このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。

方法論記事

ピロカルピン刺激次を介してマウス唾液機能的アセスメント分別放射線

11.2K 回視聴

⸱

DOI:

10.3791/57522

⸱

2018年5月4日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Rochester, 2Department of Otolaryngology, University of Rochester Medical Center, 3Center for Oral Biology, University of Rochester Medical Center

この記事について

サマリー

マウスの気管切開と 3 つの大唾液腺の分離を含む唾液のコレクションを実行する詳細なアプローチを提案します。

要約

唾液は、シェーグレン症候群や大唾液腺に次の放射線障害の自己免疫の反作用でよく観察されます。これらの場合、病気の発症と効果的介入に関する質問のまま。唾液腺の機能評価ができる最適化されたテクニックは外分泌腺の生物学、機能不全、および治療の調査のため貴重です。ピロカルピンを実行するステップ バイ ステップ アプローチを提案するここでは、気管切開と 3 つの主要なマウス唾液腺の解剖など、唾液の分泌を刺激します。我々 はまた、これらのテクニックの中にアクセス適切なマウス頭頸部解剖の詳細します。このアプローチは、スケーラブルな仕事の流れの効率を上げる複数のマウスを同時に処理を可能にします。それぞれはさらにフィールド内でアプリケーションがこれらのメソッドの再現性の向上を目指しています。唾コレクションに加えて指標を定量化し、これらの組織の機能の正常化をについて説明します。代表的なデータは分別された放射線 (6.85 Gy の 4 用量) に続く 2 週間落ち込んで唾液腺機能と顎下腺から含まれます。

概要

唾液腺の障害には、調節不全の過剰産生 (sialorrhea) や唾1の生産不足 (口腔乾燥症と唾液) の分泌障害症候群が含まれます。どちらの場合も、治療開発2の最終目標に向けて唾液腺の生物学の私達の理解の向上に関心があります。

唾液腺は放射線感受性非常器官、頭頸部がんの放射線治療、永久的なドライマウス (口腔乾燥症)3,4につながる間しばしば破損しています。他の放射線感受性の組織とは異なりただし、唾液腺の離職率は比較的低いと分泌の損失のメカニズムはかり5,6。このユニークなけが設定で組織再生と放射線防護戦略唾液の機能評価が必要です。実験的マウス唾液コレクションは腺に対する放射線と治療薬の評価に特に貴重なツールです。

実行して、ピロカルピン、強力なムスカリン作動薬7を使用して刺激唾液分泌の定量化の方法を紹介します。ピロカルピンは、腺分泌8,9を誘導するために自律神経を刺激します。このテストを適切に完了するには、気管切開は、マウスがプロシージャ中気道を維持するために口腔内10でプールされた分泌物から誤嚥・窒息のリスクを低減する必要があります。

これは、3 つの大唾液腺の除去で最高潮に達する、ターミナル手順: (PG) 耳下腺、顎下腺 (SMG)、舌下腺 (SLG)。機能性研究腺重量は記録され、唾液測定11,12,13を正規化する頻繁に使用されます。このデータは、前記腺萎縮が予想した結果14,15放射線研究で特に重要です。

どのように刺激唾液の分泌に関して文献の変動が実行され、16の報告があります。たとえば、ピロカルピン投与量文学スパン少なくとも 3 桁17,18,19,20,21,22,23内。今回、最適化された高用量ピロカルピン プロトコルとして合わせることができる技術 (気管、唾液のコレクション、および腺郭清) のモジュール式プラットフォームを提供することと同様に、メソッドの実行、再現性向上の目的で必要があります。

プロトコル デモに加えて、我々 は SMG 領域に分別された放射線 (6.85 Gy の 4 用量) に続く 2 週間で唾液の流れの代表的な機能のデータを含めます。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

プロトコル

すべては、生体内での下記手続は、ロチェスターの大学、ロチェスター動物資源の大学委員会によって承認されました。NY。

1. 準備

  1. 分析用天秤を使用すると、ピロカルピンの 20 mg の重量を量る。微量遠心チューブの滅菌生理食塩水 2 mL に溶かします。
    注: ピロカルピンが光に敏感で、時間をかけて活動を失うのでこのソリューション必要があります準備注入の日と投与までの光から保護されました。
  2. 分析用天秤を使用すると、重量を量るし、すべてのコレクション チューブ、ガラス管を識別します。コレクション チューブ、ガラス管の数には、マウスの数を一致する必要があります。

2. 気管切開

  1. 分析用天秤を用いた C57/BL6 マウスの重量を量る。
  2. 29 x ½"針で 0.5 mL シリンジを使用して、100 mg/kg 10 mg/kg とケタミン ・ キシラジンの腹腔内注入滅菌生理食塩液をマウスを麻酔します。マウスが応答する刺激 (すなわちペダル逃避反射の不在) に一般的に投与 5 〜 10 分以内に発生するときは、次の手順に進みます。
  3. 綿の先端アプリケータに潤滑剤を塗布後軽く目に適用され、仰臥位でステージ上にマウスを置きます。麻酔下の動物は、暖かい表面に保たれなければなりません。
    注: すべての手順は、室温で実行されます。
  4. 鼻、手足、サージカル テープを使用して、ステージに尾を保護します。
  5. きれいにしアルコール ワイプで首を濡れています。
    注: これは入力後切開から毛皮を防ぐため役立ちます。
  6. 鉗子で腹側正中線の首の皮膚を引き上げ、解剖はさみを使用して小さい、表面的なカットをします。開口部にはさみをご案内し、ゆっくりと皮下組織面を分離するブレードを開きます。
  7. 口の下に 1 cm 上げた肌に保つ、慎重にカットします。
  8. 最初のカットの劣ると優れた側面を 2 つの横切開を確認します。鉗子を使用すると、頭と首の構造へのアクセスを有効にする皮膚反映まで優しく。
  9. 顎下腺 8 倍の倍率で解剖顕微鏡を用いた可視化 (正中線:図 1)。
  10. 微細鉗子を使用すると、気管を覆う 4 つの舌骨下 (ストラップ) 筋肉を公開する腺をそっと持ち上げます。涙や周囲の血管や導管を中断することを避けるため。
  11. 1 つ以上のマウスから唾液を収集する続行する前に各マウスを使って手順 2.1 2.10 を繰り返します。
    メモ: この手順が安全で実行できます 5 マウスまで同時に。
  12. 小さな解剖はさみでできるだけ正中線に近い滞在中ストラップの筋肉の内側の部分を削除します。気管を視覚化し、プロシージャの間に方法のストラップの筋肉を保つために必要な量だけカットのみ。ピロカルピンが分泌を誘導する効果的ではない重要な出血にセカンダリ ボリュームの枯渇がある場合ために任意の近くの血管を傷つけないでください。
  13. 気管からストラップの筋肉を反映してください。
  14. 喉頭・気管・甲状腺を視覚化します。気管がない組織を覆うことを確認します。
  15. 小さな解剖はさみを使って甲状腺に劣る/後部気管内横切開を加えます。気道が特許と流体の明確なことを確認します。

3. 唾液コレクション

  1. 口と角解離ステージ下方近くテープを削除 (45 ° 頭側) 唾液の流れを支援します。
  2. 29 x ½"針で 0.5 mL シリンジを使用して、100 mg/kg の総線量の 10 μ L/g 本体重量ピロカルピンの腹腔内投与を実行します。
  3. タイマーを起動します。複数のマウスを投与している場合、は、迅速に移動することによって、アシスタント残りのマウスを同時に注入することでリードタイムを短縮します。
  4. 通常鉗子を使用すると、キャピラリー チューブのアクセスのための口を開きます。
  5. 口の中で唾液のビードを観察すると、遠位端で、流体にキャピラリー チューブの近位端の場所が (両方のチューブが事前の重量を量った) 解離性の段階の下に収集の管に配置。
    注: C57/BL6 雌ネズミの 6-10 週齢総唾液分泌に発生しますピロカルピン注射の 2 分以内。
  6. 唾液は、口の中でビル管を通って流れていない場合、前の手順を再試行します。入口を妨げることができる粘膜表面に対して直接チューブが配置されていないことを確認します。
  7. ピロカルピン刺激 12 分の合計のため唾液を収集します。ストーマは明確に残ることを確認します。
    注: この時間の間に、通常一回換気量の増加や分泌物 (唾液、尿、便) が。
  8. マウスは唾液の機能に踏み込んだ場合 (e.g。、ケガや介入のため)、P200 ピペットを使用してコレクションの管口から残りの流体に転送。複数のマウスから収集する場合は、ヒントを変更することを確認します。
  9. ピロカルピン注射後採取唾液プラス チューブ 12 分の重量を記録します。

4. 腺解剖

  1. CO2安楽死によってマウスを安楽死させる (動物の安楽死の AVMA のガイドラインに従って: 2013 年版) 開胸、頭と首の構造を維持するために世話が続きます。このため、安楽死の方法として頚部転位を避けます。
  2. 仰臥位でステージ上にマウスを置きます。気管 (図 1) を元のサイトで腺の位置を変更します。
  3. 8 倍の倍率で解剖顕微鏡を用いた視覚化大腺: PG、SMG、SLG。解剖中腺を区別するために、PG がびまん性、SMG と SLG に横で横になっていることを特定します。
    注: PG を解剖する場合これされるべき最初だから少なくとも定義され引き裂かれるらしい。
  4. 基になる構造から引き離し、鉗子で PG の尾をつかみ、優しく解剖はさみで PG の頭を切断する前に緊張を適用します。
  5. 鉗子を用いた SMGs を覆う被膜を破る。左と右の SMG を優しきます。
  6. 無料の鉗子を用いた付着 nonglandular 組織から SMG の背側面。
  7. 鉗子でピンと張ったウォートンのダクトを描画し、解剖はさみとダクトを切断、首から SMG を削除します。
  8. SMG は鉗子を使用してから、SLG を優しきます。
    注: SLG は、SMG の上外側面では。
  9. 分析のバランスを使用して、SMG の重みを記録します。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

結果

唾コレクションに刺激高用量ピロカルピンを実行するときは、誤嚥を防ぐために気道を維持するために重要なまたは口腔内の分泌物から窒息です。切開の概略図 (図 1) を提供しています。気管切開後ストーマは組織や体液の明確なままする必要があります。

唾コレクション中に毛管作用を向上させるため、下方 45 ° の角度で自分の頭を持つマウスを配置必要があります。これらの手順を実行できます > 1 マウス、5 マウスを一度に (図 2) を超えることは推奨はしないが。コレクションが完了すると、チューブが蒸発損失を避けるために迅速に検討するをお勧めします。

次の唾コレクション、マウス、安楽死させた。頭と首の構造を損傷する可能性...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

ディスカッション

腺傷害や治療研究に適用可能な唾液腺機能を評価するためにマルチ ステップ法を提案します。私たちの手順には、気管、唾液のコレクション、および唾液腺の生物学の統合研究をサポートすることができます実験アプリケーションを持つ腺解剖が含まれます。たとえば、マウスの気管は、口腔内を妨害する手順の中で一般的な気道管理のため使用されています。

ピロカルピンの適切な郭清と気管切開が必要で 100 mg/kg の唾液の分泌を刺激します。または、削減ピロカルピン投与気管切開の必要性を避けることができるし、唾液分泌16の縦断的評価のため。

唾液の分泌を記録に加えこのプロトコルは、追加の分析のため唾液を収集するために正確で一貫した手段を提供します。このような研究には、レオロジー、プロテオミクス、酵素活性、唾浸透圧25,26,27

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

この出版物で報告された研究は、国立歯科研究所と顔面研究 (NIDCR) ・賞数 R56 DE025098、UG3 DE027695、F30 CA206296 の下で健康の国民の協会の国立癌研究所 (NCI) によって支えられました。内容は著者の責任と国立衛生研究所の公式見解を必ずしも表さない。この作品も、NSF DMR 1206219 と口腔ケア賞 (2016), 技術革新によって支えられました。

唾コレクション援助の博士えり丸山とアンドリュー ホローモンに感謝したいと思います。腺解剖して彼の支援の Pei Lun 翁に感謝したいと思います。我々 は図の準備の彼の援助のマシュー ・ インガルスを感謝したいです。この原稿の批判的読解の博士 Elaine Smolock とエミリー呉に感謝したいと思います。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ピロカルピン塩酸塩Sigma AldrichP6503ピロカルピン
学生 Vannas 春のはさみファイン サイエンス ツール91500-9気管切開用春はさみ
滅菌生理食塩水メドラインRDI30296H生理食塩水
デュモン #7 鉗子ファイン サイエンス ツール11274-20湾曲した鉗子
デュモン #5 鉗子ファインサイエンスツール11251-10ストレート鉗子
標準パターン鉗子ファインサイエンスツール11000-12鈍い鉗子
ファインハサミ-タングステンカーバイドファインサイエンスツール14568-09剖はさみ
マイクロヘマトクリットヘパリン化毛細管ッシャーサイエンティフィック22362566毛細管潤滑剤
眼軟膏リフレッシュN/Aリフレッシュ ラクリルーブ
ヤギ ポリクローナル抗 Nkcc1Santa Cruz BiotechSC-21545Nkcc1 抗体
DAPI(4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール、二塩酸塩)サーモフィッシャーサイエンティフィックD1306DAPI
GraphPad プリズムグラフパッドver6.0統計ソフトウェア
コットンチップアプリケーターMedlineMDS202000眼軟膏用アプリケーター
0.5cc インスリン注射器、29G x 1/2インチBD7629腹腔内注射用シリンジ
解フィ

参考文献

  1. Bradley, P., O'Hara, J. Diseases of the salivary glands. Surgery (Oxford). 33 (12), 614-619 (2015).
  2. Fox, P. C. Salivary enhancement therapies. Caries Research. 38 (3), 241-246 (2004).
  3. Konings, A. W. T., Coppes, R. P., Vissink, A. On the mechanism of salivary gland radiosensitivity. International Journal of Radiation Oncology Biology Physics. 62 (4), 1187-1194 (2005).
  4. Burlage, F. R., Coppes, R. P., Meertens, H., Stokman, M. A., Vissink, A. Parotid and submandibular/sublingual salivary flow during high dose radiotherapy. Radiotherapy and Oncology. 61 (3), 271-274 (2001).
  5. Aure, M. H., Konieczny, S. F., Ovitt, C. E. Salivary gland homeostasis is maintained through acinar cell self-duplication. Developmental Cell. 33 (2), 231-237 (2015).
  6. Aure, M. H., Arany, S., Ovitt, C. E. Salivary Glands: Stem Cells, Self-duplication, or Both? Journal of Dental Research. 94 (11), 1502-1507 (2015).
  7. Ono, K., et al. Distinct effects of cevimeline and pilocarpine on salivary mechanisms, cardiovascular response and thirst sensation in rats. Archives of Oral Biology. 57 (4), 421-428 (2012).
  8. Proctor, G. B., Carpenter, G. H. Regulation of salivary gland function by autonomic nerves. Auton Neuroscience. 133 (1), 3-18 (2007).
  9. Nezu, A., Morita, T., Tojyo, Y., Nagai, T., Tanimura, A. Partial agonistic effects of pilocarpine on Ca(2+) responses and salivary secretion in the submandibular glands of live animals. Experimental Physiology. 100 (6), 640-651 (2015).
  10. Urita, Y., et al. Rebamipide and mosapride enhance pilocarpine-induced salivation. North American Journal of Medical Sciences. 1 (3), 121-124 (2009).
  11. Arany, S., Benoit, D. S., Dewhurst, S., Ovitt, C. E. Nanoparticle-mediated gene silencing confers radioprotection to salivary glands in vivo. Molecular Therapy. 21 (6), 1182-1194 (2013).
  12. Kondo, Y., et al. Functional differences in the acinar cells of the murine major salivary glands. Journal of Dental Research. 94 (5), 715-721 (2015).
  13. Evans, R. L., et al. Severe impairment of salivation in Na+/K+/2Cl- cotransporter (NKCC1)-deficient mice. Journal of Biological Chemistry. 275 (35), 26720-26726 (2000).
  14. Delanian, S., Lefaix, J. L. The radiation-induced fibroatrophic process: therapeutic perspective via the antioxidant pathway. Radiotherapy and Oncology. 73 (2), 119-131 (2004).
  15. Guchelaar, H. J., Vermes, A., Meerwaldt, J. H. Radiation-induced xerostomia: pathophysiology, clinical course and supportive treatment. Support Care Cancer. 5 (4), 281-288 (1997).
  16. Lin, A. L., et al. Measuring short-term γ-irradiation effects on mouse salivary gland function using a new saliva collection device. Archives of Oral Biology. 46 (11), 1085-1089 (2001).
  17. Montenegro, M. F., et al. Profound differences between humans and rodents in the ability to concentrate salivary nitrate: Implications for translational research. Redox biology. 10, 206-210 (2016).
  18. Choi, J. S., Park, I. S., Kim, S. K., Lim, J. Y., Kim, Y. M. Morphometric and Functional Changes of Salivary Gland Dysfunction After Radioactive Iodine Ablation in a Murine Model. Thyroid. 23 (11), 1445-1451 (2013).
  19. Imamura, T. K., et al. Inhibition of pilocarpine-induced saliva secretion by adrenergic agonists in ICR mice. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 39 (12), 1038-1043 (2012).
  20. Ma, T., et al. Defective Secretion of Saliva in Transgenic Mice Lacking Aquaporin-5 Water Channels. Journal of Biological Chemistry. 274 (29), 20071-20074 (1999).
  21. Parkes, M. W., Parks, J. C. Supersensitivity of salivation in response to pilocarpine after withdrawal of chronically administered hyoscine in the mouse. British Journal of Pharmacology. 46 (2), 315-323 (1972).
  22. Nishiyama, T., et al. Up-Regulated PAR-2-Mediated Salivary Secretion in Mice Deficient in Muscarinic Acetylcholine Receptor Subtypes. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 320 (2), 516(2007).
  23. Yang, B., Song, Y., Zhao, D., Verkman, A. S. Phenotype analysis of aquaporin-8 null mice. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 288 (5), C1161-C1170 (2005).
  24. Kamiya, M., et al. X-Ray-Induced Damage to the Submandibular Salivary Glands in Mice: An Analysis of Strain-Specific Responses. BioResearch Open Access. 4 (1), 307-318 (2015).
  25. Patel, R. M., Varma, S., Suragimath, G., Zope, S. Estimation and Comparison of Salivary Calcium, Phosphorous, Alkaline Phosphatase and pH Levels in Periodontal Health and Disease: A Cross-sectional Biochemical Study. Journal of Clinical and Diagnostic Research. 10 (7), ZC58-ZC61 (2016).
  26. Droebner, K., Sandner, P. Modification of the salivary secretion assay in F508del mice--the murine equivalent of the human sweat test. Journal of Cystic Fibrosis. 12 (6), 630-637 (2013).
  27. Lamy, E., et al. Changes in mouse whole saliva soluble proteome induced by tannin-enriched diet. Proteome Science. 8 (1), 65(2010).
  28. Mahomed, F. Recent advances in mucin immunohistochemistry in salivary gland tumors and head and neck squamous cell carcinoma. Oral Oncology. 47 (9), 797-803 (2011).
  29. Kohlgraf, K. G., et al. Quantitation of SPLUNC1 in saliva with an xMAP particle-based antibody capture and detection immunoassay. Archives of Oral Biology. 57 (2), 197-204 (2012).
  30. Maimets, M., Bron, R., de Haan, G., van Os, R., Coppes, R. P. Similar ex vivo expansion and post-irradiation regenerative potential of juvenile and aged salivary gland stem cells. Radiotherapy and Oncology. , (2015).
  31. Lombaert, I. M., et al. Rescue of salivary gland function after stem cell transplantation in irradiated glands. PLoS One. 3 (4), e2063(2008).

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

再版と許可

タグ

マウス唾液腺唾液分泌気管切開術腺の摘出唾液機能顎下腺唾液採取頭頸部解剖学
ピロカルピン刺激次を介してマウス唾液機能的アセスメント分別放射線
お問い合わせ
図書館に推薦する

プライバシー

利用規約

ポリシー

著作権 © 2026 MyJoVE Corporation. 無断転載を禁じます。