Method Article

イメージング フローサイトメトリーとトランスクリプトーム変質エンドサイトーシス CD1d の人身売買を評価するプロファイリングを統合します。

DOI:

10.3791/57528

⸱

October 29th, 2018

 ,  , 
1Department of Environmental Health, University of Cincinnati College of Medicine

In This Article

Summary

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フローサイトメトリーをイメージング細胞個々 および地方レベルでの形態学的、機能的変化を検出するための理想的なアプローチを提供します。中断エンドサイトーシス汚染物質にさらされたひと樹状細胞における脂質抗原提示機能を遺伝子発現と蛋白質の売買の形態のデモの複合トランスクリプトームのプロファイルを示した。

Abstract

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エンドサイトーシスの蛋白質の形態学的、機能的変化の個体群解析いついてレベルで単一細胞レベルで統計画像解析画像キャプチャの需要のために挑戦しています。この困難を克服するためとを使ってイメージング フローサイトメトリー トランスクリプトーム (RNA シーケンス) をプロファイリング分化 1 d タンパク質 (CD1d) のクラスターの関連付けられている細胞内局在性変化を決定する人間の障害エンドサイトーシス遺伝子発現と脂溶性の共通にさらされた樹状細胞 (Dc)、空気汚染物質ベンゾ ピレン []。CD1d とフローサイトメトリーをイメージングを用いた細胞画像の数千からエンドサイトーシス マーカー Lamp1 蛋白質の共存は、アイデアや ImageJ フィジーを用いて解析したプログラム。共同染色 CD1d と Lamp1 蛋白質と多数の携帯電話画像 CD1d のゲーティング後, 可視化された+Lamp1+の Dc のアイデアを使用しています。BaP 露出マンダーの共局在の強度係数テストどちらられる散布図を使用して、プロットに示されたさらに強化された CD1d と Lamp1 の共存は、ImageJ フィジーを用いた共局在の面積の割合に基づいています。私たちのデータが汚染物質にさらされた人間のトランスクリプトーム変質の障害の機能的予後をサポート、シングル、いついての細胞レベルでのタンパク質共存を測定する有利なインストゥルメンタルとバイオ情報アプローチを提供します。Dc。

Introduction

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抗原提示は通常多くの場合形態的特性と抗原提示細胞1,2,3 の表現型プロファイリングを使用して検討されているが、人身売買、細胞内のタンパク質を含む.イメージングと表現方法の利点を統合するには、単一のセルでひと樹状細胞 (Dc) で変更されたタンパク質の共局在を示す人口レベルのイメージング解析プラットフォームをについて説明します。ペプチド抗原提示で主要組織適合複合体 (MHC) クラス I の分子従来 CD8 をアクティブにする小胞体の短いペプチド (8-10 残基) をバインド+ T 細胞、MHC クラス II 分子結合比較的長い間従来の CD4 をアクティブにエンドサイトーシスのコンパートメントにおけるペプチド (~ 20 残基)+ T 細胞1,4。対照的に、脂質特異的 T 細胞はエンドサイトーシス コンパートメント5,6を中心に読み込まれる脂質抗原と CD1 の蛋白質によってアクティブ化されます。脂質抗原提示が脂質代謝脂質代謝7

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Protocol

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本研究では人間のプロトコルは、シンシナティ大学の制度上の審査委員会によって承認された、すべてのメソッドが関連するガイドラインと規則に従って行われました。健康なドナーから血液サンプルは、シンシナティ大学医療センターの Hoxworth の血液センターから得られました。

1. トランスクリプトームのひと単球由来の汚染物質にさらされた Dc のプロファイリング

  1. BaP 公開 Dc の総 RNA の抽出
    1. サイトカインの GM-CSF と il-4 によるを使用して人間の Dc を区別し、4 日間13BaP に DCs を公開します。
    2. フローサイトメトリー (リネージュ-HLA+)、表面発現マーカーに基づいての大部分は、従来の DCs を使用して BaP 公開 Dc を並べ替える (CD11c+CD1c+)13。通常、10% を含む培養液中に 10,000 の Dc を並べ替える FBS、600 x g と 6 分の 4 ° C で Dc を遠心し、1 mL のピペット チップを使用して吸引により上清をすぐに削除します。
    3. 上清を吸引により削除すると、RNA の抽出前に-80 ° C で保管するため RNA 分離キットから 0.....

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Results

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脂溶性の汚染物質 BaP 変更各ドナーから人間人間 dc 単球由来 dcs エンドサイトーシス遺伝子群 (n = 3)、さらに前述の RNA 抽出とトランスクリプトーム解析に使用された従来の Dc の bap が培養され.遺伝子発現の正常化に BaP 公開し、非曝露群の間の変えられた遺伝子は、発現遺伝子の機能的相関によるとクラスター化されました。関連の携帯電話経路の解析のための Toppcluster プログラム16に変更された遺伝子リストを入力を行い、検定のp値 (図 1 b) の偽の発見率 (FDR) 補正を使用しています。脂質代謝とエンドサイトーシスの機能を含むいくつかの主要な変更された遺伝子クラスターは、BaP 公開 Dc で識別されました。本研究で具体的に着目エンドサイトーシス人身売買の機能テスト CD1 を介した抗原提示はエンドサイトーシス経路5,

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Discussion

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複数の経路と個々 と個体群の細胞活動を統合する難しさを含む広く影響を受けた遺伝子発現のため、変更された遺伝子経路の機能確認は困難です。特にテスト CD1d エンドサイトーシスのコンパートメントに人身売買にイメージング フローサイトメトリーを採用しました。フローサイトメトリーをイメージングには、細胞の変化の測定、複数のタンパク質の細胞内局在の共存の個別デモンストレーションが統合されています。共焦点顕微鏡測定蛋白質の共存、高解像度を提供している以前とフローサイトメトリーは、異なる細胞集団の包括的な表現を提供することができます。共焦点顕微鏡やフローサイトメトリーを環境によってトランスクリプトーム変質の機能確認のため知名度の高い方法で蛋白質の共存を分析する許容画像解像度の利点を組み合わせたフローサイトメトリーをイメージング汚染物質。

いついてスケールで複数のタンパク質の共局在の解析は技術的に難しく、(i) 複数の個々 の細胞の解析の詳細なので、手間と比較的バイアス;(ii) 強度または肯定的な汚損; の領域に基づいてオーバー ラップするピクセルを解釈するための最適なしきい値を定義することは.......

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Disclosures

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著者がある何も開示するには

Acknowledgements

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著者はヒトの血液サンプルのロバート Giulitto (Hoxworth 血液センター) を感謝し、博士梁ニュウ遺伝子発現の正常化のための読み取り。また助成金サポートから、国立環境衛生研究所 (ES006096) に感謝し、環境遺伝学 (CEG) パイロット プロジェクト (件名標目等)、国立研究所のアレルギー ・感染症 (AI115358) のセンター (s. h.) の大学シンシナティ大学研究評議会賞 (件名標目等) は、大学のシンシナティ大学の医学コア強化資金 (X. Z)。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
トランスクリプトミクスIlluminaHiSeq 2500 v4Illumina HiSeq システム
イメージングStream XMillipore100220イメージング フローサイトメトリー
mirVana miRNA Isolation KitサーモフィッシャートータルRNA抽出
Agilent RNA 6000 Pico KitアジレントトータルRNA QC分析
Veriti 96-Well Fast Thermal CyclerThermoFisherPCR, enzyme reaction
NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module ニューイングランドバイオラボPolyA RNA精製
自動SMARTerアポロシステムタカラPolyA RNA精製
NEBNext Ultra RNAライブラリ イルミナ用準備キットニューイングランドバイオラボライブラリの準備
アジャンコートAMPure XP磁気ビーズベックマン・コールターDNA精製 
2100 BioanalyzerAgilentLibrary QC、サイズ分布分析
Agilent High Sensitivity DNA KitAgilentLibrary QC、サイズ分布分析
QuantStudio 5 リアルタイム PCR システム (Thermo Fisher)Thermo FisherLibrary 定量
NEBNext Library Quant KitNew England BiolabLibrary 定量
cBotIlluminaライブラリ クラスター生成
TruSeq SR クラスター キット v3 - cBot –HSIlluminaLibrary cluster generation
HiSeq 1000IlluminaSequencing
TruSeq SBS Kit v3 - HS (50-cycles)IlluminaSequencing
Phycoerythrin/Cyanine 7 (PE/Cy7)Bio LegendL243
Phycoerythrin/Cyanine 5 (PE/Cy5)Bio Legend3.9
Brilliant violet 421BioレジェンドL161
PE 抗マウス IgG2bバイオレジェンド51.1
アレクサ フルーア 647 (AF647)バイオレジェンドCD107a(H4A3)

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Roche, P. A., Cresswell, P. Antigen Processing and Presentation Mechanisms in Myeloid Cells. Microbiology Spectrum. 4 (3), (2016).
  2. Huang, S., et al. MR1 uses an endocytic pathway to activate mucosal-associated invariant T cells. <....

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