シンプルで効果的な管理と腎臓の注入を使用する小型魚の循環システムの微粒子の可視化

サマリー

小型魚の circulatory system と魚血微粒子の体内可視化に蛍光微粒子の低侵襲、迅速注入の原理を説明します。

要約

生きている有機体にマイクロ サイズ粒子の全身投与は血管可視化薬とワクチンの配信、トランスジェニック細胞と小型の光学センサーの適用できます。しかし、生物学・獣医研究所の使用が多い、小動物に静脈内の薬剤が非常に困難な訓練された人員を必要とします。ここで、我々 は魚の腎臓への注入による微粒子のアダルト ゼブラフィッシュ (動脈分布) の循環系への導入のため堅牢で効率的なメソッドを示します。血管系で導入された微粒子を可視化、魚のえらに単純な生体イメージング手法を提案する.注入されたマイクロ カプセル化蛍光を使用して達成された体内監視ゼブラフィッシュ血液 pH のプローブ、パク-1、記載した技術の可能なアプリケーションの 1 つであります。この記事は、pH 感受性色素のカプセル化の詳細な説明し、迅速な注入の原理と体内蛍光信号の録音のための得られたマイクロ カプセルの可視化を示します。インジェクションの手法は低い死亡率率によって特徴付けられる (0-20%) と高効率 (70-90% 成功)、それは一般に利用できる機器を使用して研究所に簡単。グッピーやメダカなど、他の小さな魚の種にすべて記載されている手順を実行できます。

概要

動物有機体にマイクロ サイズ粒子の管理は小さな光学センサー注入およびトランスジェニック細胞注入³、血管可視化²ワクチン配信¹医薬品などの分野で重要な課題^4,5します。 ただし、実験小動物の血管系へのマイクロ粒子の注入手順は難しい、特に繊細な水生生物です。ゼブラフィッシュのような人気のある研究標本のお勧めビデオ プロトコルを使用してこれらの手順を明らかにすること。

心内及びキャピラリーのマイクロインジェクション ゼブラフィッシュ血に microobjects の配信するためスタッフとユニークな手術設備が必要です。以前は、レトロな軌道手動注入³がセルを全体を管理するための簡単で効果的な方法として示唆されました。しかし、我々 の経験で目の毛細血管網の小さい区域のためかかりますこの手法から目的の結果を達成するために多くの練習。

本明細書で述べる循環系への堅牢で効率的な微粒子注入法大人ゼブラフィッシュの腎臓組織に直接手動注入による腎血管と毛細血管が豊富であります。この手法は、ゼブラフィッシュの腎臓⁶に細胞移植ビデオ プロトコルに基づいていますが、外傷性および時間のかかる顕微鏡手順が排除されました。提案手法は低死亡率によって特徴付けられる (0-20%) と高効率 (70-90% 成功)、それは一般に利用できる機器を使用して研究所に簡単。

提案プロトコルの重要な一部が注入された微粒子の (蛍光灯や色付きのもの) 場合ギル毛細血管でインジェクションの品質、数の大まかな相対評価の検証を可能にする可視化注入された粒子、循環血液から直接生理学的な測定のためスペクトル信号の検出。パク-1、最初に提案された Borvinskaya マイクロ カプセル化蛍光プローブを用いたゼブラフィッシュ血液 pH の生体内測定のためのプロトコルを示す記載した技術の可能なアプリケーションの例としてら。2017年⁵。

プロトコル

すべての実験手順、動物実験のための EU 指令 2010年/63/EU に従い行った動物科目研究委員会の研究所の生物学イルクーツク州立大学によって承認されています。

1. マイクロ カプセルの作製

注: 蛍光染料を運ぶカプセルは帯電凝集沈殿処理^7,8層によってアセンブリを使用して準備されます。すべてのプロシージャは、室温で行われました。

1. 蛍光染料を囲む多孔性の CaCO₃ microcores を合成するには、ミックス (FITC BSA などほとんどの高分子と結合蛍光染料を使用できます) パク-1-デキストラン溶液 2 mL ~ 2 Mg/ml の濃度で 0.6 ml 各 CaCl 2_{溶液 1 mol/L の}と高速攪拌下で Na₂CO₃ 。
   注: は、退色; に蛍光染料の別の感度に注意を払う(パク-1) のような光に敏感な蛍光プローブを使用すると場合、は、可能な限り小さな光として微粒子の操作・と実行する必要があります。
2. 撹拌の 5-10 秒後に転送懸濁液 2 mL マイクロ遠心チューブ用と 15 の遠心載荷 CaCO₃ microcores をペレットに 10,000-12,000 g で s。
3. 上澄みを廃棄し、〜 2 ml の脱イオン水のコアを洗浄し、揺れでペレットを再懸濁します。
4. 合計で 3 回遠心洗浄手順を繰り返します。最後の遠心分離後、上清を破棄します。
5. Microcores、凝集を抑える超音波風呂で 1 分間、インキュベートします。
   注意: は、ヘッドフォンで耳を保護するために忘れないでください。
6. テンプレートの第 1 のポリマー層をデポジットするには、2 〜 4 mg/mL の溶液 1 mol/l 塩化ナトリウム poly(allylamine hydrochloride) (PAH) の mL でコアを再懸濁します。
   1. 一定の揺れと ~ 5 分のためのソリューションに、microcores をしてください。
   2. 15 日以降後の遠心分離、s は非連結の PAH を持つ上澄みを廃棄します。少なくとも 3 回複数の遠心分離、洗浄手順を脱イオン水で覆われた microcores を洗ってください。最後の遠心分離後、上清を破棄します。
   3. Microcores、凝集を抑える超音波風呂で 1 分間、インキュベートします。
      注: 適用される蛍光色素がカチオンの場合ポリ (スチレンスルホン酸ナトリウム 4-) から開始 (PSS) 1 mol/l 塩化ナトリウム (1.7 の手順を参照してください)。
7. テンプレートに第 2 のポリマー層を堆積させるため手順 1.6 〜 2 mL (1 mol/L 塩化ナトリウムとも含んでいる) PSS の 4 mg/mL の溶液を繰り返します。
8. 12 高分子層を堆積させるため、1.6 と 1.7 の 6 倍の手順を繰り返します。
   注: 勧めできません (〜 12 h 以上) 長い休憩を取るに 3 〜 5 までの手順でレイヤーを報道せず CaCO₃ microcores が recrystallize する傾向があるために寄託されています。PSS カバレッジにより、microcores の高い集計の長い一時停止 (PLL-g-PEG) は一番外側の層で PAH またはポリ L リジンはポリエチレング リコールをグラフトした場合にのみお勧めに注意してください。
9. 少なくとも 2 時間 PLL-g-ペグ (〜 1 mL マイクロ チューブごと) を 2 mg/mL で覆われた microcores を孵化させなさい。
   1. 連続遠心分離と再懸濁の手順を介して水と microcores を洗ってください。最後の遠心分離後、上清を破棄します。
10. 中空マイクロ カプセルを得るためには、屋根付きの microcores に (NaOH で ph 7.1 調整) 0.1 mol/L エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) 溶液 2 mL を追加して CaCO₃テンプレートを溶解します。
    1. 45 s と破棄のマイクロ カプセルを遠心培養 〜 5 分後、EDTA と上清。
    2. 1.10 1.10.1 の手順を 2 回繰り返します。
11. 0.9 %nacl を通じて複数の遠心分離、3 回ステップ 45 内にマイクロ カプセルを洗う洗浄手順が続く s。最後の遠心分離のステップ後上澄みを廃棄します。
    メモ: 最終的なマイクロ カプセル注射剤保管され滅菌 (たとえばアンピシリン、0.1 mg/mL を加えること) で、メディアは、生体適合性調査 (中性等張性メディア) の対象とする必要があります。
12. 蛍光顕微鏡下で検定の準備のマイクロ カプセルの濃度を推定します。マイクロ カプセルの写真のシリーズを取る、ImageJ の⁹またはそれと同等のソフトウェアを使用して 100 マイクロ カプセルについての直径を測るし、ヒストグラムを使用してサイズの分布を調査します。
13. 得られた店は、暗闇の中でプローブをカプセル化します。
    注: 滅菌 0.9% でいくつか洗濯後塩化ナトリウム、4 ° C で数ヶ月保存できるマイクロ カプセル貯蔵中のマイクロ カプセルの完全乾燥はお勧めしません。

2 光のセットアップと調整のマイクロ カプセル化パク-1 の準備

注: マイクロ カプセル化パク - 1 大まかな pH 測定 1 ch 蛍光顕微鏡接続ファイバー分光器にこのプロトコルでが適用されたが蛍光顕微鏡の⁷の 2 つのチャンネルのイメージを使用して行うことができます。

1. 必要な応用の蛍光染料の特性に応じて蛍光顕微鏡に蛍光フィルターのセットを置き、蛍光ランプをオンにします。
   1. 接眼レンズにレバーを引いてください。
      注意: 余分な光は、分光器マトリックスを損傷します。したがって、分光計を使用しない場合で、レバーが「接眼レンズ」モードにあることを確認します。
   2. 分光計とのコリメーターをもう一方の端に光ファイバーの一方の端を接続します。アダプターを使用して、撮像管の焦点または蛍光顕微鏡の他の利用可能なポートにコリメータを配置します。
   3. 分光計を入れます。分光器制御プログラムを実行し、測定分光計を準備します。
2. マイクロ カプセル バッチの校正顕微鏡スライドの上 ~ 5 μ L マイクロ カプセル懸濁液 (脱イオン水で μ L あたり 〜 10 000 カプセル) を置き、(たとえば、35 ° C でサーモスタット) で暗い場所でドロップを乾燥します。
   1. 、マイクロ カプセル化パク-1 のスペクトル特性を調整するには、異なる pH 値が 6 ~ 9 の範囲内の一連のバッファーを使用します。パク-1-デキストランと乾燥マイクロ カプセルにバッファーの ~ 10 μ L をドロップして、coverslip でそれをカバーします。
   2. 顕微鏡ステージ上にスライド ガラスを配置します。× 40 目的を使用してカプセルを探します。
   3. カメラのポートに顕微鏡レバーを回します。分光計、蛍光に登録します。接眼レンズに戻ってレバーを回します。
      注: スペクトル信号はバック グラウンドのレベルをはるかに超えていることを確認、ビューのフィールドにマイクロ カプセルがされないように泡で (必要な場合は低倍率に切り替え) で。同じマイクロ カプセルの長時間光照射は避けてください。パク-1 は、光に敏感です。
   4. 異なるマイクロ カプセル 10-15 倍の 2.2.3 のステップを繰り返します。
3. すべての登録されているスペクトルの (たとえば、R または Scilab を使用して) 蛍光ピーク比を計算し、(各バッファー) の中央値の比と培地の pH は次の式を使用しての間の回帰線を決定します。
   
   注: パク-1 は、プロトン化や脱プロトン化した色素の排出に対応する 2 つのピークを持つスペクトルを持ち、培地の pH に応答のピークの間の比率。本研究では 605 と 660 nm の蛍光強度比が使用されます。これらの波長は使用するフィルター セットによって選ばれます。aとbは、(たとえば、R を使用して)、非線形回帰によって決定される係数です。0.15 と 1.1 の値が、それぞれの最小値と最大値私₆₀₅/I₆₆₀キャリブレーション時に観測されました。
4. 約 5 大人動物から魚血の約 10 μ L を収集します。1 μ L/mL をシャーレに場所の魚麻酔のクローブ オイルの懸濁液を水し、動物が横向きになりフィンのつまみに応答を停止するを待ちます (通常 2 〜 3 分)。ガラス スライド上には、魚を転送します。ランセットで魚の尾を切断し、尾静脈から魚血の約 2 μ L を収集します。
   注: 血液凝固を防ぐため、ヘパリン (5000 U/mL) を使用して切開を治療し、血液を収集するヘパリン ガラス管および遠心管を使用します。
   1. 電極の先端にピペットで血の約 10 μ L を滴下し、pH 計を用いて pH を決定します。
   2. 乾燥マイクロ カプセルとスライドに血をドロップし、校正バッファー (手順 2.2 2.3) のとおり、蛍光強度の比を登録します。
5. 曲線の一致 (のより多くの詳細を参照してください Borvinskayaら2017⁵) 魚の血液で測定する検量線の直線の係数を調整します。

3. 注射の準備

1. 鋭いランセットとプラスチックを除去することによってインスリンのペン (または注射器) の先端から鉄の針をリリースします。
   注: 任意の細い針 (Ø0.33 mm 以下) またはガラス毛細管 (通常 Ø1 mm) マイクロインジェクション^10,11準備できます。
2. 途中で針を挿入ガラス マイクロキャピ ラリー;ゆっくりとすぐにガスのトーチを使用してそれをはんだ付けします。
3. ガラスシリンジにガラス マイクロキャピ ラリーを接続し、滅菌水で 3 回フラッシュします。とおしての液体が流れることを確認します。
4. 蒸留水には、システムを入力します。
   メモ: システムに気泡がないことを確認します。

4. 注入

1. マイクロ カプセルの準備の懸濁液を再懸濁します (無菌の 0.9% の塩化ナトリウム、またはその他のメディアに使用 1 マイクロリットルあたり 0.5 に 600 万マイクロ カプセルの濃度の注射) 1 分間超音波洗浄器を使用して。
   注: マイクロ カプセルの注射の中に沈殿する傾向があるので振るマイクロ カプセルで機械的に (ロータを使用して) またはそれらを再懸濁します、その凝集を予防し、数分ごと手動で。
2. 2 〜 3 の麻酔 (水で中断クローブ オイルの 0.1 mL/L) とシャーレに魚を配置分魚はその側になりフィンの光のピンチに応答を停止するまで待ちます。
3. スプーンを使用して、転送、麻酔から魚と軽く側臥位で左 (右利きの人) の方または (左利きの人) のための権利の方の頭で湿ったスポンジの上に置きます。
4. 注入直前マイクロインジェクターと接続されているガラス管への空気の 1-2 mm を吸います。その後、分散型マイクロ カプセルの約 2 μ L でそれを読み込みます。
   注意: 注入前にマイクロ カプセル ソリューションは魚を保存する温度に調整する必要があります。
5. 優しく非支配的な手でスポンジに魚体を安定させます。
   1. 魚の側線を見つけます。精神的腹部キャビティの端に、蓋から拡張するセグメントを選択します。このセグメントの中央を見つけます。腹側方向に針 1 mm を下に置きます。
   2. こする動きで優しく魚はさておき、スケールし、パンクを移動します。テーブル面に 45 ° の角度で体に針を挿入します。
   3. 脊椎に向かって針を押して、それは慎重にそれに合わせます。
   4. 腎臓に約 1 μ L マイクロ カプセルの懸濁液を解放し、ゆっくりと針を撤回します。
      注: 適切な穿刺部位を検索するには、より簡単に便利です図 2 a と 2 bに示すように、下のライトを使用して魚を transilluminating によってトランク腎臓を見つける練習します。
6. 注射部位、こぼれたカプセルを削除する水の流れの末尾に頭から魚をすすいでください。

5.生体内可視化

1. 解剖はさみを使用して魚の頭から鰓蓋を削除し、魚のえらをはぎ取る。水で顔をすすいでください。
2. スプーンを使用して、顕微鏡のスライドに魚を転送し、蛍光顕微鏡のステージの上に置きます。
   注: 魚の鰓が連続したプロシージャ中の乾燥しないでくださいことを確認します。これを避けるには、パスツール ピペット (約 1-2 分毎) を使用して水で潤した定期的に。
3. 部屋を暗くと蛍光マイクロ カプセルを見つけるためエラを検査 (10 の目的) x の低倍率を使用しています。
   注: いくつかの蛍光粒子の魚の循環系への導入の手順を使用すると、お勧めの注射する前に予期しない蛍光粒子のいくつかの個人のえらを検査します。野生型のゼブラフィッシュのえらを蛍光、持っていないが、いくつかのケースで (のような食品の部分または単細胞共生) 散発的な蛍光粒子鰓に存在します。かどうか、必要に応じてそのような粒子認識できる彼らの特定の形状に基づいて (たとえば、品ある不規則な形状、球形マイクロ カプセルとは異なり) または蛍光スペクトル測定 (すなわち色)。
   1. 高い大きさ (40 × 目標) に、レンズを切り替える、ビューのフィールドの中央にカプセルまたはマイクロ カプセルのグループを配置します。
   2. 接続されている装置のポートにレバーを回します。スペクトルの信号を記録します。
   3. 接眼レンズに戻ってレバーを回します。
   4. マイクロ カプセルの異なる複数回の測定を繰り返します。
4. 回復のための適切なエアレーションで水槽に魚を転送します。
   注: 最小限の練習だ注射し、魚あたり 2 〜 3 分のおおよその速度で記録する信号を実行することが可能。麻酔の繰り返された低、無害な線量または固定の別の方法を使って 1 つ個々 数回測定を繰り返すことができます。長期的な観測は、連続麻酔¹²システムを使用します。

結果

得られた結果は、提案するプロトコルの 3 つの主要なカテゴリのいずれかから来る: 蛍光色素 (図 1)、さらに可視化とマイクロ カプセルの腎臓射出カプセル化による蛍光微粒子の形成(図 2 および 3) 毛細血管を鰓と、最後に、生体内でスペクトルの記録を監視するパク-1 蛍光血液の pH のレベル (図 4)。

逆に複数の層で染料を囲むテンプレート CaCO₃コアのコーティングを使用して層によってアプローチ荷電高分子鎖 (PSS および PAH) と生体適合性高分子 (PLL-g-PEG) の最も外側の層は、シンプルでコスト効果の高い方法パク-1-デキストラン、FITC ...

ディスカッション

ゼブラフィッシュ腎臓の微粒子による注入を示すためには、インジケーター染料搭載半透過性マイクロ カプセルを使用しました。したがって、プロトコルを含む逆荷電高分子電解質^{7,8,15,16,17 の層によってアセンブリを使用してマイクロ カプセルの作製について ,18} (図 1 a)。この技術の利点は容易に利用可能な実験装置を実行します。条件、使用される化合物によっては、100 ナノメートル厚高分子シェル¹⁵μ m、0.5 から作製したマイクロ カプセルをわたります。合成パラメーターは約 2-6 μ m サイズ (

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
SNARF-1-デキストラン、70000 MW	サーモフィッシャーサイエンティフィック	D3304	蛍光プローブ。マイクロカプセルフィラーとして使用することができる他の適切なポリマー結合蛍光染料
アルブミン-フルオレセインイソチオシアネートコンジュゲート(FITC-BSA)	SIGMA	A9771	蛍光プローブ
ローダミンBイソチオシアネート-デキストラン(RITC-デキストラン)	SIGMA	R9379	蛍光プローブ
塩化カルシウム	SIGMA	C1016	CaCO3テンプレート形成
炭酸ナトリウム	SIGMA	S7795	CaCO3 テンプレート形成
ポリ(塩酸アリルアミン)、MW 50000 (PAH)	シグマ	283215	カチオン性ポリマー
ポリ(4-スチレンスルホン酸ナトリウム)、MW 70000 (PSS)	SIGMA	243051	アニオン性ポリマー
Poly-L-lysine [20 kDa]、g = 3.0 〜 4.5 (PLL-g-PEG)	SuSoS	PLL(20)-g[3.5]-PEG(5)	マイクロカプセルの生体適合性を高める最終ポリマー
塩化ナトリウム	SIGMA	S8776	塗布ポリマーの溶解
浄水システム	ミリポア	SIMSV0000	脱イオン水の調製
マグネチックスターラー			CaCO3テンプレート形成用
エッペンドルフ 研究内容 プラスピペット、1000&マイクロ;L	エッペンドルフ		ドージング ソリューション
エッペンドルフ 研究内容 プラスピペット、10&マイクロ;L	Eppendorf		Dosing solutions
ピペットチップ、容量範囲 200 〜 1000 & マイクロ;L	FL Medical	28093	投与ソリューション
ピペットチップ、容量範囲 0.1-10 μL	エッペンドルフ	Z640069	ドージングソリューション
ミニ遠心分離機 マイクロスピン12、高速	バイオサン		マイクロカプセル遠心分離洗浄手順用
マイクロ遠心チューブ、2mL	エッペンドルフ	Z666513	マイクロカプセル合成・保存
シェーカー Intelli-mixer RM-1L	ELMY Ltd.		マイクロカプセルの凝集を減らすには
超音波洗浄機			マイクロカプセルの凝集を減らすには
ヘッドフォン			超音波から耳を保護するには
エチレンジアミン四酢酸	SIGMA	EDS	CaCO3テンプレートを溶解するには
リン酸ナトリウム	SIGMA	S9638	pH緩衝液の調製
リン酸二ナトリウム	SIGMA	S9390	pH緩衝液の調製
水酸化ナトリウム	SIGMA	S8045	EDTA溶液とバッファーのpHを調整するには
サーモスタットチャンバー			ガラススライドでマイクロカプセルを乾燥させるには
血球計算盤 血液細胞数チャンバー			調製したマイクロカプセルのサイズ分布と濃度を調査するには
蛍光顕微鏡 Mikmed 2	LOMO		魚の血液
中のマイクロカプセルの生体内可視化SNARF-1用の蛍光フィルターのセット(顕微鏡のモデルに応じて選択する必要があります;例が提供されます)	Chroma	79010	蛍光プローブによるマイクロカプセルの視覚化
ファイバー分光計 QE Pro	オーシャンオプティクス		顕微鏡下でのマイクロカプセルのキャリブレーション
光ファイバー QP400-2-VIS NIR、400 μm, 2 m	オーシャンオプティクス		顕微鏡ポートと分光器を接続するには
コリメーター F280SMA-A	Thorlabs		顕微鏡ポートと分光器を接続するには
ガラス顕微鏡スライド	フィッシャーブランド	12-550-A3	顕微鏡下でのマイクロカプセルの校正
カバースリップ、22 x 22 mm	パール	MS-SLIDCV	顕微鏡
下でのマイクロカプセルの校正ガラスマイクロキャピラリー Intra MARK, 10 & micro;L	Blaubrand	BR708709	魚の血液を収集する
クローブオイル	SIGMA	C8392	魚の麻酔
Lancet No 11	Apexmed international B.V.	P00588	魚の尾を切断し、インスリン自己注射器ヘパリンの先端から鋼針を解放するには
、5000 U/mL	Calbiochem	L6510-BC	魚の採血中に魚の血液と接触するすべての表面を処理するため
電極を備えた Seven 2 Go Pro pH メーター	メトラー・トレド		魚の血液の pH を測定するには
インスリン ペン針 Micro-Fine Plus、 0.25 x 5 mm	ベクトン、ディキンソン、カンパニー		注射手順用。任意の細い針(Ø 0.33 mm以下)が適切です
ガラスキャピラリー、1 x 75 mm	Hirschmann Laborgeräte GmbH &Co	9201075	インジェクション手順用
ガストーチ			ガラスキャピラリーにスチールニードルをはんだ付けする
マイクロインジェクター IM-9B	NARISHIGE		マイクロカプセル懸濁液の精密な投与用
シャーレ、60mm×15mm、ポリスチレン	SIGMA	P5481	麻酔下での魚の操作用
プラスチックスプーン			麻酔下の魚の操作用
湿ったスポンジ			麻酔下の魚の操作用
解剖ハサミ	サーモサイエンティフィック	31212	魚の頭から鰓カバーを取り外すには
パスツールピペット、3.5mL	ブランド	Z331767	魚の鰓を湿らせるには