虹彩ルベオーシスのマウス モデルとして虹彩新生血管を穿刺誘発

サマリー

虹彩新生血管、網膜虚血性疾患の一般的な合併症は、血管新生緑内障の視力を脅かす可能性があります。ここでは、血管新生調節物質の非侵襲的評価に使用するかもしれない実験虹彩血管新生を誘導するためのマウス プロトコルについて述べる。

要約

血管新生の非侵襲的評価のための一般的なモデルとしてアイリスの穿刺による血管新生のモデルについて述べる。モデルは血管新生緑内障、糖尿病網膜症の視力を脅かす合併症をターゲットとの関連も。このメソッドは、BALB/c マウスでセルフシール脈絡膜穿刺のシリーズによって虹彩血管反応の誘導に基づいており、マウス眼血管の産後の成熟を活用します。マウスの子犬は、生後 12.5、子犬が当然のことながら生後 24.5 まで彼らの目を開くときから脈絡膜穿刺を受けます。角膜の透明性のため虹彩血管から分析できます簡単に時間生体に非侵襲的方法で。さらに、BALB/c マウスの半透明のアイリスは、最小限の非固有の背景を汚すと詳細な免疫組織学的解析のための flatmounted をすることができます。このモデルで血管新生は、主に炎症によって駆動、プラスミノーゲンの活性化システム。穿刺誘発モデルは小さい齧歯動物、虹彩血管新生を誘導する最初で、直接非侵襲体内血管形成プロセスの解析をできるという利点。また、モデル併用血管新生調節物質、体内視点による血管新生の研究でその可能性を強調します。

概要

虹彩、毛様体と脈絡膜には、目の最も血管柄付きの組織であるブドウが装備されています。虹彩血管は目の前房内の恒常性を維持するために不可欠です。動脈と静脈との間豊富な吻合部の接続の結果として虹彩血管は栄養素自体は、アイリスにだけでなく、目¹の全体の前部に酸素の供給を提供します。

新しい血管や既存の物から血管新生の形成が開発や創傷治癒²などの生理学的プロセスの基礎。血管新生は血管内皮増殖因子 (VEGF)、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤 (PAI) などの標準的な要因だけでなく、複数の炎症性要因の多数によって細かく規制されて、これらの因子の不均衡は病理学的につながることができます。新生³。

目の血管新生増殖糖尿病網膜症 (ラオス) と新生血管緑内障 (NVG) などの視力を脅かす疾患の原因であります。これらの眼の疾患に焦点の血管新生は一般的網膜組織まだ炎症性の不均衡に位置し、後方と前方眼両院で目の血管新生因子は虹彩ルベオーシス、関連付けられている、アイリス病理学的促進⁴臨床用語。これらの病態は、血管新生を受ける成人のアイリスの能力を示しています。マウスで眼の血管は出生後成熟していないと産後の成熟を続けています。開発のこの特徴は、酸素誘起性網膜症、未熟児⁵の網膜症の臨床症状によく似たモデルのマウスモデルで利用されます。さらに、血管新生と炎症創傷治癒のメカニズム⁶、極めて重要な役割を果たすし、創傷治癒の自体が血管新生モデル⁷に関連付けられています。

本研究ではアイリスの穿刺による血管新生のモデルをについて説明します。脈絡膜穿刺は、創傷治癒システムをトリガーすることによって虹彩血管新生を誘導する角膜輪部の外側の限界近く実行されます。角膜の透明性のため虹彩血管をすることができます簡単に生体内で非侵襲的方法で分析します。パンクした目は、プラスミノーゲンを活性化し、炎症マーカー⁸の増加に関連付けられている虹彩の血管床の増加を提示します。提示されたモデル血管新生と血管新生の化合物をスクリーニング研究するための新しいツールとして大きな可能性がありますでき、直接生体内で血管新生のプロセスの可視化。

プロトコル

どちらの性別の BALB/c マウスの子犬は、Ophthalmologic とビジョンの研究における動物の使用のためステートメントに従って使用され、プロトコルは、倫理的な動物の研究のための委員会によって承認されました。マウスが一緒に 12 時間昼/夜サイクル、食料と水への無料アクセスと、看護の母の仔で収容され、毎日監視します。

注: 外科的処置マウスと揮発性のイソフルレン麻酔下で保たれました。眼軟膏は眼の処置中に推奨されません彼らは治療に使用される物質を妨げる可能性があります。必要に応じて、ドライ眼を防ぐために滅菌生理食塩水一滴適用できます。脈絡膜穿刺が自己治癒が、された脈絡膜穿刺中ように注意不妊手術器具で。手術後の治療と生理食塩水を皮下、含まれて、テトラカイン塩酸塩の眼局所投与による鎮痛効果。子犬は、胸骨の横臥加熱パッドの上にきれいなケージで看護の母に返される前に回復を許されました。リットルは、ストレスを避けるために同じ看護母と保たれました。

1. 麻酔

1. イソフルラン麻酔の管理、マウスの小さなマスクをまた結合することを確認し、麻酔誘導室を準備します。
   注: は、すべての該当する倫理的な許可に一致してすべての動物実験を実行します。
2. 3-4% 大気中揮発性イソフルランと誘導室を自動設定します。
   注: 別の麻酔物質をイソフルランよりも他に従って使用する、倫理的な許可。揮発性麻酔薬の手順は、換気のベンチやヒューム フードに行われるべき。
3. 場所誘導室で産後 (P) 12.5 日古い BALB/c マウス子犬。麻酔器誘導室にイソフルランを提供する準備ができたことを確認します。
   注: マウスの子犬は、壊れやすいと襟首最高処理。ストレスを避けるために看護の母、ごみとして子犬を一緒に保ちます。
4. 麻酔が完全に子犬を許可します。
5. そっと首筋をマウスの子犬を拾います。
   注意: 安全で安定した誘導のすべての回で閉じた誘導室。
6. 齧歯動物のマスクにマウスを転送します。マウスを移動するときに誘導室からの麻酔の流れをマスクに切り替えることを確認します。
7. つま先ピンチ麻酔を確認するを実行します。

2. 穿刺手術万国実体写真の下のプロシージャ

1. 横臥床位置にマウスを配置します。マウス眼、万国実体写真のビューのフィールドでは、マスクはよく配置を確認します。
2. 優しく、万国実体写真へ目が向いているのでマウスの頭を回転させます。
   注: での株分け業目の明確な焦点を達成べきであります。40 X を使用して、手術の手順を実行する必要がありますがの位置決めは 16 X の倍率をお勧めします。倫理的な許可許可されている場合、ひげの先端をトリミングで目の可視化を促進できます。
3. 背側と腹側の目にまぶたに下向きの圧力を適用することによって子犬の目を突出する小さな抱き合わせ鉗子を使用して、慎重に。
4. 小鉗子で子犬のまぶたの優しいがしっかりホールドを保ちます。
   注: 眼球突出を実行し、非支配的な手で押し蓋の利き手は穿刺の手順を実行する必要があります、それをお勧めします。
5. 株分け業を使用して、角膜の輪部を探します。アルビノ BALB/c 角膜は、角膜の後方循環の血管叢によって簡単に識別できます。
6. 0.25 mm 直径 (30 G) 斜め針でブドウの後方の輪部の限界近くの小さな脈絡膜穿刺を実行します。針の先端のみを使用・ (0.5 mm 相当)、以上 2 のベベル穿刺ブドウ。脈絡膜穿刺、セルフシール、正常に実行された場合はまだ研究物質の眼内注射は同じの刺し傷を介して管理できます。
   注: マウス眼球解剖を経験、鋸状の毛様体と脈絡膜穿刺が実行されます。注意が必要脈絡膜穿刺を行っている間、レンズの破裂を避けるために。
7. 最初の穿刺部位から目の反対側のサイトの 2 番目の脈絡膜穿刺を実行します。穿刺の位置や距離を最適化します。できるだけ背側にされている 12 の 12 と 6 刺し傷を検討してください。
8. P24.5 まで 4 日毎脈絡膜穿刺の手順を繰り返します。すべての連続した脈絡膜穿刺前に脈絡膜穿刺または明白な減少の眼圧の基礎値の間にレンズの損傷による外傷性白内障の存在に特に注意を払って動物の状態を監視します。最適な効果の前のパンクと同じ位置に繰り返し穿刺の実行を目指してください。

3. 非侵襲体内監視

1. 穿刺や各実験日に注射の前に上記で実行としてマウスを麻酔します。
2. 横臥床位置にマウスでそっと目を突出します。
3. 手術万国実体写真虹彩血管に焦点を当てます。
4. 手術万国実体写真に合うカメラで虹彩血管の写真を撮る。
   注: 必要のない、減数分裂を誘導できますアイリス動物面積を正規化します。減数分裂誘導剤を選択する際は、倫理的な許可を検討してください。慎重にフォーカス虹彩血管のいる場合は、さらに定量分析が容易になります。40 倍の大きさをお勧めします。

4. 手術後のケア

1. 齧歯動物のマスクから BALB/c 子犬を外し、優しく手術マット層加熱パッドに転送。
2. パンクの目に 1% テトラカイン溶液の一滴を適用します。
   注: 他の鎮痛ソリューション使用できます、倫理的な許可によると。
3. 200 μ L の滅菌生理食塩水の皮下注入で動物をメタンハイド レートします。
4. 子犬をマウスのきれいなケージで看護の母に戻ります。
5. リカバリ ・ プロセスを監視します。子犬は、deambulate、くずに戻るはずです。

5. 眼球摘出

1. 頚部転位によって、動物を安楽死させます。プロシージャのより良い視覚化の摘出と堅実の下郭清を実行します。
   注: 異なる安楽死プロシージャを使用できます。倫理的な許可を遵守することをお勧めします。
2. 目に露出を改善するまぶたを離れて引っ張る。
3. 眼蓋の外眼角近く湾曲したボン目はさみで小さなカット (約 0.5 cm) を作る。
4. 軌道に (下) 世界の背後にあるマイクロ抱き合わせ鉗子を挿入するのに露出眼周囲スペースを使用します。
5. 目を囲む組織をつかむし、そっと上に引き上げます。眼球に保持しないでください、目のソケットを使って、周囲の組織に近い。
6. 軌道で、眼球の後ろに湾曲したボン目はさみを挿入します。
7. 目がソケットから外れるまで、周囲の組織をカットします。
   注: この手法の目の解剖学を維持し、その後の分析の利点します。
8. 目から余分な組織の除去に進みます。好ましい場合、固定した後余分な組織の除去を実行できます。
   注: BALB/c マウスは、メラニン欠乏、したがって、コントラスト、暗い背景勧め術を容易にします。
9. 簡単に滅菌リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 満ちているペトリ皿でリンス全体目。
10. 目を 4% 緩衝ホルマリン溶液 1.5 mL を含む 2 mL チューブに転送します。
11. 室温で 6 時間目を修正します。
    注: 固定組織の剛性を付与して虹彩の解剖が容易になります。時間を修正する必要がありますテストおよび調整するさまざまなアプリケーション。

6 万国実体写真下アイリス術

1. 固定液をチューブ 1.5 mL プラスチック パスツール ピペット (または類似した) から外し、新鮮な PBS の 3 回目を洗います。
2. 上向き、前房内で滑らかな乾燥表面 (解剖台) に固定の目を配置します。
3. ベベル 30 G 針と角膜の後方のエントリ ポイントを実行します。
4. 小さな抱き合わせ鉗子で前部を持ち、以前に作成したオープニングに clayman 氏による Vannas ストレートはさみの先端を挿入します。
   注: 非支配的な手で、鉗子と、支配的なシザーを制御することをお勧めします。
5. 回転させながら抱き合わせ鉗子が付いている目は目の後方のセグメントを削除する角膜の周りカット。
   注: に部分的なカットを実行する組織と大きく継続するハサミの内側先端プロセスを容易になります。
6. 下向き、レンズを公開する前のセグメントを配置します。
7. 小鉗子でつかんで、上に引き上げ、レンズを慎重に削除します。
   注: ベベル針は穿刺し、レンズをプルする使用できます。
8. 下向き角膜とビューのフィールドに垂直カット前のセグメントを配置します。
9. 優しく小さな抱き合わせ鉗子で後部毛様体組織をつかみます。
10. Clayman 氏による Vannas まっすぐハサミ小柱網を外し、虹彩を分離する毛様体にちょうど前方トリムに進みます。小柱網が削除されたことを確認します。虹彩は角膜内移動する必要があります。
11. 200 μ L の PBS を含む 96 ウェル プレートに、角膜を押さえ、小さな抱き合わせ鉗子で前方のアイカップを慎重に転送します。
12. 井戸に角膜を保持し続けるそしてピペットで PBS でフラッシュして虹彩を解剖します。
    注: 現在・ 30 G 針の傾斜面にいくつかの小柱網、角膜にアイリスのまま付着可能性がある場合は、虹彩を置換する使用できます。
13. 小さな抱き合わせ鉗子で 96 ウェルから角膜を削除し、孤立したアイリスをおいてさらに分析用の井戸。
14. 4 ° C でフローティング虹彩サンプルを格納します。
    注: 固定されているにもかかわらずアイリス浮遊サンプルの長期保存は推奨されません。

7. 可能な実験的読み出し

1. 切り裂かれたアイリスの血管を可視化、フローティング ホール マウント免疫血小板内皮細胞接着分子 (PECAM)-1 のようなマーカーのための染色法を使用して、または isolectin B4。また、蛍光標識高分子量 dextrans などの血管の染色と全身灌流を使用します。
2. インシリコフラット マウントを実行し、適切なイメージング ソフトウェアにおける虹彩血管を定量化する生体内で非侵襲的画像を使用します。
   注: 血管を定量化することができます、両方との in vitro、デンシトメトリーを使用してまたは血管解析ソフトウェア⁹。
3. 核酸とタンパク質抽出、PCR または免疫ブロット方法、パンクした目の分子生物学的解析を実行する全体の眼球を処理します。
   注: 組織の分子解析は、非固定ティッシュ最高実行行われますが非固定アイリスの解剖が非常に挑戦的な全体の目の使用が以前の研究⁸で統計的に有意な結果を表示しました。

結果

P12.5 でアルビノ BALB/c マウスの子犬 4 毎日繰り返される脈絡膜の穿刺を受けた (実験的一日 0、4、8、12)、P24.5 まで。P27.5 でマウスを安楽死させ、アイリス慎重に解剖 (15 日間実験)。マウスの目の絵は、虹彩血管反応の非侵襲的評価を評価する実験的毎日のすべてのパンク シリーズの前に外科的万国実体写真に装着されたカメラで撮影されました。脈絡膜穿刺は、創傷治癒システム (図 1) をトリガーすることによって、アイリスから血管の応答を誘発します。メラニン欠乏 BALB/c マウス角膜の透明性のため増加虹彩血管は実験日 4 (P16.5) から容易に表示し、プロトコルの全期間にわたって激化します。PECAM 1 免疫組織化学画像コントロール (図 2) と比較してパンクの目のアイリスの全体的な血管の増加を示します。

ディスカッション

この議定書でアイリス脈絡膜穿刺による血管反応の誘導手法を提案する.穿刺は、創傷治癒のメカニズムをトリガーし、アイリス^10,11血管反応を促進します。これはラオスと NVG、目の後方のセグメントで網膜から悪化血管新生反応が虹彩ルベオーシス、アイリス^{12 の増加血管新生の臨床状態で絶頂に達するなど、眼の病態と一致しています。 ,13}。

角膜は無血管透明で独特のコラーゲン構造を所有しています。これに伴い、虹彩血管の可視化のための目の眼の血管造影は生体に非侵襲的方法^13,14虹彩血管の直接可視化によって達成可能であります。大きな目をした動物、複雑な外科的介入が行われた¹⁵

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ボンアイハサミ	Bausch&Lomb	23060
Clayman-Vannas湾曲ハサミBausch	&Lomb	E3383 C
Clayman-Vannas ストレートハサミ	Bausch &カメラのためのLomb	E3383 S
Objectiveアダプター	手作り	N/A	または顕微鏡にカメラを適応させることを可能にする任意のシステム
加熱パッド 100-110ワット	該当なし	なし	ペット/獣医師の店で利用可能
皮下注射器 30g斜めの針	KDM GmBHドイツ	911914
Iphone 4S	アップル	該当なし	または、他の高解像度画像取得デバイス
イソフルラン	バク	スターKDG 9623
マクファーソン抱き鉗子	バウシュ&結束鉗子Lomb	E1815 S
マイクロ結束鉗子	Bausch &Lomb	63140
Minimsテトラカイン塩酸塩	Bausch &Lomb	N/A	1 % (w/v) 点眼薬
中性緩衝ホルマリン	Bioreagens	0018-40
生理食塩水	Fresenius Kabi	210352	0.9 % (w/v) NaCl 注射水
リン酸緩衝生理食塩水	サーモフィッシャーサイエンティフィック	10010023	バランスおよび緩衝PBS pH 7.4
ペトリ皿 10 cm	スターシュテット	83.3902
ペトリ皿 3 cm	スターシュテット	83.3900
セーフシールチューブ 2.0 mL	スターシュテット	72.685.200	またはエッペンドルフスタイルのチューブ
TCプレート 96ウェル	スターシュテット	83.3924
トランスファーピペット 3.5 mL	スターシュテット	86.1171	またはその他のパスツールピペットスタイル
ユニベントール 400 麻酔ユニット	ユニヴェントール リミテッド	N/A	または、揮発性麻酔用の誘導チャンバーとマスクを備えた同等のフローレギュレータ
Wild M650 手術用顕微鏡	Wild Heerbrugg	N/A	またはその他の外科用または拡大用ステレオスコープ

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