分裂酵母におけるプロテアソーム変異体のヘテロクロマチン不安定を選択するランダムな変異を遺伝子をターゲットとしました。

順遺伝学は、研究者が特定の表現型を表示する自然発生する突然変異体を求めるし、遺伝学的解析を行う古典的な方法です。逆遺伝学の興味の遺伝子に突然変異を導入し、表現型を検討します。後者の場合、ターゲット遺伝子のランダムな変異は突然変異体感温性などの所望の表現型を選択、その後または酵素活性の変更のプールを生成するよく使用されます。エラーを起こしやすい PCR¹を含むランダムな突然変異の誘発を達成するために様々 な方法を使用する場合があります。UV 照射²;亜硝酸³; メタンスルホン酸エチル (EMS) などの化学変異原物質mutD5 ⁴の発現などの一時的なミューテーター系統の使用DNA シャフリング⁵。

ここでは、分裂酵母のターゲット遺伝子の突然変異体のプールを生成するエラーを起こしやすい PCR を利用逆遺伝学的方法をについて説明します。1 つは、その名前から推測かもしれない、この方法意図的に PCR の間にエラーが発生して突然変異を生成します。他の突然変異誘発の方法とは異なりエラーを起こしやすい PCR はある突然変異誘発する領域を定義するユーザーをことができます。これにより、目的のタンパク質/ドメインの機能を勉強する努力に特に役立ちます。

このランダム変異導入手順を示すためには、我々 ここrpt4 +を使用分 19 秒プロテアソームのサブユニットをエンコードし、例として。Rpt4 分裂酵母^6,7,8,9, 以外の生物のタンパク質分解に依存しない機能を持っている示されている、タンパク質分解の欠陥の原因タンパク質を変えることによって間接効果レベル。我々 は、したがって、ヘテロクロマチンのプロテアソームの機能の調査の目標の分解に依存しない変更を引き起こした突然変異体のスクリーニングします。

エラーを起こしやすい PCR プライマーのバインド場所をチューニングすることによって遺伝子領域に適用できます。目的の表現型変更を示す変異体は、適切な記者と識別できます。ここでは、我々 は挿入、 ade6 +記者を利用、セントロメア 1 外側を繰り返す (otr) 地域¹⁰。¹¹この地域では、構成のヘテロクロマチンを形成すると、野生型条件でade6 +記者を黙らせたのでこれは、赤色のコロニー¹⁰で示されます。動原体で構成のヘテロクロマチンを不安定化突然変異は、白人の植民地として可視化ade6 +記者、発現に します。

1. 媒体の作製

1. 準備酵母エキス サプリメント (はい)、はいアデニン (はい低 Ade)、酵母のグルタミン酸媒体 (PMG¹²) および PMG なしアデニン (PMG Ade) なしの表 1に示すようにコンポーネントを混合することによって。はいエイド (低 Ade) と PMG Ade プレートがすべての同じコンポーネント、アデニンを後者から省略すると。
   1. 次の塩 (50 x) ストックを使用: 52.5 g/L MgCl₂·6H₂O、2 グラム/L の CaCl₂·2H₂O、50 g/L 塩化カリウム、2 グラム/L の Na₂₄蒸留水です。フィルター孔径 0.22 μ m フィルターを使用して殺菌して 4 ° C で保存
   2. 次のビタミンを使用して (1、000 x) 在庫: 1 g/L パントテン酸 10 g/L ニコチン酸、イノシトール 10 g/L、蒸留水で 10 mg/L ビオチン。フィルター孔径 0.22 μ m フィルターを使用して殺菌して 4 ° C で保存
   3. 次の鉱物を使用 (10, 000 x) 在庫: ホウ酸 5 g/L、4 g/L MnSO₄、4 g/L ZnSO₄·7H₂O, 2 g/L した FeCl₂·4H₂O, 0.4 g/L MoO₃, 1 g/L KI、0.4 g/L CuSO₄·5H₂O、蒸留水の 10 g/L のクエン酸。フィルター孔径 0.22 μ m フィルターを使用して殺菌して 4 ° C で保存
      注: はい液体培地を寒天を省略することで可能です。
2. オートクレーブ中 200 rpm の速度での攪拌棒で攪拌しながら 60 ° C 以下に冷却します。
3. はい + G418 (ジェネティシン) プレートはい中 1 mL/L G418 原液を追加します。
   1. 次の G418 を使用 (1、000 x) 在庫: 100 mg/mL G418 蒸留水で。フィルター滅菌-20 ° C で 0.22 μ m の細孔径のフィルター、およびストアの 1.5 mL 遠心チューブに分注を使用して
4. 90 mm シャーレ (約 40 シャーレ中の因数の 1 L に別の 5-10 分、因数のメディアをかき混ぜる.4 ° C でプレートを保存します。

2. クローンのrpt4 +とその 5/3' UTRs

1. プライマー p1 と p2 で PCR を行う (図 1 a) (〜 1 μ g DNA、20 U 酵素反応バッファー x 1)、50 μ L の総ボリュームでテンプレートとしてゲノム DNA (gDNA) を酵母分裂を使用して、3,315 ベースを増幅して表 2に示す反応サイクルを適用します。ペア (bp) のフラグメントは、 rpt4 +とその 5/3' UTRs で構成されます。PCR の製品の浄化キット¹³を使用して (図 1 a) の製造元の指示に従ってを浄化します。
2. PBlueScript KS(-) ベクトル¹⁴と 16-18 の水浴の 37 ° C でrpt4 +とその 5/3' BamH1とXho1 UTRs 20 μ L (〜 1 μ g の DNA、20 U 酵素、1 x 消化バッファー) の総量を含む増幅された DNA 断片をダイジェストします。h (図 1 b)。
3. ゲル浄化消化ベクトル (1.2% の agarose のゲル)、DNA を挿入 TAE を用いたアガロース電気泳動 (100 V、1 h) を実行する、任意の大きさの DNA バンドを切除し、ゲル抽出キット¹⁵で DNA を分離することです。
4. ベクトルとベクトル DNA の 50-100 ng を含む 20 μ L の ligation の反作用を実行することによって T4 DNA リガーゼを使って DNA 挿入を縛る、~ 3 倍モル過剰挿入 DNA、400 U T4 DNA リガーゼと結紮バッファー × 1。16-18 h の 18 ° C でこの混合物を孵化させなさい。
5. 70 の熱ショックを適用することによって大腸菌DH5α の 100 μ L に結紮の DNA を変換 42 ° C で sポンドの 1 つの mL を追加し、回復の 37 ° C で 1 時間インキュベートします。遠心分離 (13,800 x g) を実行、変換されたエシェリヒア属大腸菌のすべてが LB アンピシリン (ラ) プレート細胞培養上清、, 16 h の 37 ° C で板を破棄します。
6. つまようじで 4-8 コロニーをピックアップし、37 ° c 3 mL ラ中で一晩成長します。
7. 製造元のプロトコルに従って使用されるプラスミド精製キット¹⁶で、プラスミドを分離し、孤立したプラスミド (BamH1と各制限酵素の 5 U の 5 μ L で分析の制限の酵素の消化力を実行Xho1) と制限バッファー × 1。3 h 候補プラスミドを配列することによってクローニング確認の水浴の 37 ° C で反応混合物を孵化させなさい。

3. サイレント突然変異 (Xho1制限サイト) の導入

1. それ以外の場合補足シーケンスの望ましい突然変異を含む 33 bp プライマー (p3 および p4) のペアを設計します。
2. 25 μ L の総ボリューム内の忠実度の高いポリメラーゼ¹⁷ (図 1) と PCR を行う (10 複製プラスミド、10 pmol プライマー ミックス、2 U 酵素反応バッファーの 1 つの x の 2 μ L の ng) サイクリングのパラメーターを使用して表 3に記載されています。
3. Dpnを 1 時間水に 37 ° C で 20 μ L (20 U 酵素, 1 x 消化バッファー) の容量でお風呂が付いているテンプレート プラスミッドを消化します。
4. 変換、伝達、分離、および 2.5 2.7 の手順に記載されている、サイレント突然変異を含んでいるプラスミッドをシーケンスします。
   注:¹⁸の単一の反作用の複数の DNA のフラグメントの結合に関することができますクローンの作成方法を使用しても、サイレント突然変異を導入できます。

4 rpt4 +エラーを起こしやすい PCR によるランダム変異導入

1. テンプレート、プライマー p5、p6、50 μ L (4.1.1 10 pmol プライマー ミックス、2.5 U 酵素、1 x 反作用バッファーの 2 μ L のステップで定義したテンプレートの量) の総量と、プラスミドを用いたサイレント突然変異 (Xho1サイト)、エラーを起こしやすい PCR を実行します。、高いエラーを生成するために設計されている特別なポリメラーゼ率¹⁹ (図 1)。表 2に説明されているように、PCR を実行します。
   1. 4-5 μ g のプラスミド テンプレートを使用して、1 bp/kb (プラスミド) に突然変異の頻度を制御します。
      注:高濃度 (> 500 ng/μ L) プラスミド ミニ準備キット²⁰を使用して入手することが、必要です。
2. ゲル電気泳動を使用して 2670 bp (1.2% の agarose のゲル) の PCR の製品を確認します。ゲルは、2.5 の手順で説明されているようにこの PCR の製品を浄化します。

5. フュージョン PCR のフラグメント (菅、3' UTR) の準備

1. テンプレート、プライマー p7 と p8, pFA6a KANMX6²¹を使用して PCR を行い、マーカー (菅) フラグメントを取得する表 4 に記載されている条件。ゲルは、2.5 (図 1E) の手順で説明するように結果 1,480 bp のフラグメントを浄化します。
   1. 突然変異とその隣接遺伝子のコーディングの地域を対象とする遺伝子の終止コドンが 500 以上で区切られたかどうかチェックしてください bp。この地域が 500 未満の場合は、内因性のターミネータを使用できません bp;むしろ、内因性のターミネーターではなくADHターミネータを使用ください。ADHの終端文字を使用するために必要なプロトコルの変更は、表 5に掲載されています。
      注:これらの変更は、内因性のターミネーターではなく pFA6a 3HA KANMX6 プラスミドであり、 ADHの終端記号を使用する場合にのみ適用されます。
2. クローンとrpt4 +PCR を実行-テンプレートとプライマー p9、p10 の総量が 50 μ L のベクターを含む (20 クローンのプラスミド、10 pmol プライマー ミックス、2 U 酵素反応バッファーの 1 つの x の 2 μ L の ng)、表 6に提示条件を使用して。ゲルは、得られた 506 bp 3' UTR フラグメント (図 1E) を浄化します。

6. 融合 PCR (図 1E) による変換のコンス トラクターの生成

1. 50 ng/μ L で 3 フラグメント (人為rpt4 +菅、および 3' UTR) を準備します。
2. 表 7 に記載されている 3 つの PCR プライマー p11 と p12 を使用して片融合を実行します。(フュージョン PCR のためのプロトコルは元プロトコル²²の変更) です。主要な 4,398 bp の PCR の製品を浄化します。
   1. Rpt4 +を使用: KAN:3'UTR の 1 の割合で断片: 3:1 最適な結果を得るのため。
      注:挿入 DNA の総量が 500 を超えない ng。Rpt4 +の推奨量: KAN:3'UTR は 50 ng:150 ng:50 ng。人為の領域は、他の 3 つに変異が各拠点のすべての可能な組み合わせを占めるイースト コロニーの最小数は 1,600 x 3 = 4,800 約 1.6 kb の植民地。変換反応の 1 つは通常 400-500 コロニーを生成、ため融合 PCR を構築の価値が少なくとも 10 の反応が必要です。10 の要因によって単に反応量 (すなわち、 PCR チューブの数) を増やすことによってこの必要性を満たすことが。

7. 電気穿孔法 (図 1 f) による分裂酵母の変換

1. 16 時間以上インキュベートし飽和する [はい] 媒体の 10 mL には、酵母を接種します。
2. 600 の光学濃度に細胞を希釈はい中の 0.2 で 200 mL の nm (外径₆₀₀), 外径₆₀₀ 5-6 時間振とうしながら 30 ° C で、= 0.6 - 0.8。
3. 外径₆₀₀細胞を集中 = 30、4 つの 50 mL の円錐管に省略し、10 分間氷で冷やします。
4. 4 ° C で 3 分間 1,050 × g で遠心分離を行い、細胞を収穫します。チューブと 10 電気キュベットを氷の上に配置します。氷上 7.3 7.8 の手順に従います。
5. 上澄みを廃棄し、1.2 M ソルビトールの 15 mL を加えます。細胞を再懸濁しますチューブを軽く振る。
6. 4 ° C で 3 分間 1050 x g で細胞を遠心分離します。
7. 7.4 と 7.5 の手順を繰り返します。上清を捨てます。各管に 1.2 M ソルビトールの 500 μ L を追加、細胞を再懸濁します、1 つ 15 ml の円錐管の細胞のすべてを収集します。
8. 1.2 M ソルビトールを追加 2.4 mL (外径₆₀₀ = 0.2 mL あたり 10)。氷の上の管を保ちます。
9. (彼らは十分に中断された確認) ソルビトール中断セルを 200 μ l 添加フュージョン PCR を含む EP 管の構築、ミックスも、および電気キュベットにサンプルを転送します。
10. Electroporate 次のオプションを持つセル: 菌類、ShS (2.00kV、1 パルス)。
11. 800 μ L の総ボリュームの場合は、各電気キュベットに 1.2 M ソルビトール 600 μ L を追加し、広がる 4 つはいプレート (200 μ L/プレート) のセル。10 電気キュベットをはいプレート 40 に分配されます。
12. 30 ° C 24 時間で版を孵化させなさい。
13. はい + G418 レプリカ メッキを行い、3 日間の 30 ° C でプレートを孵化させなさい。

8. 各種ヘテロクロマチン不安定変異体や偽陽性を確認

1. 各はい + G418 プレート レプリカ メッキはいエイド (低 Ade) と PMG エイド (いいえ Ade) プレートを実行します。はい Ade プレート上の植民地のいくつかは赤い着色 (図 1) を示すまで 30 の ° C で 1-2 日のレプリカ版を孵化させなさい。
2. 比較はい Ade と PMG Ade のプレート地図はい Ade プレートにピンクや白、PMG Ade プレートでも育つセルを選択します。彼らは偽陽性 (例えば、菅カセットがゲノムの他の非ターゲット ・ サイトで統合されていることを反映して)、PMG エイドに成長せずコロニーを選択しないでください。
3. 各植民地から約 1 x 10 の⁵セルを選ぶし、SPZ 溶液 2.5 mg/mL ザイモリエイス 100 T コロニー PCR (図 1 H) の開始テンプレートとしてを実行するこのソリューションの少なくとも 30 分使用 1 μ L の 37 ° C で 10 μ L で孵化させなさい。
   1. 15 mL の蒸留水 (最終 pH 7.5) 0.95 mL NaH₂PO₄ 1 M Na₂HPO₄4.05 mL 2 M ソルビトール 30 mL を混合することによって SPZ (50 mL) を作る。サンプル (5 mL) をザイモリエイスを補充し、使用するまで 500 μ 因数-20 ° C で保存できます。
4. ゲル電気泳動 (1.2% の agarose のゲル、180 v、20 分) の結果 + コロニー PCR を視覚化するを実行します。適切なサイズの PCR バンドを展示、 Xhoと各反応生成物の 5 μ L を消化反応を選択 (4 U 酵素、1 x 消化バッファー、37 ° C の水浴、1 h) 偽陽性 (図 1 H) を選別する私。
5. XhoIダイジェスト (1.2% の Agarose のゲル、180 V、20 分) を視覚化するゲルの電気泳動を行います。コロニー PCR 製品XhoI、によってカットされ、はい + G418 プレート (図 1I) それらをパッチをマークします。
6. 分裂酵母細胞から gDNA を分離し、PCR の製品²³のシーケンスを実行します。(図 1I) の突然変異を識別するために野生型シーケンスで得られたシーケンスを比較します。
7. 直接融合構造変異細胞²³から PCR によって増幅にそれらを変換することによって野生型細胞に遺伝を再導入します。スポッティング スコープを使用すると、新しく作られた突然変異体の細胞 (図 1 j) の表現型を確認できます。
   1. プライマー p1 と p10 簡単に融合変換コンス トラクター PCR によって増幅することができます (〜 1 μ g DNA、20 U 酵素反応バッファー x 1)、50 μ L の総ボリュームでテンプレートとして変異体のゲノム DNA を使用し、表 2 に記載されている反応サイクルを適用.コンス トラクターの変換は、7.1 7.13 の手順で行うことができます。

以下の図 1に示した手順で取得した Rpt4 変異体は、コロニーの色を評価することによって分析できます。コロニーの色が図 2の細胞数の減少に関連するプレートに斑点を付けます。異質染色質領域に挿入ade6 +記者は、野生型の沈黙し、はい Ade プレートで赤色のコロニーを示しています。Ade6 +記者の表現をヘテロクロマチンを不安定にして、一度、 clr4Δ変異体のようにはい Ade プレートで白人の植民地を観察できます。スクリーンの Rpt4 変異体では、とおりです。rpt4 1の変異体は、ヘテロクロマチンの最も深刻な不安定化を示しています。

図 1: プロトコルの概略図。(A)プライマー 1 と 2 で行われる PCR の最初のラウンドで得られる PCR の製品の概略図。(B)制限に基づくrpt4 +断片のクローニング。(C)クローンとして作られたベクターのサイト指示された突然変異誘発、 XhoI制限のサイトを追加するサイレント突然変異を導入するためです。(D) rpt4 +コード領域のランダム変異がエラーを起こしやすい PCR を使用して実行されます。(E)変異rpt4 +フラグメント、菅断片と 3' UTR フラグメント融合変換対応カセットを生成する PCR によって結合されます。(F)分裂酵母細胞の相同組み換えによる内因性rpt4 +シーケンスを置き換えます、PCR 構造の融合で変換されます。(G)菅首相が選択したコロニーがはいエイド (低 Ade) と PMG エイド (いいえ Ade) プレートにメッキのレプリカ、肯定的なコロニーが選択されます。(H) PCR し PCR プロダクトのそれに続くXhoI制限は、誤検出を避けるために使用されます。(I)表現型を引き起こす突然変異選択したコロニー、細胞の伝播、ゲノム DNA (gDNA) の抽出とrpt4 +の関連する部分のシーケンスの修正プログラムの適用によって識別されます。(J)原因となる変異が確認された (および偽陽性を排除) 野生型細胞に突然変異を直接ご紹介します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 2:Rpt4 のヘテロクロマチン解消抑圧変異します。Otr1::ade6 +記者 (top) の模式図。選択スクリーン Rpt4 変異体の割増のシリアル希薄をヘテロクロマチンの不安定化 (下) のレベルを増加の順序で示されているプレートの上に発見されました。この図は、'19S プロテアソームは直接に関与する分裂酵母における拡散異質染色質の' Seo et al., 201724記事から変更されました。非トリミング図は、元の記事で見つけることができます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

表 1。[はい] のコンポーネントおよび PMG プレート

表 2。サイト指示された突然変異誘発 PCR 推奨プログラム

表 3。エラーを起こしやすい PCR のための推薦された PCR プログラム

表 4。菅のフラグメントを取得するため PCR プログラムをお勧めします

表 5。内因性のターミネーターではなく ADH の終端文字を使用する場合に必要な変更

表 6。3' UTR フラグメントを取得するため PCR プログラムをお勧めします

表 7。融合 PCR のための推薦された PCR プログラム

本研究で使用されるテーブル S1: ひずみ

本研究で使用されるプライマーのテーブル S2: 一覧

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