若い淡水パール ムール貝原露出メソッドを使用して Bioindication ストリーム環境適合性のテスト

Summary

その場でbioindications は、ムール貝の絶滅危惧種のための環境の適合性の決定を有効にします。貧川の生息地にケージで淡水真珠貝の少年露出に基づく 2 つの方法について述べる。両方のメソッドは、オープンウォーターとハイポレーイック水環境のためのバリアントで実装されます。

Abstract

淡水貝の生息適地の知識は、この絶滅危惧種群の保全に重要なステップです。上貧川流域内でその場で少年の露出テストを実行するためのプロトコルについて述べる 1 か月および 3 か月の期間。少年の成長と生存率を評価する (両方変更) の 2 つの方法が掲載されています。メソッドおよび変更の場所 bioindication の値が異なる、それぞれに利点と制限。砂浜ケージ メソッドは、個人の大規模なセットが、個人の一部のみが測定され、結果、一括で評価されます。メッシュ ケージ法個人を保存し、別々 に、測定が、低個体数が評価されます。オープンウォーターの露出変更が比較的簡単に適用されます。それは、サイトの潜在的な少年の成長を示しています、水毒性試験に有効であることができます。ベッド内露出変更高負荷を必要と、産地の本当の適性をレポートお勧め少年自然の状態に近いです。その一方で、この変更は高ハイポレーイックの環境ばらつきより多くのレプリケーションが必要です。

Introduction

自分の状態の後の評価とその場観察実験生物の露出は、種の環境の質および (特に) サイトの適合性についての情報を取得する方法の 1 つです。動物、そのような bioindication は限られた境界スペースに住んでいることができる小さな無脊椎動物を主に該当します。二枚貝類 (二枚貝綱) の若い段階が 1 つそのような適切な生物グループ^{1 です}。

イシガイ科の二枚貝は、水生生物の生態系²の非常に重要なコンポーネントです。ただし、これらの種が大小の河川を中心に、しばしば批判的に絶滅危惧します。それらのいくつかは 'アンブレラ種' その保全はストリーム全体のビオトープの保全に関連して、包括的なアプローチ³が要求されるとして特徴付けられます。これらの動物には、ムール貝幼虫ホスト⁶となる魚の個体数の変化に水化学^4、5からの多くの環境コンポーネントに関連付けられているライフ サイクルがあります。ムール貝稚魚はしばしばムール貝のライフ サイクルの重要な段階を表しているので、この段階で開発のためのサイトの適合性は地域で成功した種の人口開発にとって重要です。

淡水真珠貝 (FWPM、カハシンジュガヒ;Unionida、二枚貝綱) は、低栄養の欧州ストリームで発生する絶滅危惧二枚貝です。その数は、20 の間に大幅に下落している^{発生エリア全体の世紀}。現在中央ヨーロッパの人口の大半の種繁殖減少主にによって引き起こされること非常に低い彼らの生命の最初の数年の間に稚魚のゼロの生存するようです。少年 FWPMs が浅いハイポレーイック ゾーン⁷、うち条件とその変動はまだ記述の多くの年のために住んでいることが前提です。また、人生の 2 年まで、少年のみの次元を持って約 1 mm まで⁸自然条件下における堆積物の大ボリュームで見つけることは非常に困難。したがって、飼育稚魚の実験は、彼らの生態学的研究に必要です。

淡水パール貝⁹チェコ行動計画、内にある稚魚の何千も毎年半自然繁殖プログラムから上昇。それにもかかわらず、場所および生息地がこれらの少年によって成功した人口サポートまたは最終的な種の再導入に適している質問があります。Bioindicationsその場では答えを見つけることの方法を提示します。

露出ケージの中で少年のムール貝の一貫性のない生存率が少年のムール貝の植物¹⁰としての適性を疑問視する以前の作品のいくつかで観察されたにもかかわらず、いくつかの最近の研究を確認した、水質検査^11,12,13少年露出方法の適用性。さらに、いくつかの要因が株元¹⁴幼虫条件¹⁵の永続効果など、これらの特定の研究の結果を解釈するときに考慮する必要があることが実証されています。

問題が発生のテスト地域で実験的稚魚をインストールする方法とどのように最も効果的に自分の状態を評価します。少年 FWPMs とその場で露出方法の最初の厳格な適用は、Buddensiek¹⁶によって出版されました。少年 FWPM 個人にストリームの自由に流れる水を浴びてシート ケージで保たれ、露出の数週間後、生存と成長の定量を行った。アプローチは元々 半人工飼育法として開発されましたが、著者はまた生息地の要件と水質の評価としての適用性を強調しました。FWPM 稚魚の生存率はヶ月/年間の動物の数が非常に少ない規模で当然のことながら非常に低いが、生き残っていくだろう、生存率はいくつかの週¹⁶のスケールの環境効果の良いマーカーにすることができます。ホールド実験少年ムール貝ストリームの生息地にさらに、彼らの成長と生存率; を評価する研究の年間で、露出方法が開発されました。砂箱¹⁷、湧昇流原理¹⁸と様々 な他の露出 (ガムおよび同僚によって要約) ケージの¹¹に基づくムール貝のサイロが含まれます。稚魚は浅いハイポレーイック ゾーン⁷で自然発生する、ために、ストリームの底内の実験装置のアプリケーションは非常に望ましい。

私たちの記事で FWPMs の 2 つの露光装置の使用を述べる: 私) も bioindication hyporheal 条件でテストを有効にする Buddensiek シート ケージ (「メッシュ檻」) を変更ii) 砂 Hruška ボックス (「砂の檻」)。プロトコルが開いて水とハイポレーイック条件で両方の方法のアプリケーションを説明します (すなわち露出の 4 つのバリエーションについては)。メソッドが徐々 に変更し淡水パール貝⁹チェコ アクション プランにおけるアプリケーションの 15 年以上にわたって拡大し、一連の実験によって検証します。

Protocol

1. メッシュ ケージ

注: は、図 1を参照してください。

1. 材料を準備します。
   1. 実験の実験室の一部のための材料を準備: 川の 1 〜 2 L 水メッシュ ケージ (1 主なプラスチック製のボディ、2 のプラスチック カバー、340 μ m 孔、4 本のボルト 1 檻あたり 4 ナットと特別な技術的なふるいの 2 シート)、メッシュ ケージごとペンチ、スパナ、パスツール ピペット、ストレーナー、デジタル カメラ、三眼ズーム ステレオ顕微鏡、調整グリッド (顕微鏡装置)、直径 50 mm、ビーカー、2 のプラスチック皿の 5 のペトリ皿を解剖 (〜 25 cm × 15 cm × 3 - 5 cm)、およびプラスチック製のボックス。
   2. Hyporheal のインストールを実行するには、ゴム製ホースと 100 μ m 孔メッシュとホヤの瓶を準備します。デバイスの構築、補足のファイル 1 を参照してください: S.1。メッシュ ケージ構造。
2. 下部、中央部メッシュ ケージを組み立てます。個人を保持するケージの部分を組み立てます。1 つのプラスチック製のカバーを最初に挿入し、1 枚プラスチックのふるい、最後に本体の上に。4 本のボルトを使用してそれを保護します。
3. 生物学的材料を準備します。
   1. 川の水を含むプラスチックの皿にメッシュのケージを置きます。部屋が半分満ちているを確認します。FWPM 稚魚を取る (補足のファイル 1 を参照してください: S.6。生物学的材料) - 断熱ボックスのうち、ペトリ皿に入れて。
      メモ: は、急激な温度変化が ~ 2 ° C を超えないことを確認します。
   2. ホヤの瓶とストレーナーを使って、残骸をオフに稚魚をふるいにかけます。
4. 顕微鏡とカメラを設定します。計測器の校正を行う (を参照してください補足 File1: S. 5 。顕微鏡とカメラ)。顕微鏡下で少し水を入れたシャーレを配置します。
5. ケージ (実験室の仕事) に、稚魚を入れてください。
   1. パスツール ピペットを使用して、シャーレから 1 個を外し、慎重にペトリ皿を顕微鏡の下に配置します。
   2. 接眼レンズ (~ 40 倍の倍率) に見ることによって人の適性を確認します。
      注:「良い」フィットネスを意味する個人が移動し、回転側から側に、シェル等から足を削除、パスツールを持つ個人ピペットし、独立したペトリ皿 (FWPM、オープンで、青少年に置いて死んだまたは低いフィットネス プッシュシェル、動かさず、足ない抜きにして、断片化されたシェル、抑え切れず水で浮かぶ人少年、シェル、部分的な脱灰の表示分解)。
   3. 個々 の良いフィットネス 〜 80 X の一定倍率を使用してを表示、FWPM の 2 つの写真を取る。参照してください補足ファイル 1: S.5。顕微鏡とカメラ。写真を保存します。
      注: その長さの良い測定、少年必要があります配置する縦 (側面図)。主な目標は、最大殻長の高品質の画像をその後画像解析を有効にするのには十分に取ることです。
   4. 撮影は、すぐにケージに適切な部屋に少年を挿入します。写真と部屋の番号を記録します。
   5. 各メッシュ ケージで使用されるすべての部屋に対し、この手順を繰り返します。
      注:補足のファイル 1 を参照してください: S.1。メッシュ ケージ構造。
   6. すべての使用室がムール貝の真珠にしたら、ケージにプラスチック製のふるいを置くし、優しくにプラスチック カバーを入れて、ナットと共にすべての部分を固定します。
   7. 部屋の 1 つをホースの両端のいずれかを通過、川床にインストールの場合、この位置でそれを修正して目詰まり防止のメッシュを取るし、下端にバインド (補足のファイル 1 を参照してください: S.1。メッシュ ケージ構造)。
6. ストアの稚魚
   1. 青少年が完全に没頭しているし、発泡の維持、河川水をプラスチックの箱にケージを置きます。インストールの前にインストール (漸進的な冷却、最大 24 h で 5 ° C) の場所で川の in situ水温度に適応稚魚をしましょう。
7. メッシュのケージをインストールします。
   1. 少年鋼のスパイク、ボルト、金属ナット、スパナとメッシュのケージを含むフィールドの材料を準備、フィールドの温度データロガー (テーブルの材料と補足のファイル 1 を参照してください: S.4.2。水の測定)、文字列、カメラ、フィールド プロトコル、ハンマー、スペード。
   2. バリエーション < ~ 2 ° c. の安定した水温を維持するフィールド発泡 (断熱ボックス) のサイトに FWPM 稚魚を輸送します。メッシュのケージの発泡を稚魚 (pH、導電率、等) のローカルの環境条件に適応させる敷地川に入れ。
   3. メッシュのケージをインストールします。
      1. フィールド発泡からメッシュのケージを削除します。2 つの鋼のスパイクをフィールドのデータロガーを固定します。研究領域 (例えば、直射日光ではなく、立っている水ではなく、直接水の流れではなく、メイン ストリームの流れの端) で FWPMs の条件の典型的な生息地にケージを固定します。
         1. 鋼のスパイクのペアを使用して、開いている水の川の底にケージを修正します。川の底とレベルと側面上に置く下流の川の流れ、川の中心方向に 45 ° の角度で。下の水平方向のエッジは、川下部表面上約 10-15 cm をする必要があります。1 つの地域でそれぞれのケージ間 2 m の最小距離を維持 (補足のファイル 1 を参照してください: S.4。メンテナンスをケージ)。
         2. 川床、垂直景観位置、ケージの上部の水平方向のエッジ川下面に平行とチャンバーは、ハイポレーイックであるように、水の流れに垂直で川の底にケージを掘る。深度テストすべきです。実験中に水のサンプリングの可能性の下面の上のゴム製ホースの上部端を取る (補足のファイル 1 を参照してください: S.4.2。水の測定)。
            注: かごの中の定期的な点検・ メンテナンスを実行する勧めします (補足のファイル 1 を参照してください: s. 4。メンテナンスをケージ)。
8. ケージをアンインストールおよび曝露後、稚魚をトランスポートします。このため、水からケージをプルダウンし、漂流材料現在土砂同様のそれらをオフに川の水で満たされたフィールド発泡に入れてください。実験室にすぐにケージを輸送し、枯死率と成長率の評価を開始します。
   注:補足ファイル 1 を表示: S.3。露出時間。場合、ケージと実験室の環境のより 5 ° C の温度差、温度を均等化させるの先決です。
9. 各少年の生活/フィットネスをチェックすることによって実験を評価 (1.5.2 と 1.5.3 の手順を参照してください) ~ 80 X の一定倍率を使用してシャーレに各ライブの少年の 2 つの画像を取ると。フィットネスと写真と部屋の番号を記録します。
10. (すべての方式に共通) 実験を完了します。
    1. 画像解析ソフトウェアで、測定を実行します。(ステップ 1.5.3) 両方入力画像と出力画像 (ステップ 1.9) すべて評価された少年の体サイズ定量画像解析ソフトウェアを使用します。使用最大合計殻長は体サイズの値入力と出力の両方として両方の写真で記録。
    2. テーブル プロセッサに測定値を挿入し、拡張増分値 (%) 各存続のため少年を計算します。
    3. メッシュ ケージすべての実験的個人に生存個体数の比を用いたメッシュ ケージごと生存率 (%) を推定します。
       注: 実験の後に、繁殖プログラムに生存者を返します。
       (補足のファイル 1 を参照してください: S.6。生物学的材料)。

2. サンディ ケージ

注: は、図 2を参照してください。

1. 材料を準備します。
   1. 実験の実験室の一部のための材料を準備: 2 シャーレ (直径 ~8.5 センチメートル)、パスツール ピペット、ストレーナー、川の水の 25 L、プラスチックの箱、ふるい (メッシュ サイズ 1 と 2 mm)、大きなプラスチックの箱 (25 L)、砂浜のケージ (を参照してください補足ファイル 1: S.2。サンディ ケージ建設)、デジタル カメラ、ズーム ステレオ顕微鏡、調整グリッド (顕微鏡装置)、解離性眼ソート研究領域からの川の砂 (ステップ 2.1.3 を参照)、およびプロトコル。材料のテーブルとの補足ファイル 1 を参照してください: s. 2。サンディ ケージ建設。
   2. 分離プロセスのための材料を準備: コンテナー (各ケージ プラス余分な 1 の 1)、2 枚のペトリ皿を円形 (直径 ~ 14 cm)、パスツール ピペット、拡大鏡、および川の水の 1 L。
   3. 2 mm ふるいを通る川の砂をふるいにかけると粒サイズの 1-2 mm. を取得する 1 mm ふるいを乾燥砂し必要になるまで、乾燥した形式で保存します。
2. 少年を取る (補足のファイル 1 を参照してください: S.6。生物学的材料)、発泡のうち、ペトリ皿に入れます。ホヤの瓶とストレーナーを使って、残骸をオフに稚魚をふるいにかけます。
3. 顕微鏡とカメラの設定 (を参照してください補足ファイル 1: S.5 。顕微鏡とカメラ)。
4. ケージ (実験室の仕事) に稚魚を入れてください。
   1. プラスチックの箱に砂のケージを配置します。並べ替えられた砂を散布 (参照ステップ 2.1.3) を砂のケージの高さの 3 分の 1 に。ボックスに水を注ぐ。砂の表面が水面下約 10 mm であることを確認します。川の水の 25 L のボックスに砂浜のケージを挿入し、少年の FWPMs として同じ温度にさらす (補足のファイル 1 を参照してください: S.6.2。生物材料のストレージ) 12 h. の砂の日光への露出を避けます。
   2. 準備 FWPM 少年とペトリ皿を取る。
   3. 接眼レンズに見ることによって個人のフィットネスをチェック (1.5.2 の手順を参照してください)。
   4. 写真のドキュメントを次のように実行します。発見したすべての個人の 1 つの写真を撮る (1.5.3 のステップを参照)、最大の個人の 10 を選択。また、一括評価のための低倍率 (~ 40 X) と共にすべての稚魚の写真を撮るし、10 の最も大きい個人を選択します。すべての写真を保存し、その番号を記録します。
   5. ホヤの瓶を使用して、準備された砂浜ケージ FWPM 少年に移動します。
5. ストアの稚魚
   1. ケージは完全に没頭して、川の水に大きなプラスチックの箱にケージを置くし、発泡でそれを保ちます。その場で川の水の温度 (漸進的な冷却、最大 24 h の 5 ° C) インストールの前に合わせて少年をしましょう。
6. 砂浜のケージをインストールします。
   1. フィールド ・ インストールのための材料を準備: 砂浜のケージ、~ 25 L フィールド発泡、平たい石 (最小重量 1 kg)、ネット (メッシュ サイズ 10 × 10 mm)、ホヤの瓶、フィールド温度データロガー (テーブルの材料と補足のファイル 1 を参照してください。S.4.2. 水の測定)、スペードとフィールド プロトコル。
   2. (~ 2 ° C の変化)、安定した水温を維持するフィールド発泡でサイトに稚魚とケージを輸送します。ローカル環境 (pH、導電率、等) に適応 FWPM 稚魚のように現場で川に砂のケージのフィールド発泡を置きます。
   3. FWPMs (例えば、曲がりくねった、直接水の流れではなく、立っている水ではなく、直射日光ではなくメイン ストリーム フローの端) の条件の典型的な生息地に砂浜のケージをインストールします。
      1. オープンウォーター、網を使用して平たい石に砂のケージを固定し、川の底に配置します。ケージの大きい側が流れに 45 ° の角度を形成することを確認します。
      2. Hyporheal、川の底を水の流れに垂直にしてケージ蓋が川の底面を有するレベル ケージを掘る。
         注: かごの中の定期的な点検・ メンテナンスを実行する勧めします (補足のファイル 1 を参照してください: s. 4。1。 サイトのチェック)。
7. 暴露後ケージとトランスポート稚魚をアンインストールします。
   注:補足のファイル 1 を参照してください: S.3。露出時間。
   1. 水のケージを取り出してオフ漂流物に川の水で満たされたフィールド発泡に入れてください。
   2. 研究室にケージを輸送し、枯死率と成長率の評価を開始します。
      注: ケージと実験室の環境のより 5 ° C の温度差、場合必要があるできるように、温度を均一に
8. 砂から別の FWPM の少年
   1. 水の深さ 50 mm の丸い容器を準備 (各ケージ別) と 1 つの余分なラウンド コンテナー。丸い容器にケージから砂を転送します。旋回運動を使用して、余分な容器に軽い粒子を洗浄します。
   2. このコンテナーのコンテンツを徐々 にサンプル、パスツール ピペットと虫眼鏡を使用してステップバイ ステップの稚魚を検索します。少年をパスツール ピペットを使用してシャーレに入れてください。最初の否定的な発見の後最後の少年を見つけるまでこの手順と、別の 10 倍を繰り返します。各洗浄手順の後に、砂を元のコンテナーにきれいな川の水を追加します。
      注: 特に最初の洗浄した後、内容を調べるし、土砂など他流さバラストのそれをきれいに正しく。
9. 実験を評価します。
   1. 各少年のフィットネスをチェック (2.4.3 と 1.5.2 の手順を参照してください)、生存者の数をカウントします。
   2. 写真を撮る (2.4.4 の手順を参照してください). 個々 の個別に、これは意味はありません個々 の明確なアイデンティティ。また、バルクの写真を撮る、最終結果から 10 最高の成長した個人のサブセットを選択します。
      注: 両方の可能性は、報告値が似ています。1 の可能性が高いワークロードの制限だけでなく、拡大写真、従ってまたより高い精度の利点。
10. 実験を完了します。
    1. 画像解析ソフトウェアで、測定を実行します。次の例外を持つメッシュ ケージ (手順 1.10 参照) で実験を完了: 各少年の成長率 (%) を評価しないが、砂浜のケージの実験では全体としてグループを評価します。
       注: 実験の後生存者に返される繁殖プログラム
       (補足のファイル S.6.1 を参照してください。Se生物材料の異文化)。

Results

FWPMs で、上部ヴルタヴァ川流域 (ボヘミアの森、チェコの環境条件の適合性を調査するため適用された 4 つの bioindication メソッド (オープンウォーター砂浜ケージ、ベッド内の砂浜のケージ、水メッシュ ケージを開くとベッド内のメッシュのケージ)共和国)。この川は、1 つ中央ヨーロッパ¹⁹内 FWPM 残留局所性を表します。特別に選ばれた一連の 4 つの方法の最も重要な側面を示す結果を紹介します。さらに詳しくは、包括的な研究ではČerná らによって¹³。

河川環境を調査した 2 つのレベル。

(I) 河床縦断はメイン ストリームの場所 (サイト A ~ E) で表された、異なる汚染の支流段階 (サイト ...

Discussion

露出時間:

でも 1 ヶ月は目に見える成長地域 (図 3)、局所性評価の迅速かつ容易な検出のため非常に使いやすく、間の違いを反映してメッシュのケージを公開しました。それにもかかわらず、結果の妥当性は、発振することの条件の短期的な状態によって異なります。特に、短い降雨イベントは役割を果たすことができます。対照的に、予測不可能な汚染可能性があります常に記録されません。地域 V (図 4 a)、水の化学分析は強いアンモニア増加¹³の短波長を検出しました。これはおそらく 3 月露出砂浜ケージの死亡率に責任があったが、30 日公開されたメッシュのケージに影響しなかった。

温度の変動は、短期的な露出の結果も影響します。年 (表 1) でメッシュ ケージ暴露中 1 ヶ月の平均温度は異なります。成長率も異なりますどこより高い温度はより高い成長率を伴っ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
生物学的材料のメンテナンスとケア
淡水真珠ムール貝の幼魚	FWPM繁殖プログラムからの		任意のNA
プラスチックボックス	任意の	NA
サーモボックス	MERCI	212,070,600,030	多くの可能性があります。これは一例にすぎません。
フィールドサーモボックス(約25リットル)	食品	任意のNA	コールドボックス(断熱ボックス)、
水	、任意の	NA
シャーレ	、任意の	NA
プラスチックパスツールピペット、バルーンバルブ(ドロッパー)任意の		NA	穴直径1ミリメートル
酸化水素	任意の	NA
プラスチック容器(約50リットル)川の水のために	任意の	NA
プラスチック茶こし器	一般的に使用される	任意の
NAmeshケージ構造
mainプラスチックボディ	任意の	NA
プラクティックは	、任意の	NA
特別な技術ふるい340µをカバーしています。m	シルク &プログレス	ウヘロン 20 T
特殊技術ふるい 100 & マイクロ;m	シルク &プログレス	UHELON 67 M
ゴムホース (直径 5.5 mm)	任意の	NA
スチール ボルト、	任意の	NA
スチール ナット、	任意の	NA
スパナ	任意の	NA
スチール スパイク、	任意の	NA
プライヤー	任意の	NA
ビーカー
プラスチック皿(約25x15x3-5cm)	任意の	NA
潮吹きボトル	任意の	NA
フィールドプロトコル	、任意の	NA
文房具	、任意の	NA
プラスチック容器	、任意の	NA
ストリング	、任意の	NA
ハンマー	任意の	NA
sandyケージの構造および使用
ふるい1 mm	任意の	NA
ふるい2 mm	任意の	NA
特殊技術ふるい340µm	シルク &プログレス	UHELON 20 T
プラスチックボックス、ぴったりとフィットする蓋付き	任意の	NA
ホットメルト接着剤	、任意の	NA
プラスチックボックス(約250 x 150 x 100 cm)、
大きなプラスチックボックス(約25 l)、	任意の	NA
フラットストーン	、任意の	NA
ネット	、任意の	NA
川砂	、任意の	NA
ラウンドコンテナ	、任意の	NA
虫眼鏡カー	ソン	カーソンCP60	多くの可能性があります。これは、
<ストロング>ケージの設置とメンテナンス
フィールド温度データロガーONSET		UA-001-64
http://www.onsetcomp.com/products/data-loggers/ua-001-64 スペード	、任意の	NA
歯ブラシ	、任意の	NA
<ストロング>実験評価
三眼解剖ズーム実体顕微鏡	ブレッサー光学	ICD 10x-160x	多くの可能性があります。これは一例にすぎません。
デジタルカメラ/電子接眼レンズ	ブレッサー光学系	MikroCamLab 5M	多くの可能性があります。これは一例にすぎません。
キャリブレーションガード	Am Scope	SKU: MR100	多くの可能性があります。これは一例にすぎません。
2つの可動式ライトガイド付きの外部電源	アーセナル	K1309010150021	多くの可能性があります。これは一例にすぎません。
イメージソフト	ImageJソフト		可能性はたくさんあります。これは一例にすぎません。
テーブルプロセッサ	MS Excel		多くの可能性があります。これは一例にすぎません。