方法論記事

高スループット転送化学遺伝学の画面シロイヌナズナを行う液体処理ロボットの使用を最適化します。

DOI：

10.3791/57393

⸱

2018年4月30日

 ,  , 
1Department of Horticulture, University of Kentucky

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

合成小分子の高スループット画面は、モデル植物シロイヌナズナの行われました。液体ハンドリング ロボットの開発、このプロトコルは、前方の化学遺伝学スクリーン、植物生理に影響を与える小さな分子の発見を加速の速度を上げます。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

化学遺伝学はますます伝統的な遺伝学遺伝子重複や致死性のために手に負えないことができる植物の形質をデコードに採用されています。ただし、生理活性されている合成小分子の確率が低いです。したがって、分子の数千人は、関心のあるものを見つけるためにテストする必要があります。リキッドハンド ロボット システム、エラーの最小化/標準化に加えて化合物ライブラリーをスクリーニングする速度を増加させるサンプルの大規模な数を処理する設計されています。ベンチ上のマルチ チャンネル液体を用いたプロトコルシロイヌナズナ(シロイヌナズナ) に 50,000 の小分子のライブラリの高スループット転送化学遺伝学画面を達成するために最小限必要とする開発されたハンドリング ロボット技術者の関与です。これらのプロトコルで目に見える表現型の変化を引き起こした 3,271 小分子を発見されました。1,563 化合物による短い根、変更 1,148 化合物着色、383 化合根毛と他、非分類変更と発芽抑制 177 化合物。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

過去 20 年間で植物学の分野の研究者長足化学遺伝学アプローチ、フォワードおよびリバースを使用して細胞壁生合成、細胞骨格、ホルモンの生合成の私達の理解を改善し、シグナル伝達、重力屈性、病態、プリン生合成、内1,2,3,4,5を人身売買します。前方の化学遺伝学手法を用いた関心の表現型の識別し特定のプロセスの遺伝的基盤を理解する研究者ができます。逆に、逆の化学遺伝学は、事前に決められた蛋白質ターゲット6と対話する化学物質を求めています。シロイヌナズナは、マップ、および注釈、そのゲノムは小さいためプラント生物学のこれらの発見の最前線にされています。短い世代時間があり、異常な細胞内機械7の識別を容易に利用可能な複数の変異/記者行があります。

前方の化学遺伝学的画面の進行状況、初期審査と金利8化合物のターゲットを決定する 2 つの主要なボトルネックがあります。小分子選択の速度の増加の主要な援助は、自動化と自動機器9の使用です。液体ハンドリング ロボットは小分子の大規模なライブラリを処理するための優れたツールを生物科学10で進行中の運転に尽力しています。ここで提示されたプロトコルは.の急速なペースで生理活性小分子の同定を有効化審査に関連するボトルネックを軽減するために設計されていますこの手法は、労力とも原則として探偵に経済的なコストを減らしている間オペレーターに代わって時間の負担を減少します。

これまでほとんどの化学ライブラリ分析は 10,000 のそして 20,000 化合物として 150,000 と 709,11,12,13,14,ようないくつかのいくつかの間抱いてください。15,16. ここに紹介されたプロトコル (材料表参照) 50,000 化合物の小分子ライブラリで実装されていました、これまでに実施したシロイヌナズナの画面より大きい前方化学遺伝学の一つ。このプロトコルは除草剤検出、発見殺虫剤、殺菌剤に関連した特に効率性の向上と前方の化学遺伝学に関する速度の現在の傾向とフィットを発見、創薬、・がん生物学17 ,18,19,20,21。実装されているシロイヌナズナと、このプロトコルでは、簡単にできる培養細胞、胞子、および可能性のある昆虫に適応 96-、384 - または 1536 ウェル プレート内液体培地で。サイズが小さいため、シロイヌナズナ、96 ウェル プレートでのスクリーニングを受けやすい。ただし、井戸の間で均等に種子を配布するは難しい問題です。手播種は労働集約的、正確、96 ウェルのプレートに種子を分配する機器がありますが、購入する高価。ここでは、精度で小さな損失だけでこのステップを回避できる方法を示す.

このメソッドの全体的な目標は、経由での使用液体ハンドリング ロボットの精度を損なうことがなくより管理しやすいシロイヌナズナに対する大規模な化合物ライブラリーをスクリーニングすることでした。このメソッドを使用して初期希釈シリーズ管理と解剖顕微鏡の下で迅速なサンプルの迅速な視覚化を許可以降の表現型画面を完了するのにかかる時間を減少させることによって研究者の効率を改善します。新規生理活性小分子の同定。図 1は、4 つのステップでこのプロトコルの主要な成果を示しています。

figure-introduction-1
図 1: 前方の化学遺伝学画面の全体的なワークフロー 。4 主な手順のそれぞれのいくつかの詳細を説明するプロトコルの概要です。1: 化学ライブラリ、2 を受信: 3 希釈ライブラリを作る: スクリーニング プレートと 4: インキュベートとスクリーニング プレートを可視化します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

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プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 希釈ライブラリを作成します。

  1. 化合物ライブラリーからの対応するプレートに一致することを確保する 625 希釈ライブラリ プレートを手でラベル付けします。さらに、5 ガロン タンク コンソール ドライブを介してそれらを渡すことによってフローとフロー ホースに、マルチ チャネルのヒント洗浄自動実験器具ポジショナ (ALP) アウトを接続 (材料の表を参照してください)。
  2. コンピューターにアクセスして、水を循環するためにマルチ チップ洗浄 ALP にデバイス コント ローラーの接続を介して洗浄ポンプをオンにします。これは、プロトコルの最後で自動的にオフになります。
  3. 負荷、手、スタッカー 10 によってホテル A ~ D (図 4スタッカー) に以下の順番で、スタッカー カルーセルに接続第 1 室、4 つの 96 ウェル V で AP96 P20 ピペット チップ 1 箱-注文の図書館と 2 つの低いプレートからストック濃度を含む 2 つの上部プレート 2-5 の部屋で底板を空に (図 5スタッカー)。また、部屋 6 で 4 つの 96 ウェル V AP96 P20 ピペット チップの 1 つのボックスをロード-7-9 の部屋で順序付けられたライブラリの 2 つの低いプレート ストック濃度を含む 2 つの上部プレートの底板 (図 5スタッカー) を空にします。
  4. 設定まで、手で P3, P7, 上 300 mL 70 %etoh バスに 300 mL の水貯蔵所をデッキ先端ローダー ALP (TL1) とマルチ チップ洗浄 ALP (TW1) (図 4図 5、デッキ デッキ)。
  5. オペレーティング ソフトウェアを使用して、スタッカー 10 から AP96 P20 ピペット チップを提示し、ヒント ローダー ALP に移動します。
    注意: 1.5 1.12 すべてからロボットの動作ソフトウェアを処理液に行っています。材料表を参照してください。
  6. ホテルから部屋 2 を示し、別のすべての 4 つの 96 ウェル V-下部プレート、デッキに下部を配置する 2 つの P4、P8、P5、P9 のトップ 2 (図 4)。
  7. ヒント ローダー 96 チャンネル 200 μ L の頭の上に ALP AP96 P20 ピペット チップを読み込みます。300 mL の水貯蔵所から 90 μ L を吸引し、96 ウェル V に分配-P4 の底希釈板。P8 の板には、この手順を繰り返します。
  8. P5 の化合物ライブラリー プレートをミックスするには、繰り返し吸引・ 3 回 15 μ L を吐出します。さらに、P5 の化合物ライブラリー プレートから 10 μ L を吸引し、P4 の希釈プレートに 10 μ L を分注します。
  9. 計 3 回繰り返し吸引・ 50 μ L を吐出で P4 のプレートのソリューションをミックスします。一度混ぜ、きれいな吸引・吐出 70% の 70 μ L で AP96 P20 ピペット チップ吸引・吐出水 4 の 110% のボリュームによってマルチ チャンネル チップ洗浄 ALP でそれらを洗浄、P7 から江藤回します。
  10. P8 ・ P9 にプレートの 2 番目のペアについて手順 1.8 1.9 繰り返します。作成される 2 番目の 96 ウェル V-下希釈プレート、プレートから順に下の先頭スタック: P4、P5 P8、P9。その後、1 つの空の静的 ALP; にスタックを配置します。か P1、P2、P6、P10、P11、P12、P13。
  11. ホテルの部屋 5 が空になるまで、手順 1.6 1.10.部屋 6 に到達、ヒント ローダー ALP に新しい AP96 P20 ピペット チップを移動および空の静的 ALP に使用される AP96 P20 ピペット チップを配置する時に 1.5 を手順を繰り返します。
  12. 部屋 9 のホテル A が空になるまで、手順 1.6 1.10.ただし、ホテル B に進むためにプレートとデッキのヒントする必要があります再読み込みするホテル A に
  13. 手で 300 mL 水タンク再入力します。このステップが重要であり、コンピューターのプログラムが一時停止 '続行'、次のステップを実施する前にヒットするユーザーを必要とする、このメッセージの詳細を組み込むことができます。
  14. 残りのホテルは、隣のホテルに進む前に各時間フル 300 mL 水タンクを確保する 1.5 1.13 の手順を繰り返します。

2. スクリーニング プレートにメディア シード混合物を追加します。

  1. ½ 培地と培 (MS) メディアを作る 0.1 %4.3 g MS 塩、MES の 0.50 g 1.0 g 寒天培地 1 L ・ ディ ・ H2o. 添加による寒天培地調整 5.7 を pH が 5 M 水酸化カリウム添加 pH プローブを監視しながら。
  2. 15 と 30 分間 1% の漂白剤と SDS でそれらの動揺によって種子を滅菌し、遠心分離によって水の等しい容積と 4 回をすすぎ。種が生殖不能にされたら、vernilization の 7 日間を 24 時間から 4 ° C でそれらを配置します。シロイヌナズナの生物学的リソース センターでは、殺菌、vernilization、および成長の22の追加のメソッドについて説明します。
  3. 密度 0.1 g/100 mL で手でメディアに種子を追加します。この密度は、96 ウェル プレートのウェルあたり 3-10 種の平均の結果します。
  4. 手で 4 つの 96 ウェル フラットの場所-(図 6、ホテル)、ホテル A の部屋 1 と 2 で底板。ヒント ローダー ALP 上 AP96 P250 ピペット チップのボックスを配置、300 mL 貯水池配合手順で作成したメディア シード混合物 2.1 2.3 の P3、および 300 mL 貯水池 70% EtOH P7 に (図 4、デッキおよび図 6、デッキ)。
    注: を 2.8 2.5 オペレーティング ソフトウェアで行われます。
  5. ホテル A の部屋 1 と 2 を提示し、別の 4 つのプレートのスタック。空の静的アルプス (P4、P5、P6、P8、P9、P10、P11、および P12) のそれぞれに 1 つのプレートを配置します。AP96 P250 ピペット チップ 96 チャンネル 200 μ L の頭の上をロードします。
  6. P3 で 300 mL メディア種子貯蔵所から 90 μ L を吸引し、最初の 96 ウェル フラットに分配-底板。メディア シード混合物を含むすべての 8 つのプレートまで、このプロセスを繰り返します。
  7. 吸引・吐出 70% でいっぱい 300 mL 貯水池から 70 μ L で AP96 P250 ピペット チップをきれい P7 の江藤。吸引・吐出 110% の水量 4 倍でマルチ チャンネルのヒント洗浄の ALP でヒントを洗う、TL1 でヒントをアンロードし、プレートを手で収集します。

3. スクリーニング プレートに小さな分子を追加します。

  1. 手による負荷、ルーム ホテル 1、2 の 96 ウェル V に AP96 P250 ピペット チップのボックス-2、4、6、および 8、客室に 2 つ 96 平底スクリーニング プレート 3、5、7、および 9 (図 4の部屋に底希釈図書館板、スタッカーおよび図 7、ホテル)。さらに、マルチ チップ洗浄 ALP の 5 ガロン タンクからホースを接続します。
    注: 3.10 を通じて 3.2 オペレーティング ソフトウェアで行われます。
  2. P7; で 300 mL 70 %etoh 洗浄タンクを格納するデッキを構成します。メディア シード貯水池は P3 で、デッキ上左ことができます (図 4、デッキおよび図 7デッキ)。さらに、マルチ チャンネル チップ洗浄アルプを通して水を循環させるデバイス コント ローラーの接続を介してコンソール ドライブ オンにします。これは、プロトコルの最後で自動的にオフになります。
  3. ホテルから AP96 P250 ピペット チップ ボックスが表示され、ヒント ローダー ALP に移動します。
  4. 96 ウェル V を提示-デッキと静的 ALP P4 と P8 の上の 1 つの場所の 1 つにホテルの部屋の 2 A から底希釈ライブラリ板。96 ウェル フラットを提示-下スクリーニング プレートから部屋のデッキにホテル A の 3 と静的 ALP P5、P9 の 1 つを配置します。
  5. ヒント ローダー 96 チャンネル 200 μ L の頭の上に ALP AP96 P250 ピペット チップを読み込みます。
  6. 96 ウェル V をミックス-底希釈板の吸引・吐出 50 μ L 3 回で P4。次に、このプレートから 10 μ L を吸引し、96 ウェル フラットに分配-P5 の下スクリーニング プレート。
  7. 吸引・吐出 50 μ L 3 回で P5 の打席でソリューションをミックスします。吸引・吐出 70% の 70 μ L でエタノール AP96 P250 ピペット チップをきれい P7、吸引・吐出量 110% でマルチ チップ洗浄 ALP のヒント水 4 回洗いで貯水池から江藤。
  8. について 2 番目の 96 ウェル V、3.5、3.6 手順-希釈ライブラリの底板 (P8) と 96 ウェル フラット-スクリーニングの底板 (P9)。
  9. スタック 2 96 ウェル V-底希釈ライブラリ板一緒と一緒に 2 つの 96 ウェル フラット底スクリーニング プレート。静的アルプス P1 や P2、P6、P10、P11、P12、P13 にプレートを移動します。
  10. 手順 3.4 3.9 3 回、合計 8 回のプレートのスクリーニングに希釈した化学物質を追加します。最後に、視覚構造をスクリーニング プレートの各ウェルに種子の数をチェックし、滅菌と種子春化シードが 3 つより少ない種とそれらの井戸を補います。

4. インキュベーションとプレートをスクリーニングの可視化

  1. インキュベート 96 ウェル平底スクリーニング プレート 4 日 22 ° c 環境室で 16/8/明暗サイクルの乾燥証拠コンテナー内。96 ウェル平底スクリーニング プレート解剖顕微鏡の下で視覚化します。さらに調査のため異常な表現型すべてを記録します。

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結果

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正確かつ効率的に解剖顕微鏡の下で濃度のスクリーニングで小分子添加に基づく表現型を特徴付ける能力はシロイヌナズナ.の化学遺伝学前方のこのメソッドの最終的な目標50,000 すべての化合物を上映したときに観察された表現型多様ないくつかの異なるクラス (図 2) に分割できます。図 3A-Fは、解剖顕微鏡の下で低倍率で観察された表現型の例を示しています。いくつかの表現型は、決定的でない結果 (図 3, H) を提供しました。これらは化学薬品が低い線量で異なる表現型を提供していないことを確認する低濃度で再テストが必要だった。

悪い結果が発生する原因としては、多くの理由があります。1 つは、種子の発芽...

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ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルは、シロイヌナズナの前方の化学遺伝学画面を達成するために研究者を支援するために設計されています。我々 は、代表的な結果を提供するまでに9,13,23シロイヌナズナの実行最大の前方の化学遺伝学スクリーンの 1 つ 50,000 化合物 (図 2および図 3) の画面から。液体ハンドリング ロボットを使用することより効率的な希釈ライブラリやライブラリ生成のスクリーニング、速度と新規化合物の同定の効率の向上します。高スループット自然に画面に容量を増やすことは、研究者に代わって労働の減少を伴っていた。この手法は、小さな種子または解剖顕微鏡の下で目に見える植物を収容できる 96 ウェル プレートで使用する設計されました。板の大きな種子を収まるように大きな井戸を利用したスループットや設計の変更が必要です。

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

建設的な議論、Jozsef コウノトリ、ミッチェル リッチモンド、Jarrad Gollihue とアンドレア ・ サンチェスに感謝します。表現型の写真のため博士 Sharyn ペリー。この材料は、組合契約第 1355438 の下での国立科学財団によってサポートされる作業に基づいています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
キーボードローカル プロバイダーN/Aプロトコルの設計と操作に使用 Biomek FX
マウスローカル プロバイダーN/Aプロトコルの設計と操作に使用 Biomek FX
コンピューター スクリーンローカル プロバイダーN/Aプロトコルの設計と操作に使用 Biomek FX
コンピューターローカル プロバイダーN/Aプロトコルの設計と操作に使用Biomek FX
DIVERSet 多様なスクリーニングライブラリChemBridgeN/Aケミカルライブラリ
Biomek SoftwareBeckman CoulterN/ABiomek FX
デバイスコントローラーベックマン・コールター719366ウォーターポンプ/チップ洗浄ステーションを操作
スタッカー カルーセル ペンダントベックマン・コールター148240バイオメックの手動操作スタッカー カルーセル
バイオメック スタッカー カルーセルベックマン・コールター148520すべてのFXスタッカーを収納するロータリーユニット 10の
FXスタッカー 10ベックマン・コールター148522スクリーン用部品を収納するエレベーターユニット
FXスタッカー10ベックマン・コールター148522スクリーン用部品を収納するエレベーターユニット
FXスタッカー10ベックマン・コールター148522スクリーン
FXスタッカー10ックマンコールター148522スクリーン用コンポーネントを収納するエレベーターユニット
バイオメックFXベックマンコールターhttps://www.beckman.com/liquid-handlers所望の操作を行うロボット
アキュフレーム職人技術グループ76853-4フレームアーム 部品を適切に配置する
レーミングフィクスチャベックマン・コールター719415アキュフレームのアームを中心
チップウォッシュ ALPベックマン・コールター719662エタノールバスの後にチップを洗浄
チップローダー ALPベックマン・コールター719356空気圧でアームにチップをロード
エアコンプレッサーローカルプロバイダーN/A空気圧チップローディング用の空気を供給し
マスターフレックスコンソールドライブCole-Parmer77200-65ポンプ マルチチャンネル チップ ウォッシャー
エア ホースローカル プロバイダーN/Aエア コンプレッサーからチップ ローダー
ウォーター ホースローカル プロバイダーN/A5 ガロン Reserviour から Tip Washer
スタティック ALP のベックマン コールターBiomek FXスクリーン用機器
5ガロンの予約ローカルプロバイダーN/ Aクリーニングから汚れた水を再循環
Biomek FXグラブが付属し、機器を正しい場所に移動します
96チャンネル200&マイクロ;Lヘッドベックマン・コールターBiomek FXが付属スクリーン内で使用される96個のチップを保持
AP96 P200ピペットチップベックマン・コールター717251 スクリーニングライブラリを作るために使用
96ウェルフラットボトムプレートCostar9018スクリーンの可視化を支援
96 ウェルVボトムプレートCostar3897希釈ライブラリの保管を支援
AlumaSeal 96シーリングフィルムMedSciF-96-100貯蔵のためのシール chemicle libraryおよびdilutionライブラリ
プラスチックジップロックサンドイッチ袋ローカルプロバイダーN/Aスクリーンのための湿気の多い環境を確保するために使用
AP96 P20ピペットのヒントベックマン・コールター717254希釈ライブラリの作成に使用
成長チャンバーパーシバルAR36L3表現型の種子を発芽させるvisulization
へらLocal ProviderN/A井戸に追加する種子を保持し、液体の播種が失敗した種子を適切に
つまようじLocal ProviderN/Aへらから井戸に種子をプッシュします
Murashige and Skoog Basal Salt MixturePhytoTechnology LaboratoriesM524MS Media Mixture
MES Free Acid MonohydrateFisher ScientificICN19483580pHを下げるためにMS培地に追加
寒天粉末アルファ・エーザー9002-18-0種子懸濁液を支えるために培地の厚さを増加
5M KOHSigma-Aldrich484016pHを適切なレベルまで上昇させる
1L 培地保存ボトルコーニング1395-1Lスクリーンに十分な培地を収納
ポリプロピレン製遠心分離管コーニング431470Vernilization pH
デイビスインスツルメンツYX-58825-26
ALP(自動ラボウェアポジショナー)ベックマン・コールターPN 987836Biomek
FX Biomek 2000スタッカーカルーセルのベックマン・コールター609862-AAッカーカルーセル
のセットアップを支援しますBiomek FXおよびFXPラボラトリーオートメーションワークステーションユーザーマニュアルベックマンターPN 987834マルチチャンネルポッドのフレームに使用
Biomek FXPラボラトリーオートメーションワークステーション カスタマースタートアップガイドベックマンコールターPN B32335ABBiomek FX
Biomekソフトウェアのセットアップを支援するために使用されます ユーザーズマニュアルベックマンコールターPN 987835セットアップと理解に使用しますソフトウェア
ベアーム フに ます に水を供給する が付属は、チップグリッパーベックマンコールターのし、プローブ メディアの作成に使用 ユーザーマニュアル 付属機器のセットアップを支援します ユーザーガイド スタコール

参考文献

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