ホルマリン固定パラフィン包埋標本を表す人間の病気の分子バイオ マーカーの貴重な情報源。実験に基づく cDNA ライブラリの準備プロトコル、最初に新鮮な冷凍 RNA をデザインおよび最適化組織からアーカイブされたマイクロ Rna の解析に格納された 35 歳までをご紹介します。
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方法論記事
ホルマリン固定パラフィン包埋 RNA 試料を用いた回顧マイクロ Rna シーケンス: 相補的な DNA ライブラリの準備のプロトコル
この記事について
サマリー
要約
-アーカイブ、ホルマリン固定を臨床的に分類 (FFPE) 組織のパラフィン包埋は癌の開発の回顧的な分子研究の核酸を提供できます。後で侵襲性疾患を発症した患者から非侵襲や前癌性病変を使用して、遺伝子発現解析は、癌リスクにし向ける初期の分子変化を識別を助けるかもしれない。FFPE 組織から回復した核酸が深刻な物理的な損傷及びその分析が難しく、一般的に適応アッセイ化学修正を受けているも記載されています。マイクロ Rna (Mirna) ただし、少人数のクラスを表す長期保存に耐えるし、FFPE サンプルの解析に成功するまでのみ 〜 18-24 をまたがる RNA 分子のヌクレオチドが示されています。ここで提案する、3' バーコード相補的 DNA (cDNA) ライブラリの準備のプロトコル堅牢かつ再現性の高いアーカイブを使用する場合に示された最近アーカイブされた組織から抽出した低分子 Rna の解析用に最適化されました。35 年間の臨床標本。このライブラリの準備 (18) までの RNA のサンプルを個別 3' バーコード アダプターで結紮、後続の生化学的酵素の準備のため一緒にプールし、侵害された劣化材料の多重解析に適しています分析する前に。すべての浄化は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (ページ) サイズ固有選択とバーコード小さな RNA 種の濃縮が可能で行われます。この cDNA ライブラリの準備は、次世代シーケンサー (NGS) のための材料の最適な量を生成する特定の増幅サイクルの決定により、パイロットのポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) 分の RNA 入力によく合わせられる。このアプローチは、最大 35 年間のアーカイブの標本から劣化した FFPE RNA の使用のために最適化された、NGS の再現性の高いデータを提供します。
概要
Mirna がホルマリン固定パラフィン包埋 (FFPE) 標本1,2,3非常によく保存されています。前作はこれら短い規制非コード鎖 RNA 分子の式 FFPE サンプルからの総 RNA を使用して正常に評価することができ、元の新鮮なと比較した場合の関連する遺伝子発現データを示しています。組織4,5,6,7,8。大型メッセンジャー RNAs は、批判的に FFPE ティッシュの処理 (ホルムアルデヒド、熱、乾燥、等)、内因性 RNases、miRNAs (~ 18-24 の小型試験片の年齢によって影響を受けることが示されていると比較した場合ヌクレオチド) の低下に耐性とアーカイブされた標本9の高スループット mRNA 研究をアウトパ フォームする miRNA 発現研究により実証するも、長期的なストレージに弾力性のあるようにするが表示されます。各種マイクロ アレイ....
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プロトコル
1. すべての試薬およびプライマーの準備
- 図 1に示したすべてのプライマーとアダプターを注文します。
-
それぞれの個々 の結紮でスパイクするカクテル株式キャリブレータを準備します。
- RNase フリーの水で 0.5 μ M にキャリア オリゴヌクレオチド (図 1) を再懸濁します。0.5 μ M キャリア オリゴヌクレオチド ソリューションを使用して 100 μ m まで 10 キャリブレータ オリゴヌクレオチド (図 1) を再懸濁します。
- 100 μ M カクテル キャリブレータ株式を取得するシリコーンの遠心で 10 キャリブレータのそれぞれの 10 μ L を組み合わせて、-20 ° C で保存する 0.026 nM ソリューションを準備
- 50 μ M (図 1) の最終的な集中に RNase フリー水と 20 のユニークな凍結乾燥、adenylated 3' アダプターを希釈します。
注: 個々 のシリコーン チューブ内の各アダプターから 2.5 μ 因数を準備し、2 年間-80 ° C で保存することをお勧めします。<....
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結果
18 の個々 の FFPE RNA サンプルの合計方法ここで説明したよう (100 各 ng) 3' adenylated バーコード T4 のオリゴヌクレオチド ligation 一晩を受ける個別のチューブでセットアップされました。次の日、酵素反応熱非アクティブ化、結合し、単管に析出します。RNA の餌を再停止し、変性ポリアクリルアミドゲル (ページ) ページのゲルの隣接する井戸で移行 RNA オリゴヌクレオチド サイズ マーカーを使用して、適切なサイズ 3' バーコードを選択する、15% の結紮の RNA 分子を分離低分子 Rna (図 2)。摘出したゲルの部分は結紮の RNA 分子を溶出する NaCl 水溶液を一晩で孵化します。次の日は溶離された RNA の沈殿し、5' アダプター結紮を行います。5' アダプター結紮小さな RNA 分子が、移行し、もう一度移行した RNA サイズ マーカー オリゴヌクレオチドを許可する小さい Rna のサイズ切除 3' バーコード オリゴヌクレオチドと 5' アダプター (.......
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ディスカッション
・ ハフナーらによって記述されたプロシージャの変更および最適化されたバージョンは、このプロトコルの FFPE RNA 標本でアーカイブされる低分子 Rna の NGS の高再現性と堅牢な cDNA ライブラリの準備のプロトコルを表示します。22
このプロトコルのすべてのステップは、古いアーカイブと侵害された総 RNA FFPE の標本から回復を使用するため最適化されています。FFPE RNA の少量を処理するため、このプロトコルの重要なステップは、18 のユニークな 3' バーコード アダプター個々 を後すべての RNA のサンプル (すなわち, 18 各 100 ng FFPE RNA サンプル) のプールに存在します。この重要なステップは、18 FFPE RNA サンプルを均一に受ける以降すべて生化学的および酵素の手順小さな RNA の cDNA ライブラリーの作製に必要なすることができます。さらに、この手順を最大限に降水を受ける RNA の量とゲル精製小さな RNA 分子のキャリア効果を高める.......
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開示事項
著者らはこの原稿で提示されたデータの一部を含むパブリケーションが Loudigらによって分子科学の国際ジャーナルに掲載されたを開示を希望します。21。
謝辞
博士トーマスされた、RNA の分子生物学の実験室の頭部だけでなく、彼らのサポートのため、彼の実験室および RNAworld パイプラインにアクセスを提供する技術を共有するため彼の研究室のメンバーに感謝いたします。我々 はまた、彼のプロトコルを共有し、彼の最初の手順で使用されているすべての生化学的および酵素の手順に関する詳細な説明を提供するため博士マーカス ・ ハフナーを感謝します。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 1% Triton x-100 | Invitrogen | HFH10 | |
| 10mM ATP | Ambion | AM8110G | |
| 10X dNTPs | Ambion AM8110G | ||
| 10x TBE | Thermofisher Scientific | 15581044 | |
| 14M Mercaptoethanol | Sigma | O3445I-100 | |
| 20 nt はしご | Jena Bioscience | M-232S | |
| 20mg/ml ウシ血清アルブミン | ΣB8894-5ML | ||
| 50X チタン Taq | Clontech Laboratories | 639208 | |
| 過硫酸アンモニウム | フィッシャー サイエンティフィック | 7727-54-0 | |
| BRL 垂直ゲル電気泳動システム ガラス板と櫛 | GIBCO | V16 | |
| ジメチルスルホキシド (DMSO) | シグマ | D9170-5VL | |
| エッペンドルフ微量遠心分離機 5424R | 米国科学 | 4054-4537Q | |
| エプンドルフ サーモミキサー | 米国科学 | 4053-8223Q | |
| フィッシャーブランド™シリコン処理された低保持マイクロ遠心チューブ 1.5ml | フィッシャーサイエンティフィック | 02-681-320 | |
| ゲルブレーカーチューブ 0.5ml | IST Engineering Inc,3388-100 | ||
| ゲル電気泳動装置 7cm x10cm- ゲルトレイと櫛付きミニサブセルGT | Biorad | 1704446 | |
| Glycoblue | Ambion | AM9516 | |
| Jersey-Cote | LabScientific, Inc | 1188 | |
| KcL 2M | Ambion | AM9640G | |
| MgCl2 1M | Ambion | AM9530G | |
| Minifuge デュアルローター パーソナル遠心分離機 | USA scientific | 2641-0016 | |
| モデル V16 ポリアクリルアミドゲル電気泳動装置、ガラス、櫛、スペーサー | Ciore ライフサイエンス | 21070010 | |
| オリゴヌクレオチド | IDT | 定義注文 | |
| フクロウ EasyCast B2 ミニ電気泳動システム-ゲルトレイと櫛付き | サーモフィッシャーサイエンティフィック | B2 | |
| Qiaquick ゲル抽出キット | Qiagen | 28704 | |
| 制限酵素 PmeI | NEB | R0560S | |
| RNaseフリー水 | アンビオン | AM9932 | |
| セーフイメージャー 2.0 | ライフテクノロジー | ズ G6600 | |
| Safe Imager 2.0 青色光トランスイルミネーター | Thermofisher | G6600 | |
| SeaKem LE アガロース | Lonza | 50002 | |
| Superscript III reverse transcription kit | Invitrogen | 18080-044 | |
| SybrGold | Life Technologies | S11494 | |
| T4 RNA Ligase 1 | NEB | M0204S | |
| T4 RNA Ligase 2切り捨てられた K227Q | NEB | 0351L | |
| TEMED | フィッシャーサイエンティフィック | O3446I-100 | |
| 加熱蓋付き | Applied Biosystem | 4359659 | |
| Tris 1M pH 7.5 | Invitrogen | 15567027 | |
| Tris 1M pH8.0 | Ambion | AM9855G | |
| UltraPure Sequagel システムの濃縮物、希釈剤、および緩衝液 | National診断 | EC-833 |
参考文献
- Peiró-Chova, L., Peña-Chilet, M., López-, J. A., García-Gimenez, J. L., Alonso-Yuste, E., Burgues, O., et al. High stability of microRNAs in tissue samples of compromised quality. Virchows. Arch. 463, 765-774 (2013).
- Klopfleisch, R., Weiss, A. T., Gruber, A. D.
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再版と許可
