像は読み取られ、3 D プリンターによって印刷されます。印刷マスクと金型ステップ 1.1.1 でグラフィック ソフトウェアを使用して定義した 3 D イメージを同じ寸法があります。
    2. マスクと 3 D プリンターを使用してこれらの設計に基づく金型を印刷します。
      注:このプロトコルでは、UV 硬化型樹脂をインク ジェットのような 3 D プリンター使用30だった。プリンターの解像度は 635 × 400 dpi と 15 μ m X、Y、および Z それぞれ、しかし、実際の X Y の解像度は約 4 倍より低かった。
  2. ナノファイバー ・ アレイの作製 (図 ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MACME アレイ: 設計と製作:ナノファイバー技術と組み合わせて、マイクロ細胞培養とスクリーニング以前 hPSC の自己複製と分化35,36 (図 1) のための最適な条件を識別するために用いられる技術を使いました。これは細胞培養チャンバーと条件が正確に制御可能な拡張可能な42,43,44 のため堅牢な高スループット細胞に基づく試金を確立することに適しています。ここでは、単純なナノファイバー堆積法、3 D プリントされたマスクとエレクトロスピニングによるナノファイバー配列が準備されました。マイクロ流体の一部は、簡単に多くの試行錯誤を通じてチャンバー構造を設計する 3 D プリン.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルは、修飾 hPSCs の維持のための堅牢な文化システムを確立する最初のスクリーニング方法をについて説明します。まず、我々 はプラットフォームとして、多様な人工 Ecm と細胞ナノファイバー配列、MACME 配列を持つ統合マイクロ流体デバイスを用いた播種量を準備する方法を説明します。第二に、定量的画像に基づく単一セル フェノタイピングだった実行50個々 の細胞成果と生化学と生物物理学的特徴によって変更の動作を評価します。このプロトコルでは GT ナノファイバーと播種密度高い初期細胞の状態で肯定的な制御 ECM タンパク質から成る環境だった、未分化状態の機能によって特徴付けられる急速な拡散45と安定した OCT4 式51。この観測は、「細胞-細胞外マトリックス」、「細胞」相互作用に関する分子メカニズムは、hPSCs の多分化能に影響を与える可能性を示されました。

この戦略は、ユーザーの目的に合わせてカスタマイズできます。たとえば、.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ありがとう (名) 中辻教授京都大学 iCeMS でヒト ES 細胞を提供します。東京工業大学教授 A. 丸山をありがとうございますまた原子間力顕微鏡の使用の彼をサポートします。惜しみなく学術振興会によって提供された資金 (JSP; 22350104、23681028、25886006、および 24656502)。資金は、新エネルギー ・産業技術総合開発機構 (NEDO) テルモ ライフ サイエンス振興財団によって提供されたも。WPI iCeMS は、世界最高峰国際研究センター (WPI)、教育省、文化、スポーツ、科学、技術 (文部科学省)、日本によってサポートされます。この仕事の一部は京都大学ナノテクノロジー ハブ、日本文部科学省主催「ナノテクノロジー基盤プロジェクト」に産総研ナノ処理設備によって支えられました。

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
ポリスチレン (PS)Sigma#182435平均 Mw: 290,000, 平均 Mn: 130,000
ポリメチルグルタリミド (PMGI)MicroChemG113113
ゼラチン (GT)ΣG2625豚の皮から、タイプ A
シルガード 184 シリコーンエラストマーキットDoe Corning Toray#1064291PDMS 硬化剤とシリコーンエラストマーベースは、このキットのコンポーネントです。
OpenSCADこれは、マイクロ流体デバイスの金型を設計するために使用される無料の3Dコンピュータグラフィックスソフトウェア(http://www.openscad.org/)です。
AutoCAD 2014Autodeskナノファイバーアレイの作製に使用されるマスクの設計に使用される3Dコンピュータグラフィックスソフトウェア(https://www.autodesk.com/products/autocad/overview)です。
3Dプリンター、AGILISTA-3000キーエンス
紫外線硬化型樹脂、AR-M2キーエンスアギリスタの3Dプリントに使用されています。
酢酸Sigma#338826≥99.99%
酢酸エチルSigma#270989無水、99.8%
テトラヒドロフラン (THF)Sigma#401757
MSP-30T真空装置マグネトロンスパッタリングマシン
Nunc OmniTrayサーモフィッシャーサイエンティフィック#242811ナノファイバーアレイを作成したポリスチレン製ベースプレートです。このプレートサイズは通常127.7 x 85.5 mmです。
ガン型コロナ放電機神光電機&計装CFG-500この便利なデバイスは、プロトコルのステップ1.5「MACMEアレイの組み立て」でPDMS層の底面を活性化するためのコロナを生成するために使用されます。
5mLシリンジテルモSS-05SZ
ステンレス製鈍針 (23ゲージ)Nipro#2166外径は0.6mm、長さは32mmです。
高電圧電源TechDempaz
1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide, hydrochloride同人堂W001
N-ヒドロキシスクシンイミドSigma#56480
Matrigel hESC-Qualified MatrixCorning#354277このタンパク質は、プロトコールでは基底膜ゲルマトリックスと呼ばれています。
CellAdhere ビトロネクチン、ヒト、溶液STEMCELL Technologies#07004
TeSR-E8STEMCELL Technologies#05940ヒトES細胞およびiPS細胞のメンテナンスのためのフィーダーフリー、ゼノフリー培地
Y-27632和光純薬工業#253-00513
TrypLE発現酵素(1X)、フェノールレッドサーモフィッシャーサイエンティフィック#12605028これは、接着性哺乳動物細胞の解離のための組換えトリプシン様プロテアーゼです。
Click-iT EdU イメージングキット with Alexa Fluor 647 AzidesサーモフィッシャーサイエンティフィックC10086プレート蛍光染色における増殖細胞の蛍光標識は、このキットの製品マニュアルに沿って実施しました。
Annexin V, Alexa Fluor 594 conjugateThermo Fisher ScientificA13203
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)Thermo Fisher ScientificD1306
Oct-3/4 抗体 (C-10)Santa Cruz Biotechnologysc-5279
Donkey Anti-Mouse IgG H&L (DyLight 488)abcamab96875オンプレート蛍光細胞染色に用いる二次抗体です。
ECLIPSE Ti-ENikonCFI Plan Fluor 4倍/0.13 N.A.対物レンズ(ニコン)、CCDカメラ(ORCA-R2、浜松)、水銀ランプ(インテンシライト、ニコン)、XYZ自動ステージ(Ti-S-ERエンコーダ付き電動ステージ、ニコン)、4つの蛍光チャネル用フィルターキューブ(DAPI、GFP HYQ、TRITC、Cy5;ニコン)
NIS-Elements Advanced ResearchNikon自動画像取得に用いる顕微鏡イメージングソフトウェアです。
CellProfiler, Version 2.1.0これは、細胞画像解析(http://cellprofiler.org/)用の無料のオープンソフトウェアです。
RSOM解析は、本ソフトウェアのkohonenパッケージで行います。これは無料で利用できます(https://www.r-project.org/)。
Cluster 3.0これは、オープンソースのクラスタリングソフトウェア(http://bonsai.hgc.jp/~mdehoon/software/cluster/software.htm)です。教師なし階層クラスタリングは、このソフトウェアで実行されます。
Java TreeViewこのオープンソースソフトウェア(http://jtreeview.sourceforge.net/)は、クラスタリングデータをヒートマップと樹状図として視覚化するために使用されます。
H9ヒト胚性幹細胞WiCell Stem Cell BankWA09
オン

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  2. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  3. Ameen, C., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment ArrayNanofiber Array FabricationMicrofluidic Structure AssemblyElectrospinning ProcessStem Cell PhenotypingSingle Cell ProfilingFluorescence ImagingSOM AnalysishPSC Self RenewalPDMS Molding

Related Articles