Method Article

ラムダを選択cII変異検出システム

DOI:

10.3791/57510

⸱

April 26th, 2018

 , 
1Department of Preventive Medicine, USC Keck School of Medicine, University of Southern California

In This Article

Summary

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トランスジェニックげっ歯類の培養細胞でラムダを選択cII突然変異試験または興味の化学/物理エージェントで治療対応する動物のための詳しいプロトコルについて述べる。このアプローチは、哺乳類細胞における発がん性物質の変異原性試験のため広く使用されています。

Abstract

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トランスジェニック動物モデルおよび突然変異検出システムの数は、哺乳類細胞における発がん性物質の変異原性試験のために開発されています。これらのトランスジェニック マウスとラムダ (λ) の選択cII変異検出システム世界中の多くの研究グループによって変異原性実験のため採用されています。ここでは、ラムダを選択cII突然変異試験は、トランスジェニック マウス/ラットの培養細胞に適用することができるための詳しいプロトコルについて述べるまたは興味の化学/物理エージェントに対応する動物が扱われます。プロトコルは、次の手順で構成されます: (1) 分離細胞からゲノム dna やトランスジェニック動物の臓器・組織生体外でまたは生体内で、それぞれで治療テスト混合物;(ゲノム DNA からの (すなわち、 cII遺伝子) の変異レポーター遺伝子を運ぶラムダ シャトルベクターの回復 2)(伝染性のバクテリオファージに救助されたベクトルの包装 3)(4) ホストの細菌に感染して誘導cII突然変異の伝播を許可する選択的な条件下で培養(5) 得点cII-変異体と DNA シーケンスをそれぞれcII突然変異頻度および突然変異スペクトルを分析します。

Introduction

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トランスジェニック動物モデルおよび突然変異検出システムの広い範囲は、哺乳類細胞における発がん性物質の変異原性試験のために開発されています。これらの大きなブルー (以下 bb) トランスジェニック マウスと λ 選択cII変異検出システムで採用されている変異原性実験のためこのグループは、多くの他研究グループ世界中1,の2、 3,4,5,6,7,8,9。過去 16 年間、これらのトランスジェニック動物を用いた化学的および/または物理的な剤の変異原性の効果を調べたか、対応する胚性線維芽細胞培養テスト混合物と扱われ、その後の分析、λ 選択cIIアッセイおよび DNA の配列、それぞれ10、11

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Protocol

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1 マウス胚性線維芽細胞からゲノム DNA の隔離

注: プライマリ マウス胚性線維芽細胞は、公開されたプロトコル53によると BB C57BL/6 遺伝的背景を持つトランスジェニック マウス由来の胚から分離されます。このプロトコルのための開始材料は、1 x 106 1 x 107胚性線維芽細胞細胞制御化合物とテストで構成されます。収穫と標準的な方法を使用して、これらのセルのカウントは、参照10,,5455のとおりです。

  1. 準備バッファー、(0.3 M ショ糖、60 mM KCl、15 mM の NaCl、60 mM トリス-HCl、pH 8.0、スペルミジン 0.5 mM、0.15 mM スペルミンと 2 ミリメートルの EDTA)、B (150 mM NaCl と 5 ミリメートルの EDTA、pH 7.8) をバッファーし、バッファー C (20 mM トリス-HCl、pH 8.0、1 %sds、20 ミリメートルの EDTA、20 mM の NaCl)、事前に、最大 1 年54,

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Results

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データ ディストリビューションによってパラメトリックまたはノンパラのテストを使用して、処置および制御グループ (すなわち、自発の突然変異体の周波数対誘導) のcIIの突然変異頻度の違いの重要性を判断します.誘導cII変異周波数別の治療グループ間での比較が行われます各種 (一対)、適用可能な統計的テスト。Χ2テストや分散分析 (ANOVA) などの他のテストは、頻度を比較する使用できますがアダムスと Skopek の超幾何テストを使用して全体的な誘導および自発の突然変異のスペクトル57を比較一般(例えば遷移、意義、挿入、または削除) の突然変異誘導・制御の突然変異スペクトル間または異なる化学物質/エージェントまたは同じ用量の変化による様々 な突然変異スペクトル間のそれぞれの特定の種類の化学/エージェント。

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Discussion

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Λ 選択cIIアッセイは、3BB の齧歯動物の臓器・組織由来細胞のゲノム DNA から回復したcII遺伝子変異の検出に使用されます。これらの形質転換動物ゲノムには染色体統合 λLIZ シャトル ベクトルは、 cIIを運ぶ複数タンデム コピーが含まれます (294 bp) とラッチ(1,080 bp) 遺伝子変異レポーター遺伝子1,2,25. λ 選択cIIアッセイは、適切なホストを感染させることができる λ ファージの頭に救助されたベクトルの包装が続いて、トランスジェニック動物の細胞・組織のゲノム DNA から λLIZ シャトル ベクトルの検索に基づいて大腸菌。その後、感染した細菌が得点とcII遺伝子の突然変異の分析を許可する選択的な条件の下で栽培されて (

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Disclosures

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すべての著者は利益相反を宣言しません。

Acknowledgements

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すべての同僚の貢献と (説明のため) この原稿に呼ばれている、結果が私たちの元の研究に協力したいと思います。作家の作品は、国立歯科・頭蓋顔面研究、国立衛生研究所 (1R01DE026043) ab の AB (California Tobacco-Related 病研究プログラムの大学からの補助金によってサポートされてTRDRP-26IR-0015) および ST (TRDRP-25IP-0001)。研究のスポンサーには、研究デザイン、データ収集、データ分析、データ解釈、レポートの執筆、出版のために提出する決定の役割はなかった。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
寒天MOバイオラボラトリーズ(株)12112-05細菌学グレード
BigDye Terminator v3.1 サイクル シーケンシング キットサーモフィッシャー サイエンティフィ4337455なし
カゼイン ペプトンアルファ AesarH26557なし
ゼラチンJ. T. Baker2124-01粉末
グリセロールフィッシャー サイエンティフィックBP 229-1 / M-13750なし
LB 寒天ッシャー サイエンティフィックBP 9724-500なし
QIAquick PCR精製キットQiagen810450 PCR精製反応
酢酸ナトリウム三水和物フィッシャーサイエンティフィックM-15756なし
Taq5000DNAポリメラーゼ キアゲン201207なし
チアミン塩酸塩マクロン ファインケミカルズ2722-57なし
トランスパック包装エキスストラタジーン社、バイオリライアンス社が買収 |シグマ・アルドリッチ(株)20022350 包装反応
トリスベースフィッシャーサイエンティフィックBP 152-1 / EC 201-064-4なし
トリプトンバイオサイエンスRC-110なし
ック フィ

References

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  1. Jakubczak, J. L., et al. Analysis of genetic instability during mammary tumor progression using a novel selection-based assay for in vivo mutations in a bacteriophage lambda transgene target. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (17), 9073-9078 (1996).
  2. Lambert, I. B., Singer, T. M., Boucher, S. E., Douglas, G. R.

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