MALDI-TOF 質量分析法によるマウス組織におけるプロテアーゼの特異性の定量抽出: 特異性変化を引き起こすに PH を操作します。

サマリー

ここでは、飛行時間分析法を用いた抽出提案原油マウス組織におけるプロテアーゼの特異性を決定するためのプロトコル。

要約

プロテアーゼは、タンパク質の活性化/不活性化し、食品の消化を含むいくつかの生物学的機能をあります。プロテアーゼの特異性を識別するは、プロテアーゼの機能を明らかにするため重要です。本研究で提案する手法は、マトリックス支援レーザー脱離イオン化を用いたユニークな基板の分子量を測定することによってプロテアーゼの特異性を決定飛行時間 (MALDI-TOF) 質量分析法。基板には、劈開サイトはアミノ酸で構成されていますが、スペーサーはポリエチレング リコールで構成されています iminobiotin が含まれています。劈開の基板に裂かれたアミノ酸を使用してユニークな分子量が生成されます。この方法のメリットは、原油のサンプルを使用して 1 つの鍋で実施されることがあります、それはまた複数のサンプルの評価に適しているがあります。この資料で述べる組織抽出、異なる pH 条件下で消化器系基板の精製サンプルに消化器系基板の配置を含むマウス肺組織から抽出したサンプルと最適化された簡単な実験方法、と MALDI-TOF 質量分析法による基板の分子量の測定。要約すると、この手法を簡単に複数のサンプル処理のスケール アップが MALDI-TOF 質量分析法による組織の抽出物から派生した原油のサンプルにおけるプロテアーゼの特異性の識別できます。

概要

プロテアーゼはタンパク質を切断し生理学的なプロセスを規制する、特定の時間と場所でプロテアーゼ活性の開始は規制¹。したがって、式と規制されてローカル組織の活動を識別するためにプロテアーゼを検出する手法を開発することが重要です。方法を提案するプロテアーゼの検出と並行してプロテアーゼの特異性を識別するために本研究の目的です。

プロテアーゼの特異性を検出するためのいくつかの方法があります。着色方法がプロテアーゼ²の検出に使用するためよく知られている詳細情報を取得する能力が限られています。ザイモグラフィーはプロテアーゼ³分子量を決定するため使用することができます別の包括的なプロテアーゼ検出法が、基質特異性を調べるには使用できません。プロテアーゼの特異性は、p-ニトロアニリド水解活性⁴など基板を用いた分光測定法と蛍光アッセイ、クマリン基板⁵または⁶蛍光共鳴エネルギー移動 (FRET) 試金を使用してによって決定できます。これらのメソッドは、単一の井戸に含まれる基質の単一特異性検出を有効にします。本研究ではこれらの抽出物を含む複数のプロテアーゼ、さまざまな条件の下でティッシュ エキスのプロテアーゼの特異性を検討します。プロテアーゼ活性は、pH、補酵素、補欠分子族とイオン強度を含むいくつかの要因によって調整されます。プロテオミクスに基づく方法がプロテアーゼの特異性; を識別するために使用されている最近、たとえば、メソッドは Biniossekらによって報告されました。⁷プロテオーム粗抽出物中も基質特異性を決定し、複数アミノ酸シーケンス⁸を認識プロテアーゼの切断活性の正確な定量をことができます。ただし、このメソッドは、多数の試料の分析に適してではありません。対照的に、この手法により複数のサンプルの同時処理および使用のマトリックス レーザー脱離イオン化飛行時間 (MALDI-TOF) サンプル分析のための質量分析法、劈開の簡便・迅速な検出を容易に基板。

このペーパーは、ユニークな基質の分子量を測定する MALDI-TOF 質量分析法を用いたプロテアーゼの特異性を評価する方法を説明します。と一緒に彼らの理論分子量の劈開基板の分子形態は、図 1と表 1に表示されます。以前の研究は、ポリグリシン スペーサーとビオチン⁹; を含む培地を使用しています。ただし、ポリグリシン シーケンスは、グリシンのシーケンスを認識する酵素によって裂かれることがありますので、このような基板が欠点があります。さらに、低回収率アビジンとビオチンとの親和性が高い可能性があります。我々 は、ポリエチレング リコール (PEG)、iminobiotin、および胸の谷間サイト (図 1) を識別することができるアミノ酸で構成されたユニークな基板を合成したこの研究では、これらの欠点を改良します。同じような分子量のアミノ酸を区別するには、PEG スペーサーと劈開サイトでアミノ酸 D-セリンをされました。

基質の N 末端は、原油由来の親和性の浄化を可能にする iminobiotin が付いていた。ビオチンではなく iminobiotin の使用が重要です。ビオチン、アビジンは、ビオチン標識アビジン樹脂基板上の低回収率アビジンの iminobiotin の親和性は pH によって変更できます、結果強い親和性。Iminobiotin というラベルの付いた基板は、アビジンは pH 4 以下の条件で基板上の iminobiotin ラベルを解放しながら pH 9、上記の条件でアビジンにバインドします。したがって、iminobiotin は、アフィニティ精製¹⁰に使われました。要約すると、ユニークな基板を用いたプロテアーゼの特異性を検出するための詳しいプロトコルについて述べる。

プロトコル

動物実験プロトコルは、日本薬科大学倫理委員会で承認され、ケアと日本薬科大学の実験動物の使用のためのガイドラインに従って実施されます。プロトコルは、ICR マウス由来組織抽出液に調整されています。日本 SLC (静岡県) から購入した ICR マウス

1. Iminobiotin 標識基板の作製

基板を受ける 9 fluorenylmethyloxycarbonyl グループ (fmoc 保護) を用いた固相合成-¹¹以下のとおり保護アミノ酸。表 2を使用して、目的のアミノ酸、合成の段階に応じて、使用 fmoc 保護化合物を確認します。

1. N, N-ジメチルホルムアミド (DMF) を合成欄 10 mL で fmoc 保護 NH SAL 樹脂の 0.2 g をグイグイ飲みます。
2. DMF で 30% ピペリジンの 5 mL を追加します。Fmoc 保護グループを裂くことの 10 分のためのソリューションをロックします。
3. チェック trinitrobenzenesulfonic 酸 (TNBS) fmoc 保護胸の谷間テスト¹²: 1% の追加 10 μ L TNBS DMF および 10 x 75 mm²ガラス管、ガラスに転送樹脂量が少ないし diisopropylethylamine (DIPEA) の 10 μ L のチューブします。Fmoc 保護裂かれる樹脂は、オレンジ色を開発しなければなりません。
   1. この結果が負の場合は、1.2-1.3 の手順を繰り返します。
4. 3 回 DMF の 5 mL の樹脂を洗浄します。
5. O-(6-Chloro-1H-benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium ヘキサフルオロリン酸 (HCTU) の 1-0.3 モルの 0.3 モル (ステージ 1 で使用される化合物から始まる)、表 2 に記載されて dmf fmoc 保護化合物 0.3 モルを含む 5 mL を追加します。ヒドロキシ 1 H ベンゾトリアゾール、一水和物 (HOBt)、および diisopropylethylamine (DIPEA) の 0.6 モル。樹脂でカップルに 30 分のためのソリューションをロックします。
   1. TNBS テストにこの手順を確認してください。結果が正の場合、反応が十分に進行していませんし、この手順を繰り返す必要があります。
6. 3 回 DMF の 5 mL の樹脂を洗浄します。
7. 1.2 1.6表 2に従って手順 1.5 で使用される fmoc 保護化合物の変更手順を繰り返すことによって伸長反応を繰り返します。
8. 2.5% 水の 1 mL を追加 1% 2.5% と triisopropylsilane (TIS) エタンジチ (EDT) で切断し、樹脂と保護グループからペプチドにトリフルオロ酢酸。60 分のためのソリューションをロックします。
9. フィルター、および 50 mL のチューブで濾液を収集します。
10. -20 ° C で一晩冷たいジエチル エタノール 40 mL、ストアを追加します。
11. -20 ° c で 30 分間遠心分離機 4,000 x g ペレットを収集します。
12. 3 h のデシケータを使用して、ジエチル エーテルを削除します。
13. 水に 50% アセトニ トリル 1 mL を追加し、原油のペプチドを溶解します。トリフルオロ酢酸を削除するソリューションを凍結乾燥します。この手順を複数回繰り返します。
14. C18 カートリッジ カラムを用いるペプチドを浄化します。
    1. (ACN) アセトニ トリル 3 mL を用いた C18 カートリッジ柱で樹脂をアクティブにします。
    2. 5 ml の 5 %acn、H₂o. で 0.1 %tfa の平衡します。
    3. 原油の合成ペプチドを C18 カートリッジ列に読み込みます。
    4. 5 %acn、H₂o. で 0.1 %tfa の 10 mL で洗浄します。
    5. 3 ml の 60% のサンプルを溶出 ACN、0.1% TFA H₂o.
15. MALDI-TOF 質量分析法による、分子量を測定することにより、ペプチドを確認してください。
    1. ターゲット プレートの溶離液 1 μ L をピペットします。すぐに 0.1% トリフルオロ酢酸 50% アセトニ トリルで飽和 α-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸 (CHCA) ソリューションを追加します。
    2. 乾燥によって混合物を結晶化します。
    3. 計測器メーカーのプロトコルに従って試料のマススペクトルを取得します。
       1. 手動で設定する肯定的な MALDI-TOF 質量分析計は、モードを反映しています。
       2. CHCA を使用して質量分析計のキャリブレーション、ブラジキニン フラグメント 1-7 (モノアイソ分子量 = 756.3997 Da)、アンギオテンシン II (モノアイソ分子量 1,045.5423 Da を =)。
       3. 合成ペプチドの質量スペクトルを取得、理論分子量と比較して評価します。

2. ティッシュ エキスの準備

1. イソフルラン吸入室に男性の ICR マウスを麻酔し、つま先ピンチを介して麻酔深度を確認します。頚部転位によってマウスを安楽死させます。
2. はさみを使用して、剣状突起まで延びた皮膚を介して正中腹部切開を作る。
3. 横隔膜をカットし、すべての肺組織を収集します。組織は、小さな断片に切断します。
4. 冷たい 50 mM トリス緩衝生理食塩水 (pH 7.4) に組織を 3 回洗います。
5. 組織と組織の約 100 mg 12 × 75 mm²ガラス管への転送の重量を量る。
6. 0.3 mL 抽出バッファー (50 mM Tris バッファー pH 7.4 では、0.1% ポリ (オキシ エチレン) オクチルフェニル エーテルを含む) を追加します。
7. 混合ホモジナイザーを使用して肺の組織サンプルをホモジナイズしてください。
   1. 氷のサンプルを冷却します。
   2. 30 20,000 rpm でサンプルを均質ミキサーで s。サンプルが完全に均一になるまでこの手順を繰り返します。
      注: はない 1 分以上継続し、温度の上昇を避けるためにホモジナイズしてください。
8. 1.5 mL チューブの 4 ° C で 10,000 x g で 5 分間遠心し、磨砕液の 1,000 μ L を転送します。
9. 500 μ L の培養上清を新しい 1.5 mL プラスチック チューブに転送します。
10. 10 μ L のサンプルを使用して、ビシンコニン酸 (BCA) などのメソッドまたは Coomassie ブリリアント ブルー (CBB) メソッドを使用して、タンパク質の濃度を測定します。
11. 凍結を防ぐためには、80% のグリセロールを最終濃度 50% のグリセロールのサンプルに追加します。
12. さらに使用するまで-80 ° c のサンプルを格納します。

3. モデル プロテアーゼと組織における基質の消化を抽出します。

1. N-トシル-L-フェニルアラニン クロロメチル ケトン (TPCK) の 0.1 μ g/μ L の 10 μ L を追加-トリプシン、黄色ブドウ球菌 V8 プロテアーゼの 0.1 μ g/μ L または 890 μ L 消化バッファーの組織抽出液の 10 μ g/μ L。
   1. PH によってプロテアーゼ特異性の違いを明らかにするには、3、5、7、および 9 の ph 調整バッファーを使用します。消化バッファーの組成を表 3に示します。
   2. ティッシュ エキス、10 分間水を沸騰 (または 100 ° C で加熱) で準備で非アクティブなプロテアーゼを使用して負の制御を行います。
2. Iminobiotin 標識基板の 10 μ L を追加 (ジメチルスルホキシド (DMSO)、最終濃度に溶解し 100 pmol/10 μ L を =)。
3. Iminobiotin というラベルの付いた基板を消化する 37 ° C で 3 時間孵化させなさい。
4. インキュベーション後、10 分間熱湯で (または 100 ° C で加熱することにより) は基質の消化を停止します。
5. 遠心分離機の 4 ° C で 10,000 x g で 5 分間消化基板
6. 新しい 1.5 mL チューブに上清を移します。

Iminobiotin 標識基板の清浄化

1. 1 M トリス バッファー (pH 9) 含む 0.1% オキシ オクチルフェニル エーテル 50% ストレプトアビジン セファローズ 4 b ビーズの 50 μ L を追加します。
   1. 確実に pH 9 周辺ソリューションに pH 試験紙を使用します。解決の pH が低い場合、pH およそ 9 に 1 M Tris バッファー (pH 9) 含む 0.1% オキシ オクチルフェニル エーテルを追加することによって調整します。この手順は、ストレプトアビジンに iminobiotin ラベルの基質の結合を行うために重要です。
2. 連続穏やかな混合、ストレプトアビジン iminobiotin 標識基板にバインドする回転子ホイールの 4 ° C で一晩インキュベートします。ビーズ、インキュベーション中中断したままにする必要があります。
3. 4 ° C で 10,000 × g で 1 分間遠心上澄みを除去します。
4. 洗ってビーズ 5 回、次のとおり。
   1. ビーズに洗浄バッファー (50 mM Tris バッファー pH 9) の 1,000 μ L を追加します。
   2. 回転ホイールに連続的な穏やかな混合の 4 ° C で 10 分間洗ってください。ビーズ、インキュベーション中中断したままにする必要があります。
   3. 10,000 x g で 4 ° C で 1 分間遠心し、上清を除去します。
5. ビーズに 0.2% トリフルオロ酢酸の 100 μ L を追加します。
   1. PH 試験紙を使って pH 2 以下ソリューションであることを確認します。解決の pH が高い場合は、1% トリフルオロ酢酸を追加して 2 以下に pH を調整します。
6. 回転ホイールに連続的な穏やかな混合と室温で 30 分間インキュベートします。
7. 4 ° c、10,000 × g で 1 分間遠心し、上清を新しい 1.5 mL チューブに転送します。

5. 試料調製及びマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間質量分析 (MALDI-TOF 質量分析法)

注: 次の手順ですべてのソリューションを用意する必要があります高速液体クロマトグラフィー (HPLC)-グレードまたはアミノ酸配列グレードの水。

1. アクティブに C18 ガレージにアセトニ トリル 500 μ L をピペットします。使用されるアセトニ トリルを削除します。この手順を 3 回繰り返します。
2. 0.1% トリフルオロ酢酸の 100 μ L で C18 樹脂を平衡します。溶離液を削除します。この手順を 3 回繰り返します。
3. サンプルをロードし、サンプルをピペットを使用してガレージにバインドします。
4. 0.1% トリフルオロ酢酸の 20 μ L で樹脂を洗浄します。5 回、この手順を繰り返します。
5. 0.1% トリフルオロ酢酸 60% アセトニ トリルの 3 μ L のサンプルを溶出します。MALDI-TOF 質量分析のためのターゲット プレートの溶離液をピペットします。すぐに 0.1% トリフルオロ酢酸 50% アセトニ トリルで飽和 α-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸 (CHCA) ソリューションを追加します。
6. 乾燥によって混合物を結晶化します。
7. 某楽器メーカーのプロトコルに従って試料のマススペクトルを取得します。
   1. 手動で設定する肯定的な MALDI-TOF 質量分析計は、モードを反映しています。
   2. CHCA を使用して質量分析計のキャリブレーション、ブラジキニン フラグメント 1-7 (モノアイソ分子量 = 756.3997 Da)、アンギオテンシン II (モノアイソ分子量 1,045.5423 Da を =)。
   3. ビオチン標識基板の劈開フォームの 900 Da に 700 から質量スペクトルに細心の注意を払って、試料のマススペクトルを取得します。
8. 表 1を使用して検出されたピークを識別します。適切な分子量の検出は、関連するアミノ酸の C 末端で胸の谷間を示します。

結果

モデル プロテアーゼによるプロテアーゼの特異性の同定法の評価

このシステムの効率は、TPCK トリプシンとその基質特異性が得られた V8 プロテアーゼを使用して評価しました。TPCK トリプシンと V8 プロテアーゼが推定されたアミノ酸配列を C 末端のリジンとアルギニン残基とアスパラギン酸とグルタミン酸残基のカルボキシ側でそれぞれ切断します。表 1は、基板の理論分子量を示し、特定プロテアーゼによって切断された断片を消化します。TPCK トリプシンを使用して基板の消化には、839.81 Da と 796.76 Da (図 2 a) に検出できる 2 つの劈開の断片が生成されます。これらのフラグメントの分子量は、リジンとアルギニンの C ターミナルからそれぞれ切断断片の理論分子量に沿って密接にだった。また、V8 プロテアーゼは、分子量 769.78 の Da とグルタ...

ディスカッション

このプロトコルは、原油サンプル ティッシュ エキス由来のプロテアーゼの特異性を識別するために MALDI-TOF 質量分析法を使用し、簡単に複数のサンプル処理のスケール アップがあります。特に、我々 は基質特異性の変化を引き起こすに pH を操作しました。

生物化学結合特異性のために広く使用されているアビジン-ビオチン複合 (ABC) 法では、我々 のプロトコルで利用されました。ABC の強い親和性により、ビオチンにアビジンのバインドはほぼ元に戻せる状態ではありません。いろはの親和性の浄化はそのため非常に効率的です。このため、我々 は、ビオチン標識基板の回収率が低いと予想される報告します。本研究で我々 は、溶出; の低 pH レベルを使用ただし、deglycosylated アビジン ガレージ¹³または単量体アビジン樹脂¹⁴また、ビオチン標識基板を浄化します。

本研究で提案する手法をさまざまな実験的システムやアプリケーションに合わせ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Fmoc-NH-SAL樹脂(-[2,4-ジメトキシフェニル-N-(9-フルオレニルメトキシカルボニル) アミノメチル]フェノキシ樹脂)	渡辺化学工業(株)	A00102
N,N-ジメチルホルムアミド (DMF)	渡辺化学工業	A00185
ピペリジン	ワタナベ化学工業(株)	A00176
トリニトロベンゼンスルホン酸 (TNBS)	和光化学	209-1483
O-(6-クロロ-1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸 (HCTU)	渡辺化学	A00067
1-ヒドロキシ-1H-ベンゾトリアゾール一水和物(HOBt)	渡辺化学工業(株)	A00014
ジイソプロピルエチルアミン(DIPEA)	渡辺化学工業(株)	A00030
トリイソプロピルシラン (TIS)	渡辺化学工業	A00170
エタンジチオール(EDT)	渡辺化学工業(株)	A00057
トリフルオロ酢酸 (TFA)	ミリポア	S6612278 403
アセトニトリル	国産化学	2153025
C18 カートリッジカラム	ウォーターズ	WAT051910
ポリ(オキシエチレン) オクチルフェニル エーテル	和光化学	168-11805	トリトン X-100
ミキシング ホモジナイザー	キネマティカ	PT3100	ポリトロンホモジナイザー
クマシーブリリアントブルー(CBB)-G250	中雷化学	094-09
グリセロール	中雷化学	170-18
N-トシル-L-フェニルアラニン クロロメチルケトン(TPCK)-トリプシン	Sigma-Aldrich	T1426
ジメチルスルホキシド(DMSO)和	光化学	043-07216
ストレプトアビジンセファロース	GEヘルスケア	17-511-01
ZipTipC18	ミリポア	ZTC18S096
&-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸 (CHCA)	Sigma-Aldrich	C2020
MALDI-TOF 質量分析	Bruker Daltonics, Germany	autoflex
2-イミノビオチン	Sigma-Aldrich	I4632
Fmoc-アミノ酸	Watanabe Chemical Co., Ltd.