Method Article

ウェルシュ病原性を研究する麻酔特定病原体フリー鶏における腸管結紮ループ モデル

DOI:

10.3791/57523

⸱

October 11th, 2018

 ,  ,  , 
1Department of Clinical Sciences, Faculty of Veterinary Medicine, Université de Montréal, 2University of Bristol

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ここで外科的鶏腸内 '腸管結紮ループ' を作成するためのプロトコルを提案する.この手順は、複数ウェルシュ菌病原性上皮内の単一のホストでの比較のためことができます。このメソッドは、同様の生体内で実験に必要な通常の鶏の数を著しく減少します。

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

壊死性腸炎は、様々 な生体内感染モデルを用いた鶏で調べた。これらのほとんどは、強制経口投与とウェルシュを使用してフィードを介して管理素因、コクシジウム症、ダイエットなどの組み合わせを使用します。これらのモデルで病原性の研究複数C. ウエルシュ菌の比較多数の重要な結果を取得するホストが必要です。研究の過程で死亡は、それゆえ研究における動物福祉に関する倫理的な問題を上げる実験的モデルによって高ことができます。発症機序は、まだ統計的に重要かつ有効な結果を提供することを勉強するより少ない動物を必要とする新しい感染症モデルの開発研究における動物の使用量の削減に重要です。腸管結紮ループ モデルは、マウス、ウサギ、牛など様々 な種のクロストリジウム感染症の研究に使用されています。手術結紮ループ セグメントを作成するのには、以下のC. ウエルシュ菌は細菌と粘膜の間の密接な接触を確立するループに直接注入されます。小腸と内容のサンプルは、プロシージャの終了数時間後で撮影されます。複数菌株は、実験に必要な科目数を減らし、それぞれの動物に接種することができます。また、動物の痛みを軽減する麻酔下で手順を実行します。鶏、このモデルが少ない動物が必要なため、素因が、病気を誘発する必要はありません、鎮痛薬によって痛みを制御C. ウエルシュひずみ病原性を比較する経口投与よりも適切だろう.腸管結紮ループ モデルは鶏で不完全に記述されて、標準化はその最適な使用のために不可欠です。この原稿鶏で多数の腸管結紮ループを作成するすべての必要な手順を提供し、については有効な結果を得るための重要なポイントをもたらします。

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

人間や動物に影響を与える伝染病の研究の動物モデルの使用は規制を防ぐか、または治す疾患1戦略を詳しく説明として同様に特定の条件の病因病原因子を評価する上で中心的なツールです。様々 な疾患を勉強する動物モデルを使用して多数の利点、にもかかわらずこの実践に関する倫理的な問題が生じる。研究者は、重要かつ有効な結果を得ながら動物の使用を最小限に抑える必要があります。3 原則の Rs (置換、削減、リファイン) の概念は、福祉の問題はこのような試験に当たったように精緻化された.鶏壊死性腸炎の研究で鶏モデル生体内では、病因、予防、およびこの条件2,3,4、5の治療を調査するため使用されます。鶏7で壊死性腸炎を引き起こす病原性株C. ウエルシュNetB 毒素6などの特定の病原因子を運ぶを管理します。交換の原則は、したがって、これらの病原因子は他の動物種で重大ようにではないかもしれないこのようなケースで達成することは困難。鶏の壊死性腸炎のほとんどのモデルはコクシジウム症などの危険因子の組み合わせを使用し、 C. ウエルシュ2.の大規模な番号を含むスープ文化の強制経口投与に続いて壊死性腸炎を誘導するために食事療法を変更これらのモデルは多数、鶏の病気を誘発して死亡率はそのような試験の8、従って動物研究の削減・洗練の原則についての懸念を高める重要なすることができます。

腸管結紮ループ モデルに関して原則の削減、および洗練された腸内病原体による疾患の研究の望ましい代わりであります。これらのモデルで 'ループ' と呼ばれる腸管が病原体は、単独で9を注入することができます独立して気密区画を形成するため腸管に沿ってまたはワクチン候補など、他の分子との合字を配置することによって作成されます。10,11. 興味の病原体が腸の細胞と連絡を密に配置され、感染時間の数時間後腸サンプルを詳しく分析するためリカバリできます。これは同じ動物の複数の治療とコントロール グループを使用できます。繰り返し測定モデルをグループ間の差別の力を増加し、経口試験と比較して必要な鶏の数が減ると統計分析を実行できます。また、継続的な全身麻酔と鎮痛、それ故に動物の痛みを最小限に抑える手術とその後の感染の時間を実行します。閉ループをホスト番号を減らすと動物研究のより慈悲深いシステムを作成するための理想的なテンプレートです。

腸管結紮ループ モデルは子牛、ウサギ、マウス2,9などの様々 な種でも説明されているが、あまり鶏7で記述。この手術モデルの最適な利用、適切な技術と実行は、腸内の整合性への損傷を避けるために結紮腸管ループの作成に不可欠です。この原稿の目標は、鶏モデルで複数の腸ループの作成のステップ バイ ステップ方法について説明することです。この手法は、正確な手順は、プロジェクトの成功に不可欠な外科医の経験と技術によって制限されます。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

生きている動物の使用をすべてのプロシージャはユニヴェルシテ ドゥ モントリオール獣医医学部倫理委員会によって承認された (CÉUA, 'Comité d' éthique デ l'utilisation デ Animaux')。

1. 手術前に、の考慮事項

  1. 10 週齢特定病原体無料 (SPF) レグホン鶏、手術を選択します。
    注: 自分の体重は 1.0 と 1.2 キロの間ある必要があります。
  2. フィード腸管を空にする手続き前 12 h を撤回します。
  3. 手術前に麻酔科医によって検証プロトコルに続く全身麻酔下鶏を配置します。それぞれの鶏のミダゾラムの投与 (IM) と手術前に 15 分を premedicate 1 mg/kg、ブトルファノール 4 mg/kg。すべての 4 h、ブトルファノールの注入を繰り返します 4 mg/kg IM または麻酔中の呼吸パターンの変化と頻度が増えたとき。全身麻酔のためすべてのプロシージャの間に 1.5 と気管内チューブと 2.5% の濃度でイソフルランを管理します。
    注: 彼らが大幅麻酔深度を向上させる、すべてのプロシージャの間に必要な麻酔薬の量を減らすだけでなく痛みのレベルを制御する研究者を有効にすると、鎮静と鎮痛のため麻酔前投薬の使用はお勧めします。
  4. 体温、心拍数、心電図 (ECG) 呼吸速度とリズム、酸素飽和度、有効期限の切れた二酸化炭素 (CO2) と神経反射を記録することによって麻酔を監視します。
    注: すべての手順にこれらのパラメーターを監視する人を割り当てる必要があります。
  5. 不妊手術の手順全体において原則に従ってください。外科医とアシスタントの外科医ドレス滅菌ガウン、手袋、マスク、保護メガネ機関術前プロトコルに従ってを確認します。外科医が爪と各指表面を中心に肘までクロルヘキシジン含浸グルコン酸滅菌ブラシと手をスクラブを確認します。
  6. 殺菌剤で手術器具を滅菌します。

2. 手術部位の準備

  1. まず、穏やかなトラクションと腹部から羽を手動で削除します。
  2. 洗剤含浸滅菌ブラシをごグルコン酸クロルヘキシジンで手術部位をスクラブします。5 分の合計接触時間の中心に戻ってくることがなく外にセンターから肌をやさしくスクラブします。
  3. クロルヘキシジン ・ グルコン酸ソリューションとイソプロピル アルコール滅菌ガーゼを使用して手術部位で 3 代替通路を実行します。
    注: 通路は、非消毒エリアから手術部位の汚染を避けるためにボーダーに手術部位の中央から開始する必要があります。
  4. 鶏に滅菌手術用ドレープを配置します。

3. 腹腔内から小腸の抽出

  1. 手術部位の皮膚のみを公開するハサミで手術用ドレープを切開します。
  2. #3 のメス刃で「L」形低正中線切開を実行することによって皮膚を切開します。
    1. 1 cm に胸骨尾側の最初の切開を開始および頭蓋腔に 1 cm で終了します。
    2. 最初の切開に垂直な 2 つ目の切開を行います。最初の切開の尾側端から開始し、骨盤ラインに従うことによって腹部の左側に 5 cm を継続します。
      注: この開口部は腸の簡単抽出は、フラップを作成します。
  3. 手術ハサミ、腹膜と腹腔内を開く同じ 'L' の形状パターンと腹部の筋肉をカットします。
    注: これは気嚢が公開されます。腸はこれらの構造の下に位置しています。気嚢は、乾燥と、プロシージャ全体が大きく破裂を避けるために滅菌生理食塩水 0.85% で飽和したガーゼで加湿する必要があります。
  4. あかんべーを卵巣摘出する挿入は左の腹部壁に従うことによって腹腔内でフックし、腹部の空気嚢の周りのように動作します。
  5. 優しく腸を外在し、手術野のこれらを広げなさい。
    注意: 腸プロシージャ全体で滅菌生理食塩水 0.9% を頻繁に噴霧して加湿します。また、ガーゼ滅菌生理食塩水で加湿は、乾燥を避けるために腸に配置できます。
  6. 乾燥滅菌ガーゼを使用して腸をつかんで、空腸を公開する徒手による牽引で小腸をそっと引き出します。
    注: 腸間膜血管は壊れやすい、過度の緊張が破裂して腸虚血病変につながる可能性があります、プロシージャの結果を非常に妥協します。

4. 腸ループの製作

  1. 第 1 のループを作成します。
    1. 主要な腸間膜血管の結紮を避けることによって、近位空腸に polyglactin マルチ フィラメント合成吸収性材料と単純な合字を配置します。
    2. 近位の合字から 2 cm 遠位合字を配置します。
      注: マルチ フィラメント縫合糸で作られたシンプルな合字は、ハーメチックのセグメントを作成する腸管に沿って配置されます。スキーマ (図 1) では、すべての合字の場所について説明します。ループは 2 cm で区切られた近位と遠位の合字から成っています。
  2. Interloop 第 1 を作成します。
    1. シンプルな合字ループ no.1 の遠位の合字へ aborally 0.5 cm を配置します。
      注: 連続したループ間ループ間の物理的な分離セグメントすなわち1 cm の interloops があります。1 つのループから別への交差汚染のリスクの可能性を減らす可能性が高い、シンプルな合字は interloop (2 隣接するループの遠位と近位の合字から 0.5 cm) の中央に配置されます。これは隣接するループの合字に到達するループから、流出した汚染物質のリスクを低減します。これらのセグメントは必須ではありませんが、交差汚染のリスクを減らします。
  3. 次のループと interloops を作成します。
    1. 4.1 と 4.2 必要なループの数を取得する手順を繰り返します。
      注: この実験で 9 ループと 8 interloops 作成されました。全体の長さは 26 cm に達した。ループの数は、研究によって調整できます。

5.ウェルシュ菌にはループの注入

  1. 滅菌注射器と針 26 G ループ no.1 で病原体を注入します。45 ° の角度で腸の対側に針をそっと挿入します。
    注: この実験で中間ログ成長段階で 1 × 106 c. ウエルシュの CFU (コロニー形成単位) を含む脳心臓注入 (BHI) の 0.2 mL 各ループに注入しました。5 異なるループで 5 異なる菌株を投与、残りのループ 4 は細菌 (滅菌 BHI)、交互に病原体および滅菌 BHI ループが含まれていないネガティブ コントロールを注入しました。
  2. 5.1 すべてのループを挿入する手順を繰り返します。
  3. そっと背地区空気嚢の下に、腹腔内の腸管を置き換えます。

6. 腹部キャビティの閉鎖

  1. 腹膜と腹部の筋肉の縫合。
    1. Polyglactin マルチ フィラメント合成吸収性材料を用いた単純な連続縫合パターンを持つ腹膜と骨盤 (ステップ 3.3 製) に沿って腹部の筋肉を縫合します。
    2. 腹膜と腹筋胸骨腔を縫合 (手順 3.3。 polyglactin マルチ フィラメント合成吸収性材料を用いた単純な連続縫合パターンを持つ。
  2. 皮膚の縫合。
    1. Polyglactin マルチ フィラメントの合成材料と単純な連続縫合パターンを使用して、手順 3.2 骨盤に沿って皮膚の切開を閉じる。
    2. 同じマルチ フィラメント合材料と単純な連続縫合パターンを使用して、3.2 は、総排出腔に胸骨からの皮膚の切開を閉じる。

7. 結論

  1. 手術後感染時に動物の痛みを抑える鎮痛薬の適切な使用と全身麻酔下で鶏を維持します。適切な麻酔レベルを確保する麻酔監視を継続します。
  2. 目的感染時間後全身麻酔下頚部転位によって、鶏を人道的安楽死させます。
    注: これらの手順C. ウエルシュ病原性系統の顕微鏡的病変を誘導するために必要な時間は 7 h だった。
  3. メスの刃は、#3、1 cm 長いループ セクションに 0.5 cm をカットし、10% ホルマリン固定一晩、さらに病理組織学的分析のためにそれを置きます。
  4. 同じメスの刃、残りのループのセクションをカットし、滅菌遠心チューブにおける各ループさらに細菌の遺伝学的解析のためC. ウエルシュ菌の分離のためにそれを置きます。
  5. すべてのループの間メスの刃を変更することによってすべてのループの 7.2 と 7.3 の手順を繰り返します。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

9 腸ループと 8 interloops の回路図は図 1に示します。このモデルで 9 ループと 8 interloops の合計は、単純な合字で作成されます。ループは、2 cm 近位の合字から測定間隔近位と遠位の合字で構成されています。2 つの隣接するループは、1 cm の interloop で区切られます。合字からの漏れによるループ間の交差汚染のリスクの可能性を減らすには、interloop の合字を遠位の字と 2 隣接するループの近位の合字から途中入れています。ループの数は、研究の要件に応じて調整できます。

figure-results-1
図 1: 結紮腸管ループの略図。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

腸管ループのモデルは、宿主-病原体相互作用やウェルシュクロストリジウム ・ ディフィシルなどさまざまな腸内病原体によって引き起こされる病気の病因を研究する多くの種に記載されています。サルモネラ7,9,13,14,15。それはまた粘膜免疫応答16、腸疾患10 を防ぐワクチン候補者を評価する腸内病原体11によって排泄される細菌の毒素を中和する抗体の有効性を分析するために使用されています.ただし、単一の個々 の動物で多数結紮ループを使用してこのモデルは鶏で不完全に記述されて、この手法の標準化が偽の結果や誤解につながる可能性があ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者が明らかに何もありません。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この作品は、ユニヴェルシテ ドゥ モントリオールの獣医学部から家禽研究 (M. Boulianne) の椅子によって支えられました。博士 Boulianne と親モデルを開発しました。博士 Boulianne と親が手術を行った先生は、麻酔プロトコルの開発を支援しました。博士の親はビデオを編集し、原稿を書いていた。Drs やけど、クラシックと Boulianne は原稿を編集しました。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
EZ-Scrub 747Becton Dickinson and Company4% クロルヘキシジングルコン酸洗剤含浸滅菌ブラシ。カタログ番号はありません。ウェブアドレス:https://www.bd.com/en-us/offerings/capabilities/infection-prevention/surgical-hand-scrubs/ez-scrub-preoperative-surgical-scrub-brushes 
イソプロピルアルコール70%USP 4 L商業用イソプロピルアルコールP016IP70ウェブアドレス:http://www.comalc.com/products/
クロレキシジンSigma-Aldrich282227-1Gクロルヘキシジングルコン酸溶液は、4%に希釈する必要があります。ウェブアドレス:http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/282227?lang=fr®ion=CA&gclid=EAIaIQ
obChMI8vHr4_OY1wIV3rrACh2Z
WQKuEAAYAiAAEgLKx_D_BwE
外科用ドレープスモール(27インチx 24インチ)、3 x 6インチ開窓獣医専門製品32724ウェブアドレス:http://www.vetspecialtyproducts.com/index.cfm?fuseaction=ecommercecatalog.
detail&productgroup_id=15
メスの刃 #3Swann-Morton301ウェブアドレス: https://www.swann-morton.com/product/16.php
滅菌生理食塩水 NaCl 0.9%Sigma-AldrichS8776-100MLウェブアドレス:
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s8776?lang=fr®ion=CA Vicryl 3-0EthiconD9003ポリグラクチンマルチフィラメント吸収性縫合糸材料。ウェブアドレス:http://www.ethicon.com/healthcare-professionals/products/wound-closure/absorbable-sutures/coated-vicryl-polyglactin-910-suture
リンジ1ml、26G針ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー329652ウェブアドレス:https://www.bd.com/en-us/offerings/capabilities/diabetes-care/insulin-syringes/bd-1-ml-conventional-insulin-syringes
Brain Heart InfusionSigma-Aldrich1104930500ウェブアドレス:http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/mm/110493?lang=fr®ion=CA&cm_sp=Insite-_-prodRecCold_xorders-_-prodRecCold2-1
エッペンドルフチューブSigma-AldrichT9661-500EA微量遠心チューブ。ウェブアドレス:http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t9661?lang=fr®ion=CA&gclid=EAIaIQ
obChMI-YizzfiY1wIVRkCGCh
30SQjuEAAYAiAAEgLK5fD_BwE
ホルマリン溶液、緩衝中性、10%Sigma-AldrichHT501128-4L組織:ホルマリン1:10で十分な固定が可能です。ウェブアドレス: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/ht501128?lang=fr®ion=CA
Clostridium perfringens strainsUniversité de Montréal, Chaire en recherche avicoleN/A各研究室に特化しており、特派員著者のご要望に応じて利用可能
シ

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vitale, A., Chiarotti, F., Alleva, E. The use of animal models in disease research. Rare diseases and orphan drugs. 2 (1), 1-4 (2015).
  2. Uzal, F. A., et al. Animal models to study the pathogenesis of human and animal Clostridium perfringens infections. Veterinary Microbiology. , (2015).
  3. Bernier, G., Phaneuf, J. B., Filion, R. Necrotic enteritis in broiler chickens. III. Study of the factors favoring the multiplication of Clostridium perfringens and the experimental transmission of the disease. Canadian Journal of Comparative Medicine. 41 (1), 112-116 (1977).
  4. Al-Sheikhly, F., Truscott, R. B. The pathology of necrotic enteritis of chickens following infusion of broth cultures of Clostridium perfringens into the duodenum. Avian Diseases. 21 (2), 230-240 (1977).
  5. Wicker, D. L., Iscrigg, W. N., Trammell, J. H. The control and prevention of necrotic enteritis in broilers with zinc bacitracin. Poultry Science. 56 (4), 1229-1231 (1977).
  6. Keyburn, A. L., et al. NetB, a new toxin that is associated with avian necrotic enteritis caused by Clostridium perfringens. PLoS Pathog. 4 (2), e26(2008).
  7. Timbermont, L., et al. Origin of Clostridium perfringens isolates determines the ability to induce necrotic enteritis in broilers. Comp Immunol Microbiol Infect Dis. 32 (6), 503-512 (2009).
  8. Paradis, M. A., et al. Efficacy of avilamycin for the prevention of necrotic enteritis caused by a pathogenic strain of Clostridium perfringens in broiler chickens. Avian Pathol. 45 (3), 365-369 (2016).
  9. Valgaeren, B., et al. Lesion development in a new intestinal loop model indicates the involvement of a shared Clostridium perfringens virulence factor in haemorrhagic enteritis in calves. Journal of Comparative Pathology. 149 (1), 103-112 (2013).
  10. Goossens, E., et al. The C-terminal domain of Clostridium perfringens alpha toxin as a vaccine candidate against bovine necrohemorrhagic enteritis. Vet Res. 47 (1), 52(2016).
  11. Goossens, E., et al. Toxin-neutralizing antibodies protect against Clostridium perfringens-induced necrosis in an intestinal loop model for bovine necrohemorrhagic enteritis. BMC Vet Res. 12 (1), 101(2016).
  12. Parent, E., Archambault, M., Charlebois, A., Bernier-Lachance, J., Boulianne, M. A chicken intestinal ligated loop model to study the virulence of Clostridium perfringens isolates recovered from antibiotic-free chicken flocks. Avian Pathol. 46 (2), 138-149 (2017).
  13. Janvilisri, T., et al. Temporal differential proteomes of Clostridium difficile in the pig ileal-ligated loop model. PLoS One. 7 (9), e45608(2012).
  14. Aabo, S., et al. Development of an in vivo model for study of intestinal invasion by Salmonella enterica in chickens. Infection and Immunity. 68 (12), 7122-7125 (2000).
  15. Meurens, F., et al. Early immune response following Salmonella enterica subspecies enterica serovar Typhimurium infection in porcine jejunal gut loops. Vet Res. 40 (1), 5(2009).
  16. Gerdts, V., et al. Multiple intestinal 'loops' provide an in vivo model to analyse multiple mucosal immune responses. J Immunol Methods. 256 (1-2), 19-33 (2001).
  17. Wade, B., et al. The adherent abilities of Clostridium perfringens strains are critical for the pathogenesis of avian necrotic enteritis. Vet Microbiol. 197, 53-61 (2016).
  18. Cooper, K. K., et al. Virulence for chickens of Clostridium perfringens isolated from poultry and other sources. Anaerobe. 16 (3), 289-292 (2010).
  19. Cooper, K. K., Songer, J. G. Virulence of Clostridium perfringens in an experimental model of poultry necrotic enteritis. Veterinary Microbiology. 142 (3-4), 323-328 (2010).
  20. Chalmers, G., Bruce, H. L., Toole, D. L., Barnum, D. A., Boerlin, P. Necrotic enteritis potential in a model system using Clostridium perfringens isolated from field outbreaks. Avian Diseases. 51 (4), 834-839 (2007).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Intestinal Ligated LoopClostridium PerfringensChicken Necrotic EnteritisSurgical ProcedureAnesthesia MonitoringBacterial InjectionHistopathological AnalysisVirulence Strain ComparisonSpecific Pathogen FreeIntestinal Mucosa Contact

Related Articles