この資料では、分裂酵母のターゲット遺伝子のランダム突然変異誘発のための詳細な方法論について説明します。たとえば、ターゲットrpt4 +、19 s プロテアソームと不安定にする異質染色質の変異のためのスクリーンの亜単位を符号化します。
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方法論記事
分裂酵母におけるプロテアソーム変異体のヘテロクロマチン不安定を選択するランダムな変異を遺伝子をターゲットとしました。
この記事について
サマリー
要約
ターゲット遺伝子のランダムな変異は、所望の表現型をもたらす突然変異を識別するために使用されます。ランダム変異導入を達成するために使用できるメソッドのエラーを起こしやすい PCR は突然変異体の多様なプールを生成するための便利で効率的な戦略 (すなわち。、変異ライブラリー)。エラーを起こしやすい PCR は、影響を受けない他のゲノム領域を残しながら遺伝子のコーディングの地域などの定義済みの領域の変異するように努める研究者選択の方法です。変異ライブラリーは、エラーを起こしやすい PCR によって増幅は後、に適切なプラスミド複製する必要があります。エラーを起こしやすい PCR によって生成されたライブラリのサイズは、クローン作成のステップの効率によって制限されます。ただし、分裂酵母、分裂酵母、クローン作成のステップは非常に効率的なワンステップ融合変換の構成要素を生成する PCR を使用して置き換えることができます。所望の表現型の変異体は、適切な記者を使用して選択できます。ここでは、我々 例、動原体ヘテロクロマチンに挿入されるレポーターとしてこの戦略を詳細をについて説明します。
概要
順遺伝学は、研究者が特定の表現型を表示する自然発生する突然変異体を求めるし、遺伝学的解析を行う古典的な方法です。逆遺伝学の興味の遺伝子に突然変異を導入し、表現型を検討します。後者の場合、ターゲット遺伝子のランダムな変異は突然変異体感温性などの所望の表現型を選択、その後または酵素活性の変更のプールを生成するよく使用されます。エラーを起こしやすい PCR1を含むランダムな突然変異の誘発を達成するために様々 な方法を使用する場合があります。UV 照射2;亜硝酸3; メタンスルホン酸エチル (EMS) などの化学変異原物質mutD5 4の発現などの一時的なミューテーター系統の使用DNA シャフリング5。
ここでは、分裂酵母のターゲット遺伝子の突然変異体のプールを生成するエラーを起こしやすい PCR を利用逆遺伝学的方法をについて説明します。1 つは、その名前から推測かもしれない、この方法意図的に PCR の間にエラーが発生して突然変異を生成します。他の突然変異誘発の方法とは異なりエラーを起こしやすい PCR はある突然変異誘発する領域を定義するユーザーをことができます。これにより、目的のタンパク質/ドメインの機能を勉強する努力に....
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プロトコル
1. 媒体の作製
- 準備酵母エキス サプリメント (はい)、はいアデニン (はい低 Ade)、酵母のグルタミン酸媒体 (PMG12) および PMG なしアデニン (PMG Ade) なしの表 1に示すようにコンポーネントを混合することによって。はいエイド (低 Ade) と PMG Ade プレートがすべての同じコンポーネント、アデニンを後者から省略すると。
- 次の塩 (50 x) ストックを使用: 52.5 g/L MgCl2·6H2O、2 グラム/L の CaCl2·2H2O、50 g/L 塩化カリウム、2 グラム/L の Na24蒸留水です。フィルター孔径 0.22 μ m フィルターを使用して殺菌して 4 ° C で保存
- 次のビタミンを使用して (1、000 x) 在庫: 1 g/L パントテン酸 10 g/L ニコチン酸、イノシトール 10 g/L、蒸留水で 10 mg/L ビオチン。フィルター孔径 0.22 μ m フィルターを使用して殺菌して 4 ° C で保存
- 次の鉱物を使用 (10, 000 x) 在庫: ホウ酸 5 g/L、4 g/L MnSO4、4 g/L ZnSO4·7H
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結果
以下の図 1に示した手順で取得した Rpt4 変異体は、コロニーの色を評価することによって分析できます。コロニーの色が図 2の細胞数の減少に関連するプレートに斑点を付けます。異質染色質領域に挿入ade6 +記者は、野生型の沈黙し、はい Ade プレートで赤色のコロニーを示しています。Ade6 +記者の表現をヘテロクロマチンを不安定にして、一度、 clr4Δ変異体のようにはい Ade プレートで白人の植民地を観察できます。スクリーンの Rpt4 変異体では、とおりです。rpt4 1の変異体は、ヘテロクロマチンの最も深刻な不安定化を示しています。
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ディスカッション
エラーを起こしやすい PCR によってランダムな突然変異は、特定の地域の突然変異体の多様なプールを生成するための強力なツールです。この手法は、特定の状況下でのタンパク質の機能を査定しようとする研究の場合に特に便利です。たとえば、我々 はここヘテロクロマチン メンテナンスで、Rpt4、19 秒プロテアソーム サブユニットの機能を評価するためにエラーを起こしやすい PCR を使用しました。変化させることによりエラーが発生しやすい PCR の対象となる地域、関心と所望の表現型のためのスクリーンのゲノム領域で細胞を変異させるができた、スクリーニング条件を調整すること。最近では、同様のメソッドは、スピンドル極体コンポーネント25の遺伝子変異分裂酵母細胞を分離する使用されました。
ランダムな突然変異の主な利点は、非本質的な必要不可欠な遺伝子に適用される可能性です。必須遺伝子のランダムな変異は、細胞生存率を維持することができる微妙なおよび/または部分の機能的な欠陥を持つものなど、多様な変異体またはその関数は特定の条件下でのみ影響を受ける変異をもたら.......
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開示事項
著者が明らかに何もありません。
謝辞
このプロジェクトの支援の資金調達は、基本的な科学研究開発プログラムを通じて、国立研究財団の韓国 (NRF) 科学省と ICT (2016R1A2B2006354) によって資金を供給によって提供されました。
....アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| <ストロング>1.Media | |||
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-10KG | |
| 酵母抽出物 | BD Biosciences | 212720 | |
| L-ロイシン | JUNSEI | 87070-0310 | |
| アデニン硫酸塩 | ACR | 16363-0250 | |
| ウラシル | Sigma-Aldrich | U0750 | |
| L-ヒスチジン | Sigma-Aldrich | H8125 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 1.05108.0050 | |
| NaCl | JUNSEI | 19015-0350 | |
| MgSO4•7H2O | Sigma-Aldrich | 63140 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 12095 | |
| フタル酸カリウム | Sigma-Aldrich | P6758-500G | |
| イノシトール | Sigma-Aldrich | I7508-50G | |
| ビオチン | Sigma-Aldrich | B4501-100MG | |
| ホウ酸 | Sigma-Aldrich | B6768-1KG | |
| MnSO4 | Sigma-Aldrich | M7634-500G | |
| ZnSO4•7H2O | 純正 | 83060-031 | |
| FeCl2•4H2O | 関東 | CB8943686 | |
| リブデン酸ナトリウム二水和物 | 薬栗 | 31621 | |
| 木 | 純正 | 80090-0301 | |
| CuSO4•5H2O | 薬久里 | 09605 | |
| D-ミオイノシトール | MP バイオメディカル | 102052 | |
| パントテン酸 | 薬栗 | 26003 | |
| ニコチン酸 | Σ-アルドリッチ | N4126-500G | |
| (NH4)2SO4 | シグマ・アルドリッチ | A4418-100G | |
| アガロー | 生体塩基性 | D0012 | |
| G418、遺伝性 | LPS | G41805 | |
| 2。Enzyme reactions | |||
| PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase | Aglient | 600380 | 部位特異的突然変異導入用 |
| GeneMorphII ランダム突然変異導入キット | Aglient | 200500 | エラーを起こしやすいPCR |
| 用 Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | Thermo Fisher | F-530L | For fusion PCR |
| Ex Taq DNAポリメラーゼ | タカラ | RR001b | 一般PCR用 |
| BamH1 | ニューイングランドバイオラボ | R0136S | |
| Xho1 | ニューイングランドバイオラボ | R0146S | |
| DPN1 | ニューイングランドバイオラボ | R0176S | |
| 3.設備 | |||
| Velveteen正方形、黒 | VWR | 89033-116 | レプリカ用 |
| メッキツール | レプリカ | ||
| MicroPulserエレクトロポ | レーターBiorad | 1652100 | 分裂酵母の形質転換に |
| エレクトロポレーションキュベット、0.2 cmギャップ | ラッド | 1652086 | 分裂酵母の形質転換に |
| Thermal Cycler | Bioer | BYQ6078 | 融合PCRランプ反応用 |
参考文献
- Pritchard, L., Corne, D., Kell, D., Rowland, J., Winson, M. A general model of error-prone PCR. J Theor Biol. 234 (4), 497-509 (2005).
- Pfeifer, G. P., You, Y. H., Besaratinia, A. Mutations induced by ultraviolet light. Mutat Res. 571 (1-2), 19-31 (2005).
- Moreno, S., Klar, A., Nurse, P.
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再版と許可
