シンプルで効果的な管理と腎臓の注入を使用する小型魚の循環システムの微粒子の可視化

Summary

小型魚の circulatory system と魚血微粒子の体内可視化に蛍光微粒子の低侵襲、迅速注入の原理を説明します。

Abstract

生きている有機体にマイクロ サイズ粒子の全身投与は血管可視化薬とワクチンの配信、トランスジェニック細胞と小型の光学センサーの適用できます。しかし、生物学・獣医研究所の使用が多い、小動物に静脈内の薬剤が非常に困難な訓練された人員を必要とします。ここで、我々 は魚の腎臓への注入による微粒子のアダルト ゼブラフィッシュ (動脈分布) の循環系への導入のため堅牢で効率的なメソッドを示します。血管系で導入された微粒子を可視化、魚のえらに単純な生体イメージング手法を提案する.注入されたマイクロ カプセル化蛍光を使用して達成された体内監視ゼブラフィッシュ血液 pH のプローブ、パク-1、記載した技術の可能なアプリケーションの 1 つであります。この記事は、pH 感受性色素のカプセル化の詳細な説明し、迅速な注入の原理と体内蛍光信号の録音のための得られたマイクロ カプセルの可視化を示します。インジェクションの手法は低い死亡率率によって特徴付けられる (0-20%) と高効率 (70-90% 成功)、それは一般に利用できる機器を使用して研究所に簡単。グッピーやメダカなど、他の小さな魚の種にすべて記載されている手順を実行できます。

Introduction

動物有機体にマイクロ サイズ粒子の管理は小さな光学センサー注入およびトランスジェニック細胞注入³、血管可視化²ワクチン配信¹医薬品などの分野で重要な課題^4,5します。 ただし、実験小動物の血管系へのマイクロ粒子の注入手順は難しい、特に繊細な水生生物です。ゼブラフィッシュのような人気のある研究標本のお勧めビデオ プロトコルを使用してこれらの手順を明らかにすること。

心内及びキャピラリーのマイクロインジェクション ゼブラフィッシュ血に microobjects の配信するためスタッフとユニークな手術設備が必要です。以前は、レトロな軌道手動注入³がセルを全体を管理するための簡単で効果的な方法として示唆されました。しかし、我々 の経験で目の毛細血管網の小さい区域のためかかりますこの手法から目的の結果を達成するために多くの練習。

本明細書で述べる循環系への堅牢で効率的な微粒子注入法大人ゼブラフィッシュの腎臓組織に直接手動注入による腎血管と毛細血管が豊富であります。この手法は、ゼブラフィッシュの腎臓

Protocol

すべての実験手順、動物実験のための EU 指令 2010年/63/EU に従い行った動物科目研究委員会の研究所の生物学イルクーツク州立大学によって承認されています。

1. マイクロ カプセルの作製

注: 蛍光染料を運ぶカプセルは帯電凝集沈殿処理^7,8層によってアセンブリを使用して準備されます。すべてのプロシージャは、室温で行われました。

1. 蛍光染料を囲む多孔性の CaCO₃ microcores を合成するには、ミックス (FITC BSA などほとんどの高分子と結合蛍光染料を使用できます) パク-1-デキストラン溶液 2 mL ~ 2 Mg/ml の濃度で 0.6 ml 各 CaCl 2_{溶液 1 mol/L の}と高速攪拌下で Na₂CO₃ 。
   注: は、退色; に蛍光染料の別の感度に注意を払う(パク-1) のような光に敏感な蛍光プローブを使用すると場合、は、可能な限り小さな光として微粒子の操作・と実行する必要があります。
2. 撹拌の 5-10 秒後に転送懸濁液 2 mL マイクロ遠心チューブ用と 15 の遠心載荷 CaCO₃ microcores をペレッ....

Results

得られた結果は、提案するプロトコルの 3 つの主要なカテゴリのいずれかから来る: 蛍光色素 (図 1)、さらに可視化とマイクロ カプセルの腎臓射出カプセル化による蛍光微粒子の形成(図 2 および 3) 毛細血管を鰓と、最後に、生体内でスペクトルの記録を監視するパク-1 蛍光血液の pH のレベル (図 4)。

逆に複数の層で染料を囲むテンプレート CaCO₃コアのコーティングを使用して層によってアプローチ荷電高分子鎖 (PSS および PAH) と生体適合性高分子 (PLL-g-PEG) の最も外側の層は、シンプルでコスト効果の高い方法パク-1-デキストラン、FITC .......

Discussion

ゼブラフィッシュ腎臓の微粒子による注入を示すためには、インジケーター染料搭載半透過性マイクロ カプセルを使用しました。したがって、プロトコルを含む逆荷電高分子電解質^{7,8,15,16,17 の層によってアセンブリを使用してマイクロ カプセルの作製について ,18} (図 1 a)。この技術の利点は容易に利用可能な実験装置を実行します。条件、使用される化合物によっては、100 ナノメートル厚高分子シェル¹⁵μ m、0.5 から作製したマイクロ カプセルをわたります。合成パラメーターは約 2-6 μ m サイズ (

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
SNARF-1-デキストラン、70000 MW	サーモフィッシャーサイエンティフィック	D3304	蛍光プローブ。マイクロカプセルフィラーとして使用することができる他の適切なポリマー結合蛍光染料
アルブミン-フルオレセインイソチオシアネートコンジュゲート(FITC-BSA)	SIGMA	A9771	蛍光プローブ
ローダミンBイソチオシアネート-デキストラン(RITC-デキストラン)	SIGMA	R9379	蛍光プローブ
塩化カルシウム	SIGMA	C1016	CaCO3テンプレート形成
炭酸ナトリウム	SIGMA	S7795	CaCO3 テンプレート形成
ポリ(塩酸アリルアミン)、MW 50000 (PAH)	シグマ	283215	カチオン性ポリマー
ポリ(4-スチレンスルホン酸ナトリウム)、MW 70000 (PSS)	SIGMA	243051	アニオン性ポリマー
Poly-L-lysine [20 kDa]、g = 3.0 〜 4.5 (PLL-g-PEG)	SuSoS	PLL(20)-g[3.5]-PEG(5)	マイクロカプセルの生体適合性を高める最終ポリマー
塩化ナトリウム	SIGMA	S8776	塗布ポリマーの溶解
浄水システム	ミリポア	SIMSV0000	脱イオン水の調製
マグネチックスターラー			CaCO3テンプレート形成用
エッペンドルフ 研究内容 プラスピペット、1000&マイクロ;L	エッペンドルフ		ドージング ソリューション
エッペンドルフ 研究内容 プラスピペット、10&マイクロ;L	Eppendorf		Dosing solutions
ピペットチップ、容量範囲 200 〜 1000 & マイクロ;L	FL Medical	28093	投与ソリューション
ピペットチップ、容量範囲 0.1-10 μL	エッペンドルフ	Z640069	ドージングソリューション
ミニ遠心分離機 マイクロスピン12、高速	バイオサン		マイクロカプセル遠心分離洗浄手順用
マイクロ遠心チューブ、2mL	エッペンドルフ	Z666513	マイクロカプセル合成・保存
シェーカー Intelli-mixer RM-1L	ELMY Ltd.		マイクロカプセルの凝集を減らすには
超音波洗浄機			マイクロカプセルの凝集を減らすには
ヘッドフォン			超音波から耳を保護するには
エチレンジアミン四酢酸	SIGMA	EDS	CaCO3テンプレートを溶解するには
リン酸ナトリウム	SIGMA	S9638	pH緩衝液の調製
リン酸二ナトリウム	SIGMA	S9390	pH緩衝液の調製
水酸化ナトリウム	SIGMA	S8045	EDTA溶液とバッファーのpHを調整するには
サーモスタットチャンバー			ガラススライドでマイクロカプセルを乾燥させるには
血球計算盤 血液細胞数チャンバー			調製したマイクロカプセルのサイズ分布と濃度を調査するには
蛍光顕微鏡 Mikmed 2	LOMO		魚の血液
中のマイクロカプセルの生体内可視化SNARF-1用の蛍光フィルターのセット(顕微鏡のモデルに応じて選択する必要があります;例が提供されます)	Chroma	79010	蛍光プローブによるマイクロカプセルの視覚化
ファイバー分光計 QE Pro	オーシャンオプティクス		顕微鏡下でのマイクロカプセルのキャリブレーション
光ファイバー QP400-2-VIS NIR、400 μm, 2 m	オーシャンオプティクス		顕微鏡ポートと分光器を接続するには
コリメーター F280SMA-A	Thorlabs		顕微鏡ポートと分光器を接続するには
ガラス顕微鏡スライド	フィッシャーブランド	12-550-A3	顕微鏡下でのマイクロカプセルの校正
カバースリップ、22 x 22 mm	パール	MS-SLIDCV	顕微鏡
下でのマイクロカプセルの校正ガラスマイクロキャピラリー Intra MARK, 10 & micro;L	Blaubrand	BR708709	魚の血液を収集する
クローブオイル	SIGMA	C8392	魚の麻酔
Lancet No 11	Apexmed international B.V.	P00588	魚の尾を切断し、インスリン自己注射器ヘパリンの先端から鋼針を解放するには
、5000 U/mL	Calbiochem	L6510-BC	魚の採血中に魚の血液と接触するすべての表面を処理するため
電極を備えた Seven 2 Go Pro pH メーター	メトラー・トレド		魚の血液の pH を測定するには
インスリン ペン針 Micro-Fine Plus、 0.25 x 5 mm	ベクトン、ディキンソン、カンパニー		注射手順用。任意の細い針(Ø 0.33 mm以下)が適切です
ガラスキャピラリー、1 x 75 mm	Hirschmann Laborgeräte GmbH &Co	9201075	インジェクション手順用
ガストーチ			ガラスキャピラリーにスチールニードルをはんだ付けする
マイクロインジェクター IM-9B	NARISHIGE		マイクロカプセル懸濁液の精密な投与用
シャーレ、60mm×15mm、ポリスチレン	SIGMA	P5481	麻酔下での魚の操作用
プラスチックスプーン			麻酔下の魚の操作用
湿ったスポンジ			麻酔下の魚の操作用
解剖ハサミ	サーモサイエンティフィック	31212	魚の頭から鰓カバーを取り外すには
パスツールピペット、3.5mL	ブランド	Z331767	魚の鰓を湿らせるには