方法論記事

ホルマリン固定パラフィン包埋 RNA 試料を用いた回顧マイクロ Rna シーケンス: 相補的な DNA ライブラリの準備のプロトコル

DOI：

10.3791/57471

⸱

2018年5月5日

 ,  ,  , 
1Department of Research, Hackensack University Medical Center, 2Department of Medical Sciences, Seton Hall University, 3Department of Epidemiology and Population Health, Albert Einstein College of Medicine, 4Department of Nephrology and Hypertension, Hadassah - Hebrew University Medical Center

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ホルマリン固定パラフィン包埋標本を表す人間の病気の分子バイオ マーカーの貴重な情報源。実験に基づく cDNA ライブラリの準備プロトコル、最初に新鮮な冷凍 RNA をデザインおよび最適化組織からアーカイブされたマイクロ Rna の解析に格納された 35 歳までをご紹介します。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

-アーカイブ、ホルマリン固定を臨床的に分類 (FFPE) 組織のパラフィン包埋は癌の開発の回顧的な分子研究の核酸を提供できます。後で侵襲性疾患を発症した患者から非侵襲や前癌性病変を使用して、遺伝子発現解析は、癌リスクにし向ける初期の分子変化を識別を助けるかもしれない。FFPE 組織から回復した核酸が深刻な物理的な損傷及びその分析が難しく、一般的に適応アッセイ化学修正を受けているも記載されています。マイクロ Rna (Mirna) ただし、少人数のクラスを表す長期保存に耐えるし、FFPE サンプルの解析に成功するまでのみ 〜 18-24 をまたがる RNA 分子のヌクレオチドが示されています。ここで提案する、3' バーコード相補的 DNA (cDNA) ライブラリの準備のプロトコル堅牢かつ再現性の高いアーカイブを使用する場合に示された最近アーカイブされた組織から抽出した低分子 Rna の解析用に最適化されました。35 年間の臨床標本。このライブラリの準備 (18) までの RNA のサンプルを個別 3' バーコード アダプターで結紮、後続の生化学的酵素の準備のため一緒にプールし、侵害された劣化材料の多重解析に適しています分析する前に。すべての浄化は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (ページ) サイズ固有選択とバーコード小さな RNA 種の濃縮が可能で行われます。この cDNA ライブラリの準備は、次世代シーケンサー (NGS) のための材料の最適な量を生成する特定の増幅サイクルの決定により、パイロットのポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) 分の RNA 入力によく合わせられる。このアプローチは、最大 35 年間のアーカイブの標本から劣化した FFPE RNA の使用のために最適化された、NGS の再現性の高いデータを提供します。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mirna がホルマリン固定パラフィン包埋 (FFPE) 標本1,2,3非常によく保存されています。前作はこれら短い規制非コード鎖 RNA 分子の式 FFPE サンプルからの総 RNA を使用して正常に評価することができ、元の新鮮なと比較した場合の関連する遺伝子発現データを示しています。組織4,5,6,7,8。大型メッセンジャー RNAs は、批判的に FFPE ティッシュの処理 (ホルムアルデヒド、熱、乾燥、等)、内因性 RNases、miRNAs (~ 18-24 の小型試験片の年齢によって影響を受けることが示されていると比較した場合ヌクレオチド) の低下に耐性とアーカイブされた標本9の高スループット mRNA 研究をアウトパ フォームする miRNA 発現研究により実証するも、長期的なストレージに弾力性のあるようにするが表示されます。各種マイクロ アレイ技術と最も最近 NGS、大抵小規模解析で行われている、アーカイブの臨床検体を用いた miRNA 発現研究がその 1 つを示したまたは定量的 PCR の試金を多重化これらの試金の10、11,12,13,14の最適化後保存 Mirna の発現を評価するために使用します。

MiRNA 発現の調節不全は、さまざまなひと悪性腫瘍の開発に関連付けられている、アーカイブされた標本に注釈を付けることがある潜在的の巨大な供給臨床的に、明らかになるが、これらの小さな RNA分子は、潜在的な癌バイオ マーカー15,16,17,18の有望なソースを表します。NGS などの高速遺伝子発現技術の使用すべての miRNA 議事 PCR および/またはマイクロ アレイ19など対象のテクノロジと比較したときのグローバルな評価を提供することの利点があります。このため、NGS の古いアーカイブされた標本からの Rna の cDNA ライブラリの準備のために最適化された、手頃な価格で、簡単に該当するプロトコル20大規模な回顧的な研究を可能にする最適化を行った。

以前、現代的な商業キット21をアウトパ フォームすることがわかった古いのアーカイブされた標本からの RNA と DNA の別個の回復の同時 RNA/DNA の抽出のプロトコルを設立しました。この抽出のプロトコルを使用すると、時間の延長期間にアーカイブ FFPE 組織からの総 RNA を取得、miRNAs の 35 年間の臨床検体の保存の NGS の cDNA ライブラリの準備を最適化されています。さらに、最近発行された研究はどこ我々 は cDNA ライブラリからその場で臨床的に分類された乳管癌 (DCIS) 標本を作製、示される定量的 PCR によって検証された発現の Mirna がわかりました特定のマイクロ Rna 発現が変化することは、DCIS 乳癌乳癌を発症しない患者から浸潤病変と比較して発症した患者から病変の検出可能性があります。

最適化できない特許/著作権保護されている試薬の使用と同様、商業キット小さな RNA の cDNA ライブラリの準備のため、その中止の可能性のコストを考慮して以前に発行された適応することにしました実験室ベースし、キット無料 3' バーコード cDNA ライブラリ FFPE 標本でアーカイブされる低分子 Rna の NGS のプロトコル準備、22のサンプル 18 の同時解析を許可します。このプロトコルは FFPE RNA 試料への適応のために重大だった、外観および技術的な評価のチェックポイントと理想的なステップバイ ステップの手順を提供し、妥協の困難な他の情報源への適用の強い可能性があります。RNA の材料を使用します。元の議定書の適用性 (例えばSYBR 金) 蛍光放射能標識サイズ マーカーを置き換えることによって改善された大きいポリアクリルアミドゲルに結紮図書館の選択時に使用される RNA サイズ マーカーを検出します。最適化されたプロトコルはこの 3' が 18 個々 FFPE RNA 標本にバーコードのアダプターの ligation 依存し、5' アダプター結紮術を受けることに一緒にプール、逆転写とパイロットの PCR 解析合わせた最終的な cDNA の拡大高速シーケンサーの大規模な PCR 増幅、浄化、NGS の前にライブラリ。

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プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. すべての試薬およびプライマーの準備

  1. 図 1に示したすべてのプライマーとアダプターを注文します。
  2. それぞれの個々 の結紮でスパイクするカクテル株式キャリブレータを準備します。
    1. RNase フリーの水で 0.5 μ M にキャリア オリゴヌクレオチド (図 1) を再懸濁します。0.5 μ M キャリア オリゴヌクレオチド ソリューションを使用して 100 μ m まで 10 キャリブレータ オリゴヌクレオチド (図 1) を再懸濁します。
    2. 100 μ M カクテル キャリブレータ株式を取得するシリコーンの遠心で 10 キャリブレータのそれぞれの 10 μ L を組み合わせて、-20 ° C で保存する 0.026 nM ソリューションを準備
  3. 50 μ M (図 1) の最終的な集中に RNase フリー水と 20 のユニークな凍結乾燥、adenylated 3' アダプターを希釈します。
    注: 個々 のシリコーン チューブ内の各アダプターから 2.5 μ 因数を準備し、2 年間-80 ° C で保存することをお勧めします。
  4. 脱塩 19 nt 3 を再懸濁します ' アダプターと 24 nt 3' アダプター サイズ マーカー オリゴヌクレオチド 250 ng/ml (図 1)。
  5. RNAse フリー水で 100 μ M の高速液体クロマトグラフィー精製 5' アダプターを再懸濁します。100 に 5' と 3' プライマーを再停止しなさい μ M RNase フリー水 (図 1) を使用しています。
    注: 因数 1-2 実験と-80 ° C でストアに必要な量のすべてのオリゴヌクレオチド
  6. (PAA) ゲル 1% 98.8% ホルムアミドを組み合わせることでローディングの染料 (v/v) 0.5 M Na2H2 EDTA、pH 8.0、および 0.2% ブロモフェノールの青変性ポリアクリルアミドゲルを準備し、-80 ° C で 1 ml を設定
    1. ヌクレアーゼ フリー水 50 mL に Na2H2 EDTA 粉末 18.6 g を追加して 0.5 M Na2H2 EDTA 溶液を準備します。PH 8.0 に到達する NaOH のペレットを追加します。0.5 M Na2H2 EDTA、pH 8.0 原液を取得する 100 mL にボリュームを調整します。
    2. ブロモフェノール別 15 mL チューブに青の 15 mg の重量を量る。ヌクレアーゼ フリー水の 600 μ L を追加します。脱イオン ホルムアミドの 14.25 mL を追加します。0.5 M Na2H2 EDTA、pH 8.0 ソリューションの 150 μ L を追加します。
    3. 因数-80 ° C で 1 mL 因数で 15 mL の PAA の最終的な解決
  7. Agarose のゲル 0.2% ブロモフェノールの青、0.2% キシレンシアノール FF や Na2H2 50 ミリメートルの EDTA、pH 8.0、20% を組み合わせることでローディングの染料 × 5 を準備 Ficoll 型 400。
    1. ナ2H2の 1.86 g を再停止しなさい-EDTA はヌクレアーゼ フリー水常温 (RT) マグネチックスターラーで 400 mL のビーカー 50 mL に。PH 8.0 に到達する NaOH のペレットを追加します。50 mM Na2H2 EDTA 溶液を得るために 100 mL に到達するヌクレアーゼ フリー水を追加します。
    2. ブロモフェノール ブルー パウダー 20 mg、キシレン cyanol FF パウダー 20 mg、Ficoll 型 400 粉末 2 g の重量を量るし、50 mM Na2H2 EDTA の 5 mL で再懸濁します。
    3. 渦管の 3 つが含まれている染料や 50 mM Na2H2 EDTA の 5 mL を加えます。5 x agarose のゲルのローディングの染料を混ぜて、1 mL 因数を準備し、-80 ° C で保存

2. 18 の個々 の RNA サンプルを 3' バーコード アダプターを設定します。

  1. 18 RNA 個体を識別 (前検体 100 ケイ化 1.5 mL 遠心チューブにヌクレアーゼ フリー水の 9.5 μ L で ng) と 10 分のために霜に氷のチューブをセットします。
  2. (ATP) なし RNA リガーゼ バッファー新鮮な x 10 を準備します。
    1. ケイ化 1.5 mL 遠心チューブに RNase フリー水の 343 μ L、500 μ L トリス 1 M pH 7.5、1 M MgCl2、50 μ L 20 mg/mL ウシ血清アルブミンの 14 M 2-メルカプトエタノールの 7 μ ・ 100 μ L を組み合わせます。2 遠心チューブをフリックでミックス 2,000 g と RT とのセット アイス x で s。
      注: すべての手順このプロトコルを示す"2 の遠心分離機 s"ベンチトップ遠心管の下にソリューションを収集する RT と 2,000 x g の最高速度で実行されます。
  3. 水 1 ml の DMSO ケイ化 2 mL 遠心チューブに RNase フリー 1 mL を追加することによって 50% 水溶液 DMSO 在庫を準備、アルミ箔にチューブを巻いて、室温保存
  4. ケイ化 1.5 mL 遠心チューブに以下の順番で組み合わせることで氷上で 10 分間準備結紮マスター ミックス 0.026 nM キャリブレータ カクテルを解凍: 40 μ L の RNA リガーゼのバッファーと 200 mL のピペットを使用して 50% 水溶液 DMSO の 120 μ L x 10、10 μ L ピペットを使ったカクテル 0.026 nM キャリブレータの 10 μ L を追加。ミックスは、2 s、およびセットの遠心分離機に 1.5 mL チューブをフリックそれ氷の上。
  5. 優しくのフリック チューブ、2 s、および氷の上の店、遠心分離、18 個別に検体 FFPE RNA サンプルのそれぞれに結紮術マスター ミックスの 8.5 μ L を追加します。
  6. 各 18、3' バーコード アダプターから 2.5 μ 因数を解凍し、20 分のために霜に氷の上に置きます。
    1. 3 μ L ピペットを使用して、対応する FFPE RNA サンプルの RNA および結紮術マスター ミックス (すなわち、9.5 μ L + 8.5 μ L) を含む各アダプターの 1 μ L を転送します。
    2. ピペットの上下に、単に液体に分配していない先端を引き出します。FFPE RNA サンプル間のヒントを変更することを確認します。各管を閉じる、フリックして [ミックス、2 の s とのセットの氷のための遠心分離機。
  7. 1 分の 90 ° C で熱ブロックに 18 のチューブを置くことによって反応を変化させなさい、すぐに氷の上を置きます。
  8. ケイ化新鮮な 1.5 mL 遠心チューブに水 RNase フリー 10 μ L で切り捨てられた K227Q T4 RNA リガーゼ 2 の 10 μ L に希釈して結紮酵素液を準備します。
  9. 3 μ L ピペットを使用して 18 の RNA のサンプルのそれぞれ 1 μ L 希釈結紮酵素の転送 (ピペットの上下に、各チューブの間ヒントを変更)。氷上 18 を設定し、18 h の一晩インキュベートの 4 ° C の冷たい部屋に設置します。

3. 結紮の小さな Rna の精製

  1. 90 ° C で熱ブロックに 1 分の 18 のチューブを置くことによってライゲーション反応を非アクティブ化し、氷の温度が下がるまで少なくとも 2 分に戻ります。
  2. 新鮮なシリル微量遠心チューブに 5 M RNase フリーの NaCl の 26 μ L にグリコーゲンに共有にリンク青色色素の 1 μ L を追加することによって降水量マスター ミックスを準備します。
    1. 18 管のそれぞれに沈殿物マスター ミックスの 1.2 μ L を転送します。18 管のそれぞれに 100% エタノール 63 μ L を追加します。各管を閉じる、フリックして [ミックスは、2 s、および場所の遠心分離機氷のチューブ。ケイ化シングル 1.5 mL チューブにすべて 18 管の内容を結合します。
    2. 管を閉じると、3 回ミックス、遠心 2 s の沈殿物に 60 分間氷の上場所を反転します。
  3. ページの大きい (16 x 20 cm2) 15% のポリアクリルアミドゲルを準備します。
    1. キャスト 2 両面 0.1 cm スペーサー ガラス板 (シラン コーティングに安全な代替と扱われる)。
    2. 50 mL のチューブで TEMED 12 μ AP (9%) の 240 μ L、3 mL のシステム バッファー システム集中 18 mL 希釈システムの 9 mL を組み合わせます。
    3. 30 分間室温で固めるゲルのページ ゲル溶液 30 mL ピペットを使用してガラス板との間の転送、14 も櫛 (0.1 cm 厚) を挿入させ
  4. X g と 4 ° C, 60 分 16,000 でプールを持つ 1.5 mL チューブを遠心します。
  5. 櫛を削除します。きれいな RNase フリー豊富と井戸水井戸の中に到達し強制的にうまく (1 つずつ)、シンク上のアクリルアミド非重合その端に 200 μ L チップとホヤの瓶を使用します。設定、15% ゲル装置ページで Tris ホウ酸 EDTA (TBE) ソリューション、x 0.5 で貯水池を埋めるし、前 450 V で 30 分のためのゲルを実行します。
  6. 遠心分離機からプールを持つ管を回復し、慎重に RNA のペレットを乾燥します。
    1. 1 mL ピペット チップで上清を除去、下部にいくつかの液体を残します。チューブを傾斜し、20 mL のピペットを使用してペレットに触れることがなく残りの上清を削除します。真空の吸引管、ペレットに触れることがなくその終わりを 10 μ L チップ パスツール ピペットを使用しています。
    2. チューブをフリックすることで RNase フリー水の 20 μ L の RNA ペレットを再懸濁します。2 遠心分離機 RT を座って 1 分の 90 ° C ではチューブを設定し、すぐに氷の場所、RNA を再懸濁します、フリックをミックスしてソリューションを読み込み PAA ゲルの 20 μ L を追加します。
  7. (図 2) の両側 2 空井戸を残して新鮮な 0.5 の x TBE、および負荷、はしごサイズ マーカーとゲルの中央に結紮 miRNAs ゲル装置の置換、0.5 x TBE。
  8. 450 V でゲルを実行 (35 mA) 60 分、10 分、クールダウンして 520 V で再実行のための実行を一時停止 (25 mA) 別 60 分 Uncast 15% のガラス板の 1 ページ。
  9. 軽くスプレーをガラス板の上に座ってゲル TBE, せ x 0.5 mL の 25 に蛍光色素溶液 (10 μ L) で、それは暗闇の中で 5 分のためのフラット座る。
  10. 青い光 transilluminator のゲルのガラスを置き、両方の 19 を合わせ nt と結紮 Rna (図 2) の切除を直接定規を用いて 24 nt サイズ マーカー。ゲルを切除します。
  11. フラグメントのゲルのスライス、1.5 mL のシリル微量遠心チューブにしっかりと配置されているため、0.5 mL チューブに摘出したゲルを配置します。ルートを再懸濁します 3 分の 16,000 × g で遠心分離機の 400 mM の NaCl 水溶液の 300 μ L で断片化されたゲル、チューブを閉じてパラフィン フィルムでシールします。
  12. 一晩インキュベート (16-17 h) の 4 ° C の低温室内で 1,100 rpm で thermomixer の撹拌にチューブを設定します。

4. 5' アダプターの結紮

  1. ソリューションを転送し、5 μ m のフィルターに断片化されたゲル チューブのケイ化 1.5 mL チューブに座っているパラフィン フィルム シール、g および RT x 2,300 で 5 分間遠心
  2. フィルタ リング ソリューションに 100% のエタノールの 950 μ L を追加、チューブを閉じるを混ぜて、2 の遠心分離機に反転 s、パラフィン フィルム、チューブをシールし、1 h の氷の上を設定します。
  3. 手順 3.3 で説明したページのゲル 12% を準備が 12.6 mL の希釈、濃縮、3 mL のバッファーの 14.4 ミリリットル、240 μ L の AP と 12 μ L TEMED の 50 mL チューブに結合します。12% を事前実行 450 V で 30 分間ページのゲル (~ 35 mA) 0.5 で x TBE。
  4. 4 ° C で 60 分 16,000 x g で精製された小さな RNA 溶液を遠心分離します。
  5. 慎重に 1 mL ピペットを使用してソリューションの一括削除し、200 mL のピペットを使用してペレットに触れることがなく残りのソリューションを削除する上澄みをピペットします。
  6. それに触れることがなく、ペレットを乾燥 10 mL 先端が真空フラスコに接続されている、端にパスツール ピペットを使用して、慎重に。
  7. 上下、ピペッティングすることがなく水の RNase フリーの 9 μ L でペレットを再懸濁しますが、2 s と氷のチューブの遠心分離機管を軽くフリックすることで。
  8. 1 M トリス pH 7.5 の 500 μ L を用いて RNA リガーゼのバッファー (ATP) と新鮮な x 10 の準備、100 μ L 1 M MgCl2、20 mg/mL の 50 μ L のアセチル化 BSA、10 mM ATP、2-メルカプトエタノールの 7 μ L の 200 μ L 14 M、と RNase フリー水の 143 μ L。
  9. チューブをフリック (ATP) と RNA リガーゼ バッファー x 10 をミックスし、2 の遠心分離機管の下部にソリューションを収集する s。
  10. 設定 5' アダプター結紮 (ATP) と RNA リガーゼ バッファー x 10 の 2 μ L 追加で 100 μ M 5' アダプター、および 6 μ L 50% 水溶液 DMSO 9 μ L、3' バーコード小さな RNA 溶液を 1 μ L。
  11. ミックスは、2 の遠心分離機を軽くはじくソリューションを収集するために s 管を配置は、1 分の 90 ° C で熱ブロックと、少なくとも 2 分間氷に戻る。
  12. T4 RNA リガーゼ 1 ソリューションに 2 μ L を追加 (はないピペット上下)、チューブ、2 s、および浮遊管ラック 60 分 37 ° C の水浴中に座るのための遠心分離機をフリックします。
  13. 19 nt 3 の 2 つを同時に設定 'アダプターと 5' アダプター、および 24 の nt 3 間 2 つを' アダプターと 5' アダプター。
    1. 19nt 3 の 2 μ L を組み合わせて ' アダプター (250 ng/μ L) または 24 nt 3' アダプター (250 ng/μ L): 2 μ L、5' アダプター (100 μ M)、2 μ L の RNA リガーゼのバッファー (ATP) x 10 の 50% 水溶液 DMSO、RNase フリーの水の 6 μ L の 6 μ L、とケイ化 1.5 mL 遠心チューブに T4 RNA リガーゼ 1 の 2 μ L。
    2. フリックをミックス、2 s、およびセットの遠心分離機管チューブ 37 ° C, 60 分で。
  14. PAA 変性バッファーの 20 μ L を加えるすべてを (19nt 3 と 2 を小さな Rna を精製 'アダプター、および 24nt 3 と 2 を' アダプター)。
    1. 2 遠心チューブをフリックでミックス s、インキュベート管 90 ° c 1 分転送熱ブロックと氷にすべての管および梯子 (はしごの PAA の 20 μ L で 3 mL) を準備します。
  15. 中古実行ゲル装置の上部の貯水池を空に 12% のゲルをページし、(井戸は長い、細い先端のピペットを空に) 井戸のレベルの下の新鮮な 0.5 x TBE ソリューションを追加します。
    1. 図 3で説明したように細いピペット先端とサンプルをロードします。
    2. ゲルの上に個々 の井戸を埋めるに使用新鮮な 0.5 x TBE。
    3. 新鮮な 0.5 を追加井戸と開始 12% の電気泳動の上貯水池へ x TBE 450 V で 60 分のページ (~ 35 mA)。
    4. ゲルをクールダウン 10 分の発電機を離れて転換によって実行を一時停止します。発電機を再起動し、520 V で 60 分のためのゲルを実行 (〜 25 mA)。
  16. 発電機を停止、シンク、上記装置を反転、貯水池を空に、12% の uncast ガラス板の 1 ページ。
  17. 25 mL 0.5 の蛍光色素の 10 μ L をゲルをスプレー、ゲルのフラット ガラスに座る x TBE、5 分は青色光 transilluminator のゲルとガラスを置くために暗闇の中でインキュベートし、両方の 19 を合わせ nt と両方 24 nt サイズ マーカーと結紮の小さな Rna (図 3) の切除を指示するための定規。
    1. ゲルを切除し、0.5 mL ゲル ブレーカー チューブに摘出したゲルの部分を転送します。ケイ化 1.5 mL 遠心チューブにセットし、パラフィン フィルムで固定ゲル ブレーカー チューブのキャップを閉じます。ゲル ブレーカー チューブを削除、300 mm NaCl、300 μ L、100 μ M 3' PCR プライマーの 1 μ L を 1.5 mL チューブに押しつぶされたゲル部分に追加します。
    2. 冷蔵室で一晩 4 ° C で 1,100 rpm で thermomixer の撹拌にパラフィン フィルム チューブ (17-18 h) をシールします。

5. 逆のトランスクリプションの 5' 結紮および 3' バーコード小さな Rna を精製

  1. Thermomixer とフィルターからチューブを取得は、5 μ M のフィルター チューブを備えたソリューションを浄化します。
    1. 1.5 mL に挿入される 5 μ M フィルター チューブに液を移す 1 mL ピペットの使用は、RNase フリー コレクション チューブをケイ化。2,300 g および RT × 3 分の管を遠心分離します。
    2. フィルター チューブを破棄し、フィルタ リング ソリューションを含む 1.5 mL 容マイクロ コレクションの管に 100% のエタノールの 950 μ L を追加します。ミックスは、2 s と 60 分 16,000 x g と 4 ° C 1 時間でチューブを遠心分離によって餌の RNA の沈殿物のための氷の上の場所のための遠心チューブを反転します。
  2. RNA の沈殿を乾燥させます。
    1. キャップを開き、下部にいくつかの液体を残して 1 mL ピペットで上澄みを慎重に削除します。
    2. 20 μ L ピペットを使用して、ペレットに触れることがなくすべての残りの上清を削除します。ペレットの反対側に座っている任意のソリューションを許可するようにチューブを傾けます。
    3. 上清を吸引し、真空を使用してペレットを乾燥 10 mL フィルター ピペット先端をパスツール ピペットを使用します。
  3. RNase フリー水の 5.6 μ L の RNA ペレットを再懸濁します。
    1. RNase フリー 5.6 μ L にバッファー、10 x deoxynucleotide 三リン酸 (dNTPs) (各 2 mM)、4.2 μ L およびジチオトレイトール (DTT) の 1.5 μ L x 5 の 3 μ L を追加することによって 15 分セット逆転写反応を氷の上逆のトランスクリプション試薬を解凍します。再懸濁のペレット。
    2. 軽くフリックの反応をミックスして 2 の遠心分離機管のソリューションを収集します。まさに 30 s と 50 ° C で thermomixer に直接振込み 90 ° C で熱ブロック上の反応を設定します。
    3. 温度を均一にして 2 分間 thermomixer にチューブを残します。ソリューション、ミックス、軽くフリックとチューブがすぐに 50 ° C、30 分で thermomixer にバックアップ セットに直接逆転写酵素の 0.75 μ L を追加します。
  4. 30 分後に、逆のトランスクリプションを停止する 1 分 95 ° C で熱ブロックにチューブを転送します。逆のトランスクリプションに直接 RNase フリー水の 95 μ L を追加、ミックスするチューブをフリックし、2 分間氷の上に直接設定します。
  5. CDNA のストック ライブラリ、ライブラリの ID を持つチューブにラベルを付ける

6. パイロット PCR や大規模な PCR 増幅

  1. RNase フリー水の 304 μ L 追加で新鮮な 10 x PCR のバッファー、2 M の KCl、1 M トリス ph 8.0、50 μ L の 125 μ L の準備 1 M MgCl2の 10 μ L、5 μ L 1 M 2-メルカプトエタノール シリル微量遠心チューブに 1% トリトン X-100, と 6 μ の、室温維持と
  2. RNase フリー水 67 μ、10 μ L の PCR のバッファー、10 x dNTPs、0.5 μ L の PCR プライマー 5' 100 μ M、100 μ M 3' PCR プライマーの 0.5 μ L、cDNA ストック ライブラリの 10 μ L の 10 μ L x 10 50 2 μ L を組み合わせることによってパイロット PCR 反応を組み立てる x Taq ポリメラーゼ。
    1. 設定 2 PCR サイクル、たちに次のように: 45 1:94 ° C のファイル s、85 ° C、50 s、および 60 のための 72 ° C 4 ° C で 10 サイクルの s を保持ファイル 2:94 ° C 45 s、85 ° C、50 s、および 60 のための 72 ° C 2 サイクルの s が 4 ° C で保持たちのパイロット PCR 反応を設定し、ファイル 1 を開始します。
    2. ファイルの末尾に 1、PCR チューブを開くと 20 μ L ピペットを使用して、転送 12 μ L 5 x の 3 μ L を含む 1.5 mL 遠心チューブにパイロット PCR の反作用からゲルのローディングの染料、上下にピペッティングで混ぜる、管を閉じる、次のラベルを「10 サイクル」。
    3. パイロット PCR チューブを閉じて、たちのファイル 2 を開始します。ファイルの末尾に 2、PCR チューブを開くと 20 mL のピペットを使用してゲル読み込み染料 × 5 の 3 μ L で 1.5 mL 遠心チューブにソリューションの 12 μ L を転送してラベルを「12 サイクル」。
    4. 6.2.2 と 6.2.3 PCR サイクル 14、16、18、20 でパイロット PCR の反作用から 12 μ L の PCR の製品を収集するための手順に記載されている手順を繰り返します。12 μ L の PCR 因数のそれぞれにゲルのローディングの染料 × 5 の 3 μ L を追加し、20 nt はしご梯子の 3 μ L と RNase フリー水の 9 μ L を含みます。
  3. 0.5 と 2.5% の agarose のゲルの準備 x TBE。
    1. きれいなビーカーの agarose の 2.5 グラムの重量を量るし、0.5 100 mL を追加 x TBE。熱ソリューション電子レンジで沸騰するまで。Agarose をミックス、臭化エチジウム (10 Mg/ml) の 4 μ L を追加し、ソリューションをテープで両端に閉鎖、7 × 10 cm2の電気泳動トレイに転送するボトルを旋回、電子レンジからソリューションを削除します。
    2. 8 よく櫛を設定して、ルート転送 0.5 でいっぱい電気泳動装置に凝固アガロースゲルで固める agarose のゲルをように x TBE。
  4. はしごと PCR agarose のゲルにサンプルをロードし、120 V で 30 分間それを実行します。
  5. 最適な PCR のサイクル (図 4 a) を識別するために UV ボックスにゲルを評価します。
    メモ: 予想される PCR バンドのサイズは、図 4 bに示されています。
    1. それぞれ、さまざまな坑井の 2 つの PCR バンドを観察 (上部バンド: DNA ライブラリ、下のバンド: プライマー二量体)。
    2. CDNA ライブラリが表示される、プライマー二量体は、ほとんどがサイクルを選択して cDNA 増幅の適切な PCR のサイクルを指定する観測可能なオブジェクト。
      注: 一般に、適切な PCR のサイクルは 12-16 サイクル間が選択されます。図 4 aにこのライブラリの適切な PCR のサイクルは 14 です。
  6. Agarose のゲルのライブラリの浄化のための大規模な PCR の反作用 (6 x 100 μ L) を設定します。
    1. 次のステップ 6.1 PCR バッファー x 10 の新鮮なチューブを準備します。
    2. RNase フリー水、10 x PCR バッファー、65 μ 10 x dNTPs 5' PCR プライマー、3.25 μ L の PCR プライマー 3' とミックスする上下ピペッティングの 3.25 μ L の 65 μ L の 435.5 μ L を組み合わせることにより、1.5 mL チューブの大規模な PCR マスター ミックスを準備します。
    3. 6 0.5 mL PCR チューブ PCR マスター ミックス 88 μ に転送します。ストック ライブラリ (氷に保存) の cDNA の 10 μ L を転送 6 PCR チューブのそれぞれに 50 x Taq ポリメラーゼの 2 μ L を追加し、ミックスにピペットします。
    4. RNase フリー水、10 x PCR バッファーの 10 μ L、10 x dNTPs の 10 μ L、5' PCR プライマーの 0.5 μ L、0.5 μ L の PCR プライマー 3'、50 x Taq ポリメラーゼとミックスするピペット 2 μ L の 77 μ L を組み合わせることにより否定的な PCR の反作用の管を準備します。
    5. PCR のサイクルは、6.2.1 の手順に従って、最適な増幅サイクル数を設定を使用してたちに PCR チューブを配置します。0.5 を使用して 2.5% の agarose のゲルの準備 x TBE、6.3 の手順で説明されているようです。
  7. PCR 増幅後ゲルのローディングの染料 × 5 の 3 μ L を含む六つの 1.5 mL 遠心チューブに各 PCR チューブから 9 μ L を転送します。
    1. RNase フリーの水と追加 3 μ L ゲル 1.5 mL チューブにローディングの染料の 9 μ L にはしごの 3 mL を組み合わせることにより 20 nt はしごを準備します。
    2. はしご、否定的な PCR の制御、および 6 の PCR の製品 agarose のゲルにロードし、120 V で 30 分のためのゲルを実行します。
    3. UV ボックス (画像を取る) の車線の間の PCR の拡大の均一性を確認します。
    4. 5 M の NaCl の 27 μ L、100% のエタノールの 950 μ L 2 ケイ化 1.5 mL 遠心チューブ (3 x 91 μ L) に結合 3 PCR 反応を追加します。ミックス、PCR の製品の沈殿物に一晩-20 ° C でそれらを設定してチューブを反転します。

7. cDNA ライブラリの浄化と評価

  1. 4 ° C で 60 分 16,000 x g での PCR の反作用で両方のチューブを遠心分離します。
  2. 1 mL ピペットで上澄みを除去し、傾斜面の上にペレットと低い側に液体チューブと浴槽を魔法瓶に接続されているパスツール ピペットを使用して、パスツール ピペットの終わりに 10 mL の先端で液体を吸引し、。
  3. PmeI ダイジェストを設定します。
    1. ヌクレアーゼ フリー水 17.5 μ L で PCR ペレットを再懸濁し、2 番目の PCR ペレットを再懸濁のペレットを転送します。バッファー x 10 の 2 μ L と PmeI 酵素の 0.5 μ L を追加し、37 ° C で 2 時間水浴のダイジェストに設定
    2. 0.5 を使用して 2.5% の agarose のゲルの準備 x TBE (ステップ 6.3)。ゲルのローディングの染料 × 5 の 6 μ L をダイジェストに追加します。Agarose のゲルの 2 つの隣接する井戸各ダイジェスト 13 μ に転送、最後井 20 nt のサイズの梯子をロードし、(図 4)、90 分の 150 V でゲルを実行します。
    3. UV ボックスにゲルからアッパーの PCR バンドを消費税、重量を量られたたて 1.5 mL 遠心チューブにゲル部分を転送し、規模でゲル部分の重量を量る。
  4. 製造元の指示、次ゲル抽出キットを使用して摘出した PCR 増幅 cDNA ライブラリを浄化します。DNA 定量アッセイと楽器、メーカーの指示に従って使用して cDNA ライブラリを定量化します。
  5. サイズとバイオアナライザー (図 5) の高感度 DNA チップで cDNA ライブラリの純度を評価します。高スループット システムを用いた cDNA ライブラリーをシーケンスします。FASTQ データ ファイルをアダプターのトリミングおよび miRNA シーケンスを識別する人間のゲノムに合わせの RNAworld パイプラインに転送します。

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結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

18 の個々 の FFPE RNA サンプルの合計方法ここで説明したよう (100 各 ng) 3' adenylated バーコード T4 のオリゴヌクレオチド ligation 一晩を受ける個別のチューブでセットアップされました。次の日、酵素反応熱非アクティブ化、結合し、単管に析出します。RNA の餌を再停止し、変性ポリアクリルアミドゲル (ページ) ページのゲルの隣接する井戸で移行 RNA オリゴヌクレオチド サイズ マーカーを使用して、適切なサイズ 3' バーコードを選択する、15% の結紮の RNA 分子を分離低分子 Rna (図 2)。摘出したゲルの部分は結紮の RNA 分子を溶出する NaCl 水溶液を一晩で孵化します。次の日は溶離された RNA の沈殿し、5' アダプター結紮を行います。5' アダプター結紮小さな RNA 分子が、移行し、もう一度移行した RNA サイズ マーカー オリゴヌクレオチドを許可する小さい Rna のサイズ切除 3' バーコード オリゴヌクレオチドと 5' アダプター (...

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ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

・ ハフナーらによって記述されたプロシージャの変更および最適化されたバージョンは、このプロトコルの FFPE RNA 標本でアーカイブされる低分子 Rna の NGS の高再現性と堅牢な cDNA ライブラリの準備のプロトコルを表示します。22

このプロトコルのすべてのステップは、古いアーカイブと侵害された総 RNA FFPE の標本から回復を使用するため最適化されています。FFPE RNA の少量を処理するため、このプロトコルの重要なステップは、18 のユニークな 3' バーコード アダプター個々 を後すべての RNA のサンプル (すなわち, 18 各 100 ng FFPE RNA サンプル) のプールに存在します。この重要なステップは、18 FFPE RNA サンプルを均一に受ける以降すべて生化学的および酵素の手順小さな RNA の cDNA ライブラリーの作製に必要なすることができます。さらに、この手順を最大限に降水を受ける RNA の量とゲル精製小さな RNA 分子のキャリア効果を高める...

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者らはこの原稿で提示されたデータの一部を含むパブリケーションが Loudigらによって分子科学の国際ジャーナルに掲載されたを開示を希望します。21。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

博士トーマスされた、RNA の分子生物学の実験室の頭部だけでなく、彼らのサポートのため、彼の実験室および RNAworld パイプラインにアクセスを提供する技術を共有するため彼の研究室のメンバーに感謝いたします。我々 はまた、彼のプロトコルを共有し、彼の最初の手順で使用されているすべての生化学的および酵素の手順に関する詳細な説明を提供するため博士マーカス ・ ハフナーを感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1% Triton x-100InvitrogenHFH10
10mM ATPAmbionAM8110G
10X dNTPsAmbion AM8110G
10x TBEThermofisher Scientific15581044
14M MercaptoethanolSigmaO3445I-100
20 nt はしごJena BioscienceM-232S
20mg/ml ウシ血清アルブミンΣB8894-5ML
50X チタン TaqClontech Laboratories639208
過硫酸アンモニウムフィッシャー サイエンティフィック7727-54-0
BRL 垂直ゲル電気泳動システム ガラス板と櫛GIBCOV16
ジメチルスルホキシド (DMSO)シグマD9170-5VL
エッペンドルフ微量遠心分離機 5424R米国科学4054-4537Q
エプンドルフ サーモミキサー米国科学4053-8223Q
フィッシャーブランド™シリコン処理された低保持マイクロ遠心チューブ 1.5mlフィッシャーサイエンティフィック02-681-320
ゲルブレーカーチューブ 0.5mlIST Engineering Inc,3388-100
ゲル電気泳動装置 7cm x10cm- ゲルトレイと櫛付きミニサブセルGTBiorad1704446
GlycoblueAmbionAM9516
Jersey-CoteLabScientific, Inc1188
KcL 2MAmbionAM9640G
MgCl2 1MAmbionAM9530G
Minifuge デュアルローター パーソナル遠心分離機USA scientific2641-0016
モデル V16 ポリアクリルアミドゲル電気泳動装置、ガラス、櫛、スペーサーCiore ライフサイエンス21070010
オリゴヌクレオチドIDT定義注文
フクロウ EasyCast B2 ミニ電気泳動システム-ゲルトレイと櫛付きサーモフィッシャーサイエンティフィックB2
Qiaquick ゲル抽出キットQiagen28704
制限酵素 PmeINEBR0560S
RNaseフリー水アンビオンAM9932
セーフイメージャー 2.0ライフテクノロジーズ G6600
Safe Imager 2.0 青色光トランスイルミネーターThermofisherG6600
SeaKem LE アガロースLonza50002
Superscript III reverse transcription kitInvitrogen18080-044
SybrGoldLife TechnologiesS11494
T4 RNA Ligase 1NEBM0204S
T4 RNA Ligase 2切り捨てられた K227QNEB0351L
TEMEDフィッシャーサイエンティフィックO3446I-100
加熱蓋付きApplied Biosystem4359659
Tris 1M pH 7.5Invitrogen15567027
Tris 1M pH8.0AmbionAM9855G
UltraPure Sequagel システムの濃縮物、希釈剤、および緩衝液National診断EC-833
中

参考文献

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