ラムダを選択cII変異検出システム

サマリー

トランスジェニックげっ歯類の培養細胞でラムダを選択cII突然変異試験または興味の化学/物理エージェントで治療対応する動物のための詳しいプロトコルについて述べる。このアプローチは、哺乳類細胞における発がん性物質の変異原性試験のため広く使用されています。

要約

トランスジェニック動物モデルおよび突然変異検出システムの数は、哺乳類細胞における発がん性物質の変異原性試験のために開発されています。これらのトランスジェニック マウスとラムダ (λ) の選択cII変異検出システム世界中の多くの研究グループによって変異原性実験のため採用されています。ここでは、ラムダを選択cII突然変異試験は、トランスジェニック マウス/ラットの培養細胞に適用することができるための詳しいプロトコルについて述べるまたは興味の化学/物理エージェントに対応する動物が扱われます。プロトコルは、次の手順で構成されます: (1) 分離細胞からゲノム dna やトランスジェニック動物の臓器・組織生体外でまたは生体内で、それぞれで治療テスト混合物;(ゲノム DNA からの (すなわち、 cII遺伝子) の変異レポーター遺伝子を運ぶラムダ シャトルベクターの回復 2)(伝染性のバクテリオファージに救助されたベクトルの包装 3)(4) ホストの細菌に感染して誘導cII突然変異の伝播を許可する選択的な条件下で培養(5) 得点cII-変異体と DNA シーケンスをそれぞれcII突然変異頻度および突然変異スペクトルを分析します。

概要

トランスジェニック動物モデルおよび突然変異検出システムの広い範囲は、哺乳類細胞における発がん性物質の変異原性試験のために開発されています。これらの大きなブルー (以下 bb) トランスジェニック マウスと λ 選択cII変異検出システムで採用されている変異原性実験のためこのグループは、多くの他研究グループ世界中^1,の^{2、 3,4,5,6,7,8,9}。過去 16 年間、これらのトランスジェニック動物を用いた化学的および/または物理的な剤の変異原性の効果を調べたか、対応する胚性線維芽細胞培養テスト混合物と扱われ、その後の分析、λ 選択cIIアッセイおよび DNA の配列、それぞれ^10、11,12,の^13,14によってcII遺伝子の遺伝子型と表現型^{,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24}. これらのトランスジェニック動物のゲノムに複数コピー頭-尾コンカテマー^1,2,25, 染色体 4 統合バクテリオファージ λ シャトル ベクトル (λLIZ) が含まれています。ΛLIZ シャトルベクターを運ぶ 2 つの変異レポーター遺伝子、すなわち、ラッチとcII遺伝子^{1,2,25,26,27、 28,29,30,31,32,33,34,35,36、 37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47}. λ 選択cIIアッセイに基づいて λLIZ シャトル ベクトルのトランスジェニック動物^{1,2,25 の臓器・組織由来細胞のゲノム DNA からの回復}.回復 λLIZ シャトル ベクトル、インジケーター ホスト大腸菌に感染可能な λ ファージの頭にパッケージ化されます。その後、感染した細菌は、得点とcII遺伝子^1,3における変異解析を可能にする選択的な条件のもとで栽培しています。

ここ、体外治療トランスジェニック動物の細胞・臓器からゲノム DNA の隔離から成っている λ 選択cIIの試金のための詳しいプロトコルについて述べる/シャトル生体内でλLIZ の化合物は、取得テスト ベクトルgenomic DNA から、バクテリオファージ、 cIIの同定とホストエシェリヒア属大腸菌の感染感染 λ ファージにベクトルの包装- cIIの突然変異頻度を決定する選択的な条件の下で突然変異体とCII変異スペクトルを確立する dna 塩基配列解析。トランスジェニック マウス ・ ラット細胞培養体外興味の化学/物理エージェントに適用できるプロトコルまたは対応する動物の組織/臓器治療体内テスト化学/エージェント^{1、 2,4,48,49,50,51,52}。Λ 選択cIIアッセイの図式を図 1に示します。

プロトコル

1 マウス胚性線維芽細胞からゲノム DNA の隔離

注: プライマリ マウス胚性線維芽細胞は、公開されたプロトコル⁵³によると BB C57BL/6 遺伝的背景を持つトランスジェニック マウス由来の胚から分離されます。このプロトコルのための開始材料は、1 x 10⁶ 1 x 10⁷胚性線維芽細胞細胞制御化合物とテストで構成されます。収穫と標準的な方法を使用して、これらのセルのカウントは、参照^10,,5455のとおりです。

1. 準備バッファー、(0.3 M ショ糖、60 mM KCl、15 mM の NaCl、60 mM トリス-HCl、pH 8.0、スペルミジン 0.5 mM、0.15 mM スペルミンと 2 ミリメートルの EDTA)、B (150 mM NaCl と 5 ミリメートルの EDTA、pH 7.8) をバッファーし、バッファー C (20 mM トリス-HCl、pH 8.0、1 %sds、20 ミリメートルの EDTA、20 mM の NaCl)、事前に、最大 1 年^54,55(RT) 室温で保存します。
2. 上下の幅を使用して繰り返しピペッティングで 15 mL コニカル遠心管中の 1,000 μ L ピペット チップの穴 2-4 mL バッファー内セル再懸濁します。
3. 1 ボリューム (2-4 mL) バッファー A 含有 1 %octylphenoxypolyethoxyethanol (例えば、ノニデット P40) を追加ガラス血清ピペットを使用しています。
4. 5 分間氷の上管を孵化させなさい。
5. 1,000 x gで RT。 5 分間でチューブを遠心分離します。
6. 上澄みを廃棄し、ガラスの血清ピペットを使用して、10-15 mL バッファーの餌を洗浄します。
7. 2-4 mL バッファー B. でペレットを再懸濁します
8. 1 ボリューム (2-4 mL) バッファー C の含まれる 600 μ g/mL, プロテイナーゼ K を追加します。
9. 37 ° C で 3 h のチューブを孵化させなさい
10. 最終濃度 100 μ G/ml に RNase A を追加します。
11. 37 ° C でさらに 1 時間の管を孵化させなさい
12. 1 つのボリューム (2-4 mL) フェノールを追加 (0.1 で飽和する M トリス-HCl、pH 8.0):chloroform:isoamyl アルコール (25:24:1 集/巻)。
    注: フェノールは深刻な健康被害をもたらすことができます、細心の注意と扱われなければなりません。フェノールは皮膚に腐食性の高い、容易に吸収されて、それをおよび他の効果を展示します。処理フェノール、常にダブル重手袋使用、保護メガネを着用し、化学発煙のフードで働きます。
13. 4 ° C でチューブ回転上で 5 分間チューブを反転でよく混ぜる
14. 4 ° C で 5 分間 1,000 x gでチューブを遠心分離します。
15. ガラス血清ピペットを使用して新しいチューブに水相 (最上層) を削除します。
16. 水相が明確なインターフェイスは濁ったもはやまでフェノール: クロロホルム: イソアミル アルコール抽出を 1 〜 3 回繰り返します。
17. 1/10 ボリューム (200-400 μ L) 3 M 酢酸ナトリウム、pH が 5.2 に追加します。
18. 2.5 容量 (5-10 mL) 100% のエタノール (冷蔵) を追加し、2-3 分間手で軽くチューブを反転します。
19. ガラス フックで DNA をスプールし、70 %1-5 mL を含む新しい管へ転送エタノールとそれを徹底的に洗浄します。また、DNA をペレットし、70 %1-5 mL で徹底的に洗って 4 ° C で高速 (3,500 x g) チューブを遠心分離機エタノール。
20. 常温高速 (3,500 x g) チューブを遠心、上清を除去、10-15 分の DNA を風乾します。
21. 10-100 μ L TE バッファー (10 mM トリス-HCl は、1 ミリメートルの EDTA、pH 7.5) の DNA を溶解し、(1 ヶ月の短い記憶) のための 4 ° c または-20 ° C (長期記憶) のでを保存します。Λ 選択cIIの試金のための DNA の最適濃度は 0.5-1.0 μ g/μ L (TE バッファー) で⁵⁶。

2 包装反応の in Vitro 。

1. 1 つの包装反応 1 〜 5 μ g ゲノム DNA を追加 (最終巻: 8-12 μ L、ゲノム DNAセクション 1マウス治療胚性線維芽細胞の in vitro試験化合物またはコントロールから分離された) 最初を含む微量遠心チューブに反応混合物 (~ 10 μ L)。
   注: 社内準備または異なる研究室で市販 λ 包装エキスを使用します。コマーシャル パッケージの抽出キット使用ここで⁵⁶ (材料の表を参照)、赤いチューブに最初の反作用の組合せ (~ 10 μ L) が含まれているし、青いチューブに第 2 反作用の組合せ (少なくとも 5 反応 〜 70 μ L) が含まれています。
2. 30 ° C で 90 分間チューブを孵化させなさい
3. 第 2 反作用の組合せの管に必要なボリューム (〜 12 μ L) を追加します。
4. 30 ° C でさらに 90 分間チューブを孵化させなさい
5. チューブに 1.1 mL の SM バッファーを追加します。
   注: (すなわち、包装反応混合物) この溶液 1 mL は λ cIIをスクリーニングに使用されます-突然変異体。残りの部分があるのために使用されます。
   1. 5.8 g、塩化ナトリウム 2.0 g MgSO₄.7H₂O、50 mL を混合することによってSM バッファーを準備 1 M トリス-HCl (pH 7.5) と 5 mL 2% (w/v) ゼラチン。DH₂O を 1 リットル、1 年間常温で 30 分ストア用オートクレーブの最終的なボリュームに追加します。
6. 渦管 10 のパッケージ化された DNA のサンプルを含む RT (積極的なボルテックス) で s。
7. パルスは、使用する準備ができるまで遠心と氷上店でチューブをスピンします。サンプル パッケージの同じ日に使用しない場合は、追加のパッケージ化された DNA の mL あたりクロロホルム 50 μ L サンプル、渦、優しく、4 ° C で最大 2 週間保存します。

3.大腸菌G1250 細菌培養の準備

1. めっき前に少なくとも 2 日は TB1 カナマイシンの寒天にエシェリヒア属大腸菌(E. 大腸菌) G1250 から少数の細菌のストリーク プレートを確認します。
   1. とおり TB1 カナマイシンの寒天を準備します。5.0 g の塩化ナトリウム、カゼイン ペプトン 10.0 g、12.0 グラムの寒天をミックスします。800 mL dH₂O. 追加 1 mL 0.1% チアミン塩酸塩を追加します。水酸化ナトリウムと塩酸追加 7.0 に pH を合わせなさい dH₂O に 1 リットルの最終巻。
   2. ミックスも、30 分 55 ° C に冷却する許可のためのオートクレーブ50.0 mg カナマイシンを加え、混ぜます。滅菌 100 mm ペトリ皿 (皿あたり 20-25 mL) に注ぐ。2 週間で 4 ° C のプレートを格納します。
2. 少なくとも 24 時間静止の 30 ° C のインキュベーターで細菌連勝プレートを孵化させなさい。
3. メッキ前に、の 1 日は、20% (w/v) マルトース 1 M MgSO₄ソリューション 50 mL の滅菌スクリュー キャップ円錐管の 100 μ L と TB1 液体培地 10 mL を組み合わせます。
   1. とおり TB1 液体培地を準備します。ミックス 5.0 g 塩化ナトリウムおよび 10.0 g カゼイン ペプトンは、800 mL の dH₂0.1 %1 mL、塩酸チアミン、O を追加し、水酸化ナトリウムや塩酸で 7.0 に pH を合わせなさい。よく混ぜてと 30 分のオートクレーブ保存常温中 3ヶ月まで、1 リットルの最終巻に dH₂O を追加します。
   2. 20% (w/v) マルトース 1 M MgSO₄のとおり準備します。20.0 g マルトースと 24.6 g MgSO₄を混ぜます。7 H₂O は、100 mL の最終巻に dH₂O を追加します。フィルター滅菌し、4 ° C で最大 6 ヶ月間保存します。
4. 滅菌接種ループ⁵⁶を使用して細菌連勝プレートからいくつかの植民地と液体培地に接種します。
5. 一晩インキュベーター揺れ活発な動揺 (250-300 rpm) 30 ° C で液体培養を孵化させなさい。
6. めっきの日、G1250 の液体培養で細菌の細胞のペレットを室温で 10 分間 1,500 × gを含む円錐管を遠心します。
7. 上澄みを廃棄し、10 mL の 10 mm MgSO₄で細胞ペレットを再懸濁します。
8. 1:10 の吸光度を測定波長 600 nm 紫外可視分光光度計 (例えば、100 μ L 細胞懸濁液 + 900 μ L 10 mM MgSO₄)⁵⁶を使用して細胞懸濁液の希釈。
9. 10 mm MgSO₄0.5 の最終の OD₆₀₀細胞懸濁液を希釈します。外径₆₀₀ G1250エシェリヒア属大腸菌の準備のサスペンション = 0.5 の G1250 メッキ文化' と呼ばれます。
10. 氷の上 G1250 メッキ文化を保存し、1-2 時間以内使用します。

4. パッケージ化された DNA サンプルをめっき

1. パッケージ化された DNA サンプルを 1 つあたり 16 滅菌 14 × 100 mm²丸底チューブと 16 TB1 寒天プレートを準備します。スクリーニングとある (3 価 20) と価 100 の 3 つの六つの各セットから 10 が使用されます。
   1. とおり TB1 寒天を準備します。ミックス 5.0 g 塩化ナトリウム、カゼイン ペプトン 10.0 g、12.0 g、寒天は、800 mL の dH₂O と 1 mL 0.1% チアミン塩酸塩を追加します。水酸化ナトリウムと塩酸、7.0 に pH を調整し、dH₂O 1 L の最終巻を追加
   2. よく混ぜ、30 分のオートクレーブは 55 ° C に冷却し、無菌の 100 mm ペトリ皿 (皿あたり 20-25 mL) を注ぎ混合物を許可します。2 週間の 4 ° C でプレートを格納します。
      注: TB1 寒天を少なくとも 24 時間使用する前に準備必要があります。
2. 分注 200 μ L 各丸底チューブに G1250 メッキ文化。
3. あるのため、パッケージ化された DNA のサンプルの 1: 100 希釈を行うし、(すなわち、10 μ L のパッケージ化された DNA サンプル + 990 μ SM バッファー) ボルテックスでよく混ぜます。
4. 3 価 20 チューブのそれぞれに 1: 100 希釈の 20 μ L を追加します。
5. 3 価 100 管のそれぞれに 1: 100 希釈の 100 μ L を追加します。
6. スクリーニングのための 100 μ L を追加、'原液 ' 10 審査管のそれぞれにパッケージ化された DNA のサンプル。
7. すべてあるとスクリーニング チューブ処理 (2 x 3 + 10 = 16 管)、次のように: 約 10 のボルテックスでよく混ぜる s、バクテリオファージを吸着するエシェリヒア属大腸菌のホストを許可する 30 分間室温でインキュベートし。
8. 2.5 mL 電子レンジで溶融 TB1 各価に寒天 (55 ° C に冷却) をトップまたはボルテックスによって (慎重に)、すぐにミックス チューブをスクリーニングを追加して適切な力価に注ぐ、または上映サンダーバード 1 寒天。
   1. とおり TB1 上の寒天を準備します。ミックス 5.0 g 塩化ナトリウム、カゼイン ペプトン 10.0 g、7.0 g 寒天、800 mL dH₂O. 追加 1 mL 0.1% チアミン塩酸塩を追加し、水酸化ナトリウムや塩酸で 7.0 に pH を合わせなさい。最後に、1 リットルの最終巻に dH₂O を追加します。
   2. ミックスも、室温で 20-25 分ストア用オートクレーブまで 3 カ月。
   3. 使用前に電子レンジで準備の TB1 上の寒天を溶かす、よく混ぜ、55 ° C の水浴中に冷却すること。
      注: 溶融、冷却 TB1 トップ価またはスクリーニング チューブごとの内容に追加され、混合した後、適切な力価または上映サンダーバード 1 寒天に注がれています。
9. ふたを半開き結露を防ぐために、室温で 15-30 分のスタンド プレートができます。
10. プレートを反転し静止の 24 ° C の定温器で 10 スクリーニング プレートを配置しインキュベートする (すなわち、選択条件) 46-48 時間と静止の 37 ° C の定温器の 6 価版と 24 時間インキュベート/(はすなわち、夜間非選択的条件)。
    注: 品質保証および結果の標準化、市販コントロール バクテリオファージ ソリューション知られている変異頻度で野生型と変異cIIの混合物を含むパッケージ化された DNA のサンプルと一緒にメッキ、すべてに含まれています。アッセイは、⁵⁶を実行します。

5. 審査力価およびスクリーニング プレートcII変異頻度を決定するには

1. 次の 37 ° C で 24 h/一夜インキュベーション、斑の数は各 3 価 20 プレートと価 100 プレートに形成されました。プラクをより簡単に識別するには、蓋 (図 2参照) を削除と暗い背景に白のライト ボックスの横にあるプレートを保持すること。
2. 斑の数の平均値 (平均) 価 20 板と板と価 100 の各セットでカウント確認 (トリプリケート、それぞれ)。
3. プレート セット 1 組あたりの 50-200 のプラクの範囲に最も近い滝価プレートのセットから数の平均値を選択します。
4. 10 スクリーニング プレートで次のように上映のプラクの合計数を計算します。
   上映のプラクを合計 (選ばれた価プレートごと使用した μ L 希釈の数価プレート ÷ の選ばれたセットでプラークの平均数) = 倍希釈係数 × μ L スクリーニング プレート [100 μ L/プレート] ごとにパッケージ化された DNA サンプルの数スクリーニング プレート [10] の x の数。
   注: たとえば、価 20 プレートのセットにプレートごとプラクの平均数は 128、価 100 プレートのセットに対応する数は 478 数 128 される上映のプラクの総数の計算、次のように。
   (128 ÷ 20) × 100 [μ L/プレート] x 10 [プレート] x 100 [希釈係数] = 640,000
   これは数の平均値はそれぞれ価 20 プレートまたは価 100 プレートからのカウントに基づいている場合、5,000、1,000、プラクの平均数を乗算に相当。
5. 次の 24 の ° c 46-48 時間培養、(セクション 5.1 で説明する手順に従ってください) 10 スクリーニング プレートに形成されたプラークの合計数をカウントします。
   メモ: cIIの突然変異頻度は上映のプラクの総数によってスクリーニング プレートに形成されたプラークの合計数で割って算出されます。112 は、斑の総数カウント 10 スクリーニング プレートの場合、上記の例を使用して、この DNA サンプルのcIIの突然変異の頻度は、112 ÷ 640,000 = 17.5 x 10^-5でしょう。

6. 延髄 λ cII変異体の検証、PCR 増幅、DNA シーケンシング

1. 滅菌、ワイドボア ピペット チップで問題のプラークをコアし、500 μ L の滅菌 SM バッファーを含む滅菌遠心チューブに (上下にピペッティング) によってそれを追放します。
2. 少なくとも 2 時間、室温で孵化させなさいか寒天から溶出するバクテリオファージの粒子を許可するように、一晩に 4 ° C で接続します。
3. 滅菌 14 × 100 mm²丸底チューブ入りバクテリオファージ ソリューションの 1 μ L で 200 μ L G1250 メッキ文化をミックスし、室温 30 分間インキュベート
4. 55 ° C の溶融 TB1 上の寒天の 2.5 mL を使用してサンプルをプレートし、前述のセクション 4.8-4.10 46-48 h (選択的条件)、24 ° C でプレートを孵化させなさい。
5. セカンダリのプラークを形成している、ピペット チップを使用して単一の独立した検証 λ cIIを慎重に選ぶ-突然変異体のプラーク (低い寒天に触れることを避けるため)。
   注: 推定cII変異斑の Replating 2 つの目的を提供しています: (i) 工芸品をメッキが時々 間違われる小型プラーク;(ii) スクリーニング プレートから、アガロースのコアは突然変異体のファージと共に非突然変異体 phage(s) を含めることができます。低密度 replating からセカンダリのプラクは PCR および後続の DNA シーケンス解析のため汚染されていない変異テンプレートを提供します。
6. プラークを上下にピペッティングにより 25 μ L ダブル蒸留水を含む微量遠心チューブに転送します。
7. 5 分のための沸騰水でチューブを配置します。
8. 室温 3 分間最高速度 (18,000 × g) で遠心します。
9. 試薬の最終濃度が 1 x Taq PCR バッファー、10 pmol 各前方および逆のプライマーの各 dNTP の 12.5 nmol である PCR マスター ミックスの 40 μ L を含む新しい微量遠心チューブに上清の 10 μ L をすぐに転送します。、および Taq DNA ポリメラーゼの 2.5 U。
   注: 前方および逆引きのプライマーは次のとおり: 5'-CCACACCTATGGTGTATG-3' ( cII基準-50-68 開始コドンの位置) と 5'-CCTCTGCCGAAGTTGAGTAT-3' (位置は +365 cII開始コドンを基準に +345)、それぞれ。
10. 次のサイクリングのパラメーターを使用してテンプレートを増幅: 95 ° c、3 分変性は続く 30 の 30 サイクル 95 ° C、60 ° C で 1 分で s 72 ° c. で 10 分の最終的な拡張子を持つ、72 ° C で 1 分
11. 製造元の指示に従って 432 bp PCR 製品cII遺伝子を含むと並ぶ市販 PCR 精製キットを使用して領域を浄化します。
12. 適切なシーケンス処理プラットフォームを使用して DNA の塩基配列を行い、分析結果の DNA シーケンスをcII遺伝子の突然変異を検出する (下のメモを参照してください)。
    注: この最高の web ベース T コーヒー シーケンス配置 server などのソフトウェアを使用して参照cIIシーケンスと配置によって達成です。プログラムを使用する方法の詳細についてを参照してください: http://tcoffee.crg.cat/

結果

データ ディストリビューションによってパラメトリックまたはノンパラのテストを使用して、処置および制御グループ (すなわち、自発の突然変異体の周波数対誘導) のcIIの突然変異頻度の違いの重要性を判断します.誘導cII変異周波数別の治療グループ間での比較が行われます各種 (一対)、適用可能な統計的テスト。Χ²テストや分散分析 (ANOVA) などの他のテストは、頻度を比較する使用できますがアダムスと Skopek の超幾何テストを使用して全体的な誘導および自発の突然変異のスペクトル⁵⁷を比較一般(例えば遷移、意義、挿入、または削除) の突然変異誘導・制御の突然変異スペクトル間または異なる化学物質/エージェントまたは同じ用量の変化による様々 な突然変異スペクトル間のそれぞれの特定の種類の化学/エージェント。

ディスカッション

Λ 選択cIIアッセイは、³BB の齧歯動物の臓器・組織由来細胞のゲノム DNA から回復したcII遺伝子変異の検出に使用されます。これらの形質転換動物ゲノムには染色体統合 λLIZ シャトル ベクトルは、 cIIを運ぶ複数タンデム コピーが含まれます (294 bp) とラッチ(1,080 bp) 遺伝子変異レポーター遺伝子^1,2,25. λ 選択cIIアッセイは、適切なホストを感染させることができる λ ファージの頭に救助されたベクトルの包装が続いて、トランスジェニック動物の細胞・組織のゲノム DNA から λLIZ シャトル ベクトルの検索に基づいて大腸菌。その後、感染した細菌が得点とcII遺伝子の突然変異の分析を許可する選択的な条件の下で栽培されて (

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
寒天	MOバイオラボラトリーズ(株)	12112-05	細菌学グレード
BigDye Terminator v3.1 サイクル シーケンシング キット	サーモフィッシャー サイエンティフィ	4337455	なし
カゼイン ペプトン	アルファ Aesar	H26557	なし
ゼラチン	J. T. Baker	2124-01	粉末
グリセロール	フィッシャー サイエンティフィック	BP 229-1 / M-13750	なし
LB 寒天	ッシャー サイエンティフィック	BP 9724-500	なし
QIAquick PCR精製キット	Qiagen	8104	50 PCR精製反応
酢酸ナトリウム三水和物	フィッシャーサイエンティフィック	M-15756	なし
Taq5000DNAポリメラーゼ	キアゲン	201207	なし
チアミン塩酸塩	マクロン ファインケミカルズ	2722-57	なし
トランスパック包装エキス	ストラタジーン社、バイオリライアンス社が買収 |シグマ・アルドリッチ(株)	200223	50 包装反応
トリスベース	フィッシャーサイエンティフィック	BP 152-1 / EC 201-064-4	なし
トリプトン	バイオサイエンス	RC-110	なし