組換えレトロ ウイルス ・ ウイルス DNA の両端を模倣した DNA オリゴマー、インタソームと呼ばれる酵素によって実行中の複合体を形成できます。Intasomes は、生化学、構造、および速度論的研究に使えます。このプロトコルは、組み立てるし、プロトタイプ フォーミー ウイルス intasomes を浄化する方法をについて説明します。
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この記事について
サマリー
要約
A 宿主のゲノムにウイルスのゲノムの統合機能とレトロ ウイルスのライフ サイクルの必要なステップを定義することです。すべてのレトロ ウイルスは、ホスト DNA ストランド転送として知られているウイルスの共有結合を触媒するインテグラーゼ (IN) 酵素をエンコードします。統合では、組換えレトロ ウイルスの inの in vitroモデル化されるとウイルスのゲノムの端を模倣した DNA オリゴマーを可能性があります。密接に発生する生体内で、統合統合反応を要約するためには、削減塩濃度バッファーで透析による組換えと合成オリゴマーから錯体をまとめます。インタソームと呼ばれる、複雑な統合は、サイズ排除クロマトグラフィーによる精製があります。プロトタイプ フォーミー ウイルス (PFV) 場合、インタソームは 4 量体で、2 つの DNA オリゴマーと容易に単量体と無料オリゴマー DNA から分離されています。PFV intasomes の統合効率は、さまざまなダイナミクスを理解する実験条件やレトロ ウイルスの統合の仕組みの下で試金することがあります。
概要
宿主のゲノムにウイルスのゲノムの統合は、すべてのレトロ ウイルス1のライフ サイクルの必須のステップです。ウイルス酵素インテグラーゼ (IN は) ホスト DNA にウイルスのゲノム DNA の両端の共有結合に参加する触媒作用を及ぼします。細胞感染の間の統合を仲介事前統合複合体の一部です。組み換え体の二重鎖 DNA オリゴマー ウイルス DNA の両端を模倣した複合体2の in vitroターゲット DNA の統合を実行できます。一般的な統合アッセイの in vitro DNA ターゲットとしてスーパー プラスミドを利用します。プラスミッドを両方ウイルス DNA オリゴマー (vDNA) の統合は、リニア製品の結果し、協調統合 (図 2 a) と呼ばれています。統合分析、体外したリラックスしたサークルの結果ターゲット プラスミドに参加して 1 つだけ vDNA と製品をもたらすことがあります。この半サイト統合製品は、 in vitroアッセイのアーチファクトのように見えます。
組換えと vDNA を生体外の統合、実行可能性がありますが、単量体では関連する可視化に覆い隠さときはダイナミクスの研究や統合複合体の構造のための理想的な試薬。精製された統合の複合体、または「intasomes」が動的 1 分子解析または構造研究のため必要です。PFV のと vDNAs が組み立てられる透析によって比較的高い塩濃度バッファーから低い塩分濃度3,4。透析、沈殿物中のフォーム。この沈殿物が透析から削除され、塩濃度が増加します。高い塩濃度は可溶性沈殿物含む PFV intasomes です。サイズ排除クロマトグラフィー (SEC) では、intasomes は、精製します。組換えプロトタイプ フォーミー ウイルス (PFV) では最大 225 μ M5濃度でソリューションの単量体として存在する示されています。秒分別は効果的に (44.4 kDa) の単量体 PFV と無料 vDNA (24.0 kDa) から PFV のと 2 つの vDNAs の四量体が含まれています、PFV intasomes (225.5 kDa) を分離します。PFV intasomes は凍結する可能性があり、-80 ° C でのストレージの少なくとも 6 ヶ月間統合アクティビティを保持します。
組換え PFV intasomes は、アミノ酸置換、トランケーション変異またはフルオロまたはビオチン4,6の付いた vDNAs を含むように修正されるかもしれません。精製 PFV intasomes は容易に体外DNA プラスミドのスーパー ターゲットへの統合を実行します。Intasomes で一括生化学的統合アッセイは、阻害剤、または他の化学添加物の突然変異での効果をテストします。ビオチン化 intasomes は、核酸やタンパク質との親和性を調査する使用できます。PFV intasomes は、vDNA の両端またはターゲット上のインタソーム検索を視覚化する全反射蛍光の接合間の時間を測定する磁気ピンセットによる単一分子顕微鏡分析を可能周囲温度機能DNA6。また、PFV intasomes が最初に構造的に特徴付けられる大幅レトロ ウイルス統合3のフィールドに影響を与えます。
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プロトコル
1. 熱処理 vDNA の
- 結合 1 X 10 のバッファー (10 X 10 株式: 100 mM トリス-HCl、pH 8.0、1 M NaCl 10 mM EDTA)、10 μ M 10 μ M とオリゴ 1 (5' 3' ATTGTCATGGAATTTTGTATATTGAGTGGCGCCCGAACAG、100 μ M 在庫) オリゴ 2 (5' 3' CTGTTCGGGCGCCACTCAATATACAAAATTCCATGACA, 100 μ M 在庫) 1.5 mL の最終巻で.60 0.2 mL ポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) チューブに分注 25 μ L。
注: アプリケーションによっては、オリゴマーは基本 13 1 オリゴの 5' 端から内部アミノ酸 T として fluorophores が付いてまたは 5' 端または Oligo 2 のタグに修正されるかもしれません。変更したオリゴマーは、アニールする前に、高速液体クロマトグラフィー (HPLC) で精製する必要があります。我々 は、10 倍のインタソーム アセンブリ効率が低下 5' 末端 Cy3 や Cy5 蛍光標識オリゴ 2 を発見しました。内部の蛍光ラベリング組立効率を削減していません。 - アニール時間と温度、たちを使用して: 1 サイクル 94.0 ° C、3 分で 99 サイクル (94.0 ° C 1 分、93.6 ° C 1 分) サイクルあたり 0.8 ° C によって両方の温度を減少させる (最後のサイクルは 14.8 ° C 1 分、14.4 ° C 1 分)、4.0 ° C で保存します。
- すべての 60 のチューブからアニーリング反応を組み合わせます。2 0.5 mL 3 kDa 分子量カットオフ (MWCO) 超遠心フィルター濃度単位を 500 μ L をロードします。室温 (RT) で 10 分間 14,000 × g で遠心機で遠心分離による焼鈍 vDNA を集中します。
注: 未透過ボリュームは各濃度単位 〜 50 μ L をする必要があります。 - 流れを破棄します。各フィルター ユニットに残りの焼なまし材 vDNA の 250 μ L を追加します。スピンを繰り返し、流れを破棄します。450 μ L TE の 3 回を洗浄することによりバッファーの TE バッファー (10 mM トリス-HCl、pH 8.0、1 mM EDTA) に交換。
- フィルター ユニットと右で 2 分間 1,000 x g でスピンを反転します。各フィルター ユニットの最終未透過ボリュームは、〜 50 μ L. retentates と 1.5 mL スクリュー キャップ チューブへの転送を組み合わせるべき。
- VDNA の 260 nm の紫外線 (UV) の吸光度を測定します。この値を使用して、最終的なモル DNA 濃度を計算します。この vDNA の吸光係数 (ε260) が 622,803 cm-1 M-1で、その分子量は-20 ° C で 23,972 の da ストア。
2. インタソーム組み立て
- 可能であれば、小さな部屋に可変サーモスタットとインタソーム組み立てを実行します。約 18-22 ° C にサーモスタットを調整します。
注: 我々 の経験で 4 ° C でのインタソーム組み立ては非効率的です。 - 撹拌プレート上の攪拌棒を 2 L のビーカーに透析バッファー (20 mM ビス トリス プロパン、pH 7.5、200 mM の NaCl、2 mM ジチオトレイトール (DTT)、25 μ M ZnCl2) の 1 の L を準備します。少なくとも 6 時間 18-22 ° C の部屋でバッファーを平衡します。
- Intasomes を組み立て、50 mM ビス トリス プロパン、pH 7.5、500 mM の NaCl、120 μ M PFV で、150 μ L の総ボリュームで 50 μ M の vDNA を組み合わせます。
注: PFV のヌクレアーゼ活性7、8を汚染の無料する必要があります。PFV の濃度が 200 μ L に最終巻を増やすことは可能だしは、150 μ L のボリュームで 120 μ M に合わせて希釈も。この手順の重要な要因は、vDNA (2.4: 1,) へのモル比を維持するためにクロマトグラフィーの中に可視化する十分なコンプレックスを持っています。 - 10 mm 6-8 kDa MWCO 透析チューブの二重蒸留水 (ddH2O)、または最高の純度水を持つクリップ 〜 10 センチの部分をきれいに。チューブの一方の端をクリップします。
注: 透析チューブは、ラボのスペースから可能な汚染を防ぐために慎重に取り扱う必要があります。 - 15 mL の透析チューブ洗浄バッファー (50 mM ビス トリス プロパン、pH 7.5、500 mM の NaCl) を確認します。1-2 の mL 洗浄バッファーで 3 回透析チューブの中をすすいでください。ピペット チップ薄膜ゲルと可能な限り洗浄バッファーの多くを削除します。
- 必要に応じて、薄いゲル読み込みヒントは管の端に達する可能性がありますので、透析チューブをカットするのにきれいなかみそり刃やメスを使用します。
- ピペット チップを読み込む薄いゲルと透析チューブ ステップ 2.3 からインタソーム組み立てを転送します。チューブ内に導入された空気の量を最小限に抑え、透析チューブの開放端をクリップします。透析バッファーにチューブを置きます。
- Dialyze チューブの回転が渦ではない穏やかな攪拌と一晩 (16-20 h)。透析の管が水中に、モバイルであることを確認します。約 1 時間後、チューブ内表示されている沈殿物を観察します。
注: Cy3 や Cy5 蛍光ラベル vDNA で沈殿物はより明白です。これは分類される端と内部でラベル付けされた蛍光 vDNA の両方に当てはまります。
3. インタソーム可溶化
- 準備 2 つの広いきれいな表面に新しい剃刀やメス刃を 200 μ L チップの端から 2-4 ミリメートルを削除することによってピペット チップを産んだ。
注: ヒントは、3.3、3.5 の手順で使用されます。 - 透析チューブを透析バッファーから削除します。クリップ近くチューブの端に残っている透析バッファーとインタソーム サンプルの希釈を防ぐために、余分な透析のバッファーを削除するのに小さなピペット チップとマイクロ ピペットを使用します。透析チューブの一方の端からクリップを削除します。
- 使用広いステップ 3.1 氷の上 1.5 mL チューブに透析チューブの中の沈殿物を含むサンプルを転送するからピペット チップを産んだ。回収素材の容量に注意してください。総容積は通常 ~ 140 μ L です。
- 沈殿物のサンプルは、200 mM の NaCl;在庫 5 M NaCl 溶液の適切なボリュームを追加して 320 mM の NaCl の最終的な集中に塩を増やします。たとえば、150 μ L のサンプル、追加 3.9 μ L 5 M NaCl と 1.1 μ L ddH2O 155 μ。 転送氷バケツの最終巻の 4 ° c の冷たい部屋にサンプル。
- 使用広いステップ再懸濁します、ピペッティングにより沈殿物を可溶化し 3.1 からピペット チップを産んだ。少なくとも 1 h. の沈殿物のほとんどは、解決策に行く必要があります観察に 20 分ごとを繰り返します。
注: 沈殿物を再懸濁しますにピペッティング停止できる沈殿物が時間ポイント間もはや著しく低下が明らかであるとき。VDNA ラベルはありませんかと内部のラベルは、沈殿物は目視検査に基づく ~ 90% 削減します。沈殿物はのみ 〜 20% 減の vDNA と分類される Cy5 端の場合vDNA と分類される蛍光体の端を沈殿物のほとんどが可溶化しません。効果的に可溶化沈殿物の量は可変して経験的に決定する必要があります。
4. インタソーム浄化
- 250 mL サイズ排除クロマトグラフィー (SEC) の連続したバッファー (20 mM ビス トリス プロパン、pH 7.5、320 mM の NaCl、10% グリセロール) を準備します。滅菌フィルター バッファー 0.2 μ m フィルター ユニット、4 ° C で保存します。
注: すべての精製工程は 4 ° C の冷たい部屋で実行されます。 - 架橋アガロース SEC カラムの平衡 (直径 = 10 mm 長さ = 300 mm; ボリュームをベッド = 24 mL; サンプル ボリューム = 25 500 μ L; 最大圧力 = 1.5 MPa; 排除限界分子量 = 4 × 107 Da; 分離分子量 5 および 5,000 kDa 間マットの表を参照してください。資料) 秒 0.4 mL/min の流量で連続したバッファーを持つ。
注: この浄化は Superose 12 10/300 GL など Superose 6 増加、44 kDa から 300 kDa を効果的に分離することができる場合、異なるサイズ排除カラムに適応があります。Superose 12 10/300 GL が低い解像度ピークのより多くの重複に 。逆に、Superose 6 増加より高い解像度を持つし、良い分離を提供します。 - 任意の残りの沈殿物をペレットへの 4 ° C で 10 分間の 14,000 x g でおよび microfuge のインタソーム サンプルを遠心します。上清を慎重に取り外します。上清 200 μ L 注入ループ (〜 200 μ L を保持できるチューブ) をロードします。秒の列にサンプルを適用します。
注: より小さい負荷ボリュームで SEC のより高い解像度は、します。 - 秒を実行するバッファーし、270 μ L の 95 分画を収集 25 mL で溶出 SEC クロマト グラムで 3 A280/A260ピーク (図 1) が表示されることを確認します。
注: 最初の集計 (~9.0 - 11.5 mL 溶出)、続いて PFV テトラマー インタソーム ピーク (~12.0 - 14.75 mL 溶出) と無料 vDNA ピーク (~15.0 - 18.0 mL) PFV のモノマーをする必要があります。
5. 統合鎖伝達アッセイ、分数の選択、およびストレージ
- 各インタソーム ピーク画分および 50 の 2 μ L を組み合わせて ng 3 kb スーパー プラスミド DNA (ストック濃度は 50 ng/μ L) 最終的な反応量 15 μ L の反応バッファー (10 mM ビス トリス プロパン、pH 7.5、110 mM の NaCl、5 mM MgSO4, 4 μ M ZnCl2, 10 mM DTT) に。5 分の 37 ° C で孵化させなさい。
- ない追加 PFV インタソームをネガティブ コントロールが含まれます。0.75 μ L プロティナーゼ K との反応 (20 mg/mL 原液) および 0.75 μ L SDS を停止 (10% 原液)。1 h. ストア サンプル後の分析のための-20 ° C で必要に応じての 55 ° C で孵化させなさい。
注: このアッセイは、統合アクティビティの定性的な評価です。この試金の前に、各画分のインタソーム モル濃度は決定されていません。統合鎖伝達アッセイに含まれる分数を格納できる統合まで (夜の記憶を含む) 氷の上活動を確認し、選択した分数は避けよう。ここで我々 は pMP2、pUC19 デリバティブ9を使用します。我々 はまた正常に 5.4 kb のプラスミド pcDNA 3.1 を使用しています。解決できるプラスミド リラックス円、直線とスーパー フォームは、統合のためターゲットとして使用する可能性があります。 - 0.1 G/ml エチジウム ブロマイド (EtBr、10 mg/mL 原液)10で 1 × TAE バッファー (40 mM トリス酢酸、1 mM EDTA) の量 (w/v) agarose のゲルあたり 120 mL の 1% の重量を準備します。アガロース溶液を溶かすし、15 cm × 10 cm ゲル鋳造トレイにそれを注ぐ。5 mm 幅、0.75 mm 厚の井戸と 15 も櫛を挿入します。
注: 狭い井戸は 1.5 mm 厚の井戸と比較してより良いバンド解像度を得られます。 - 常温で固化するゲルを許可します。0.1 μ g/ml の EtBr 1 × TAE でゲルを浸します。
- 5.2 から各統合の反作用に 3 μ L の 50% のグリセロールを追加します。ゲルに全体の反作用ボリュームをロードします。1 μ L のサンプル; のいずれかの側の車線に 10 kb DNA サイズ マーカー (150 ng/μ L ストック濃度) を読み込むつまり、DNA サイズ マーカーはサンプル レーンを逃げする必要があります。
- 外側の車線、6 μ L オレンジ G 染料 (0.25% オレンジ G、30% のグリセロール) をロードします。定電圧、周囲温度 1 h またはオレンジ G 染料前ゲルの端に到達するまでに 10 V/cm (100 V) でゲルを実行します。
- すぐに EtBr (532 nm 励起、610 nm 発光フィルター) を検出する蛍光スキャナーの agarose のゲルをイメージします。適切な fluorophore 設定もイメージの蛍光ラベル vDNAs を使用した場合
注: たとえば、cy5 の組合せを検出する分類される DNA、633 nm の励起と 670 nm 発光フィルターを使用してイメージ。~ 3 kb で協調統合製品 (CI、線形 DNA) サイズに該当する実行、未反応スーパー プラスミド (SC) を高速化 (~ 2 kb) を実行し、半サイト統合製品 (HSI、リラックスした環状 DNA) 遅い (~3.5 kb) を実行する必要があります。〜 40 で未反応の vDNA サイズに該当する実行 bp。 - イメージング ソフトウェア7各レーンのバンドを定量化します。DNA は、CI、HSI、または SC; 各レーンの割合を計算します。vDNA は、この計算には含まれません。
注: 統合の効率、またはリニア製品に変換 SC の分数を協調統合製品 (CI) のピクセル ボリューム 3 つのバンド (HSI + CI + SC) の総画素量で割ることによって求めた。Intasomes は蛍光ラベルである場合、HSI と CI の製品は蛍光を用いた測定も可能性があります。 - 最も協調された統合アクティビティを持っている分数を選択します。
注: 我々 の経験で、統合協調ピークは 4 量体 PFV intasomes として識別された蛋白質のピークと一致します。これらの画分のそれぞれの A280を測定し、最終のインタソーム濃度を計算します。ここで説明した 2 つの vDNAs を持つ野生型 PFV での四量体の ε280が 908,339 cm-1M-1で、分子量は 225.5 kDa。濃度は、SEC クロマト グラム ピークとストランド転送アッセイの同じパターンに従う必要があります。 - 5 μ 因数で各分画を配布し、スナップ液体窒素で凍結します。因数-80 ° C で保存します。ストレージの端数は通常 200-600 nM の間です。
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結果
PFV intasomes は組換えのおよび vDNA から組み立てられて。組立後 intasomes は秒 (図 1) で精製しました。各分画の統合アクティビティを測定する、スーパー DNA ターゲットとアガロースゲル電気泳動 (図 2) とします。このゲルは EtBr (および蛍光、蛍光ラベル vDNA が使用されている場合) を検出する蛍光スキャナーでイメージしています。画像解析ソフトを使用して、統合効率 (図 3) を計算するバンド ピクセル ボリュームを使用できます。分数の最高の統合効率は、冷凍保存用スナップです。冷凍の分数は、組み立てられた intasomes の長期的な保存を可能にする統合アクティビティ (図 4) を保持します。任意のラベルの分子と、vDNA 内の位置のインタソーム組立効率 (
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ディスカッション
レトロ ウイルスをポリコームタンパク統合を実行し、ウイルスのライフ サイクルを続行するウイルスのゲノム DNA との複合体を形成します。テトラマー、octamers、または可能性が高いため多量11,12,13,14インタソームあたり単量体の数があります。PFV intasomes は、組換えウイルスのゲノム DNA を模した二本鎖 DNA オリゴマーとの四量体の両端3.されてこれらの intasomes は、構造と動的研究3,5,13,14で使用されています。
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開示事項
著者が明らかに何もありません。
謝辞
この作品は、NIH の AI099854 とキーに AI126742 によって支持されました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| DNAオリゴマー | IDT | N/A | カスタム DNA オリゴ |
| トリス ウルトラピュア | ゴジラ ファインケミカルズ | UTS1003 | |
| NaCl | P212121 | RP-S23020 | |
| UltraPure EDTA | Invitrogen/Gibco | 15575 | |
| Amicon Ultra 0.5 mL 遠心フィルター | Sigma-Aldrich | Z677094-24EA | 3 kDa MWCO |
| DTT | P212121 | SV-DTT | |
| BIS-TRIS プロパン、>=99.0% (滴定) | Sigma-Aldrich | B6755-500G | |
| ZnCl2 | Sigma-Aldrich | 208086 | |
| MgSO4 | Amresco | 0662 | |
| グリセロール | サーモフィッシャーサイエンティフィック | G37-20 | |
| ゲルローディングのヒント、1 - 200 μL | コーニング | CLS4853-400EA | |
| カミソリブレード;片刃;100/パック;100 フィ | ッシャーサイエンティフィ | 12-640 | |
| 滅菌ディスポーザブルフィルターユニット PES メンブレン付き > 250mL | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 568-0020 | |
| 透析チューブクリップ | Spectrum Labs | 132734 | |
| 6-8 kDa 10 mm 透析チューブ | Spectrum Medical | 132645 | |
| Superose 6 10/300 GL | GE ヘルスケア ライフサイエンス | 17517201 | |
| ハイレゾ標準 アガロース | AGTC バイオプロダクツ | AG500D1 | |
| エチジウムブロマイド | サーモフィッシャーサイエンティフィック | BP1302 | |
| オレンジ G | フィッシャーサイエンティフィック | 0-267 | |
| ハイラダー 10kb、500レーン | デンビルサイエンティフィック | CB4225-4 |
参考文献
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