方法論記事

によるエクソン介在物評価スプライスの SMA 患者の繊維芽細胞でスイッチング アンチセンスオリゴヌクレオチド

DOI：

10.3791/57530

⸱

2018年5月11日

 ,  , 
1Department of Medical Genetics, University of Alberta Faculty of Medicine and Dentistry, 2Muscular Dystrophy Canada Research Chair, Department of Medical Genetics, University of Alberta Faculty of Medicine and Dentistry

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

エクソン インクルー ジョン (スプライス変調) を誘導し、脊髄性筋萎縮症 (SMA) の召式を救出様々 なアンチセンスオリゴヌクレオチド (AONs) が示されています。ここでは、エーオン lipotransfection エクソン包含SMN2遺伝子の SMA 患者の繊維芽細胞の有効性を判断する評価方法を誘導するためのプロトコルについて述べる。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

脊髄性筋萎縮症 (SMA)、 SMN1の損失によって引き起こされる致命的な神経疾患がアンチセンス オリゴヌクレオチド (AON) の分野でユニークなケースを提示-療法を介した。SMN1遺伝子の変異は、病気の責任ですが、 SMN2のイントロンのスプライシング サイレンサー (ISS) 部位をターゲット AONs は召式を復元し、症状を改善する示されている FDA 承認 nusinersen を含みます。現在、SMA のエーオン療法を含む多くの研究は、小説エーオン化学SMN2 nusinersen よりもより効果的なより少ない有毒ことができるターゲットの調査に焦点を当てます。ここでは、AONs 続いて逆転写ポリメラーゼ連鎖反応 (RT-PCR)、量的なポリメラーゼの連鎖反応 (qPCR) と西部にしみが付くことの lipotransfection を使用してエクソン介在物の in vitro評価のためのプロトコルについて述べる。このメソッドは、エーオン化学の様々 なタイプに流用できます。このメソッドを使用して、ことを示す AONs から成る交互ロックされた核酸 (Lna) 効率的なのSMN2エクソン インクルー ジョンと非常に低濃度としたがって、LNA でサンタマリアノヴェッラタンパク質の回復につながる DNA ヌクレオチド (LNA/DNA mixmers)/DNA mixmer ベース アンチセンスオリゴヌクレオチド遺伝的疾患によるスプライシングの欠陥を治療するために魅力的な治療戦略があります。ここで説明の in vitro評価法は、迅速、簡単、かつ様々 な新規 AONs のテスト十分に敏感です。

概要

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脊髄性筋萎縮症 (SMA) は、常染色体劣性パターンで継承された致命的な神経筋疾患です。それは、運動ニューロンと進歩的な体幹および下肢筋麻痺1,2の低下が特徴です。SMA の出現の大半は生存運動ニューロン 1 (SMN1) 遺伝子3のホモ接合体変異が原因です。生存運動ニューロン 2 (SMN2) 遺伝子はSMN1の逆複製で、ほぼ同じシーケンスのみ 5 拠点4,5によって異なります。SMN2エクソン 7 にある C-T 転移は突然変異が不可欠であるエクソンSMN2コピー (図 1、) のほぼ 90% で除外されて 7 につながるのでほぼ機能しない遺伝子を作る。エクソン 7 を行方不明SMN2 Mrna は、その蛋白質の製品は安定していないが急速に低下、 SMN1関数の補正はできません。

アンチセンス療法は最近 SMA6を治療するための非常に有望な戦略として浮上しています。米国食品医薬品局 (FDA) によって nusinersen の最近の承認は最初の薬 SMA7を治療するために利用可能にしました。Nusinersen は、2 '-O-メトキシエチル変更 (萌) ホスホロチオエート バックボーンと 18 mer アンチセンス オリゴヌクレオチド (AON) です。薬剤ターゲット イントロンのスプライシング サイレンサー N1 (ISS N1) 第 7 SMN2遺伝子のイントロンであります。ISS n1 nusinersen の結合はエクソン 7 包有物 (図 1、)8,9,10 を誘導することによって内因性のSMN2遺伝子から機能のフルレングス召蛋白質の表現の回復を促進します。.現在、SMA のエーオン療法を含む多くの研究は、nusinersen よりもより効果的なより少ない毒性があります小説エーオンの化学的性質の調査に焦点を当てます。それは、他の化学と AONs も効率的にエクソンSMN2エクソン 7 含有を誘発する実証されている生体外でそして生体内の11,12,13。

ロックされた核酸 (Lna)、化学修飾 RNA アナローグ 2 ′-酸素フラノース構造 (図 1b)14,15以内と 4 ′-炭素を結ぶメチレン橋です。Dna または Rna に比べると、Lna は相補的な RNA シーケンスにバインドするための高親和性があるし、内因性核酸に強いという利点を持っています。LNA 化学は、qPCR16,17蛍光その場で交配 (魚) のためのプローブとして使用するため適用されています。また、それを利用する遺伝子発現調節の in vitroとin vivoの両方。GapmeR AONs は、5 'と 3' 端に複数の Lna が並ぶ単一座礁させた DNA の分子の組み合わせです。彼らはターゲット Mrna、活性化リボヌクレアーゼ H18が低下する原因とする相補的な結合による遺伝子発現ノックダウンします。LNA/DNA mixmers は、Lna の間に統合された DNA ヌクレオチドから成る AONs です。この向きで提示彼らはその関数 (LNA antimiR)19を阻害する miRNA をバインドできます。いくつかの LNA antimiRs 臨床開発に達しています。例については、miravirsen (AntimiR-122) は c 型肝炎を治療するためにミール 122 を阻害する LNA antimiR といくつかのフェーズ II 臨床試験が現在進行中19,20。最近、LNA/DNA mixmers もまた RNA スプライシング21に調節をすることが実証されています。それ mRNA の特定のシーケンスにバインドでき、ジストロフィンの mRNA とエクソンのインクルー ジョンSMN2 mRNA体外13,22.のエクソンを誘発します。

この記事では、エクソン含める RNA および蛋白質レベルで AONs と有効性の評価を使用しての誘導のための方法論を概説します。この方法を実証するため、 SMN2のイントロン 7 年目標は ISS N1 LNA/DNA mixmers を使用しました。Lipotransfection による SMA 患者細胞にトランスフェクション AONs による最終SMN2コピーおよび召蛋白質の生産のアップレギュレーションのエクソン 7 含有。エクソンを含めることを誘発する LNA/DNA mixmers を使用する利点の 1 つは、トランスフェクションの効果的な濃度は他の化学13よりかなり低いです。このメソッドは、phosphorodiamidate morpholino オリゴマー (PMOs) 遠藤ポーターの共トランスフェクション試薬によるエンドサイトーシスによって細胞を入力する必要のある、その電荷は中性のためを除いて他の多くの AONs を使用できます。

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プロトコル

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1. 細胞培養

  1. 37 ° C で CO2インキュベーターの成長培地 (ダルベッコ改変イーグル培地 1:1-12 (ハム) 10% 牛胎児血清 (FBS) と 0.5% ペニシリン/ストレプトマイシン) で文化の SMA 患者線維芽細胞
  2. 自動化された細胞カウンターを用いた細胞濃度を決定し、1 x 105セル/ml 成長媒体、そして適切なプレートの種子に細胞を希釈します。RT-PCR の qPCR 12 ウェル プレート (ウェルあたり 1 mL) を使用します。
  3. 37 ° C で CO2インキュベーターで 24 h の版を孵化させなさい

2 LNA/DNA mixmer トランスフェクション

  1. 最適なトランスフェクション効率の 65-80% 程度の細胞密度を確保します。
  2. 氷の上にゆっくりと 10 μ M LNA/DNA mixmers を解凍します。
  3. 1.5 mL チューブに血清を奪われたメディアが最終巻 50 μ L に達するように、mixmers を追加する 20 x mixmer ソリューションを準備します。
  4. 50 μ L の血清を奪われたメディア 3% トランスフェクション試薬 (1:1) と mixmer ソリューションをミックスします。
  5. 室温で 10 分間インキュベートします。
  6. 5 %900 μ L 液媒体を追加各管に FBS。
  7. プレートから古いメディアを吸引し、トランスフェクション試薬を含む LNA/DNA mixmer 溶液 1 mL に置き換えます。
  8. CO2インキュベーターで 37 ° C で 24-48 時間細胞を孵化させなさい。

3. RNA の抽出

  1. メディアを取り出して、ためチオシアン酸-フェノール-クロロホルム試薬 1 mL をセルに追加します。ためチオシアン酸-フェノール-クロロホルムとも数回の下部を洗浄し、1.5 mL チューブに収集します。
  2. 30 s と 1 時間または一晩-80 ° C でストアの高速渦。
  3. よく部屋の温度と渦でサンプルを解凍します。
  4. 200 μ L のクロロホルムを追加、15 の積極的に振る s と 3 分間室温でインキュベートします。
  5. 4 ° C で 15 分間、12,000 × g で遠心分離
  6. 新しい管にトップ水性相を収集します。上限と下限の相間を形成する白い中間期のいずれかの収集を回避することを確認します。
  7. 追加 500 μ L のイソプロパノールと 1 μ L 8 μ g/μ L グリコーゲン (RNA グレード)。渦 10 s または-20 ° C で 10 分間室温で一晩インキュベートし、。
  8. 4 ° C で 10 分間、12,000 × g で遠心し、上清をすべて削除します。チューブの底に白いペレットを形成します。
  9. 4 ° C で 5 分間 7,500 × g で 1 mL 冷たい 75% エタノールと遠心分離機を追加します。
  10. すべてのエタノールを外し、チューブに残っているエタノールまで室温でペレットを乾燥します。
  11. 30 μ L DNase/RNase フリー水、ペレットを溶解し、60 ° C で 10 分間インキュベート
  12. 分光光度計を用いた RNA 濃度を測定 (260 nm)、50 ng/μ L の RNA 濃度を調整します。

4. 一歩 RT-PCR SMN2エクソン封入率を測定するには

  1. RT-PCR 反応バッファー x 2 のミックス 12.5 μ L、1.0 μ L ワンステップ RT-PCR 酵素のミックス、各プライマーの 0.5 μ L (SMN2前方: 5'-CTGCCTCCATTTCCTTCTG-3'、 SMN2逆: 5'-TGGTGTCATTTAGTGCTGCTC-3'、 GAPDH進む。5'-TCCCTGAGCTGAACGGGAAG-3'、 GAPDH逆: 5'-GGAGGAGTTTGGTCGCTGT-3'、2 総 RNA の μ L (50 ng/μ L)、DNase、RNase、-無料の 8.5 μ L の蒸留水。
  2. 50 ° C 15 分で cDNA を合成、PCR 反応を開始します。30 の PCR のサイクルのSMN2エクソン 6-8 を増幅 (94 ° C、15 s、30 ° C、60 s 68 ° C、25 s)。20 の PCR のサイクルの GAPDH の増幅 (94 ° C、15 s、30 ° C、60 s 68 ° C、20 s)。
  3. PCR の製品にローディングの染料 × 5 μ L 6 と 2% アガロースゲルに混合物の 5 μ L を読み込むし、100 V で 40 分間実行できます。
  4. ゲルをイメージし、ImageJ ソフトウェアを使用してそれを分析します。
  5. フルレングスのバンド、Δ7 バンドの強度を測定します。(フルレングス) の輝度値によってエクソン 7 含有率を計算/(フルレングス + Δ7 SMN2)。

5 定量 PCR (qPCR) SMN2エクソン封入率を測定するには

  1. CDNA 合成用ミックス 1 μ L オリゴ dT は、1 μ L 10 mM dNTPs と 11 μ L 総 RNA (50 ng/μ L)。65 ° c 5 分間インキュベートします。
  2. 氷の上、サンプルを配置し、各サンプルに 4 μ L 5 x のバッファー、1 μ L 0.1 M DTT、1 μ L の RNase 阻害剤で、1 μ L の逆転写酵素を追加します。
  3. 60 分の 50 ° C で、反応を停止に 10 分間、80 ° C まで熱する。CDNA は、-20 ° C で保存できます。
  4. RNase フリー水 (希釈 1:5) で Cdna を希釈します。SYBR グリーン qPCR 酵素ミックス x ミックス 10 μ L 2、0.8 μ 10 μ プライマー (フルレングスSMN2前方: 3 '5'-GCTATCATACTGGCTATTATATGGGTTTT、フルレングスのSMN2逆: 3 '5'-CTCTATGCCAGCATTTCTCCTTAAT、Δ7 SMN2前方: 5 '-TCTGGACCACCAATAATTCCCC-3′、Δ7 SMN2逆: 3 '5'-ATGCCAGCATTTCCATATAATAGCC、 GAPDH前方: 3 '5'-GCAAATTCCATGGCACCGT-、 GAPDH逆: 3 '5'-AGGGATCTCGCTCCTGGAA)、3 μ L 希釈 cDNA と 5.4 μ L RNase フリー水。
  5. QPCR 反応を開始します。条件を使用する: 95 ° C、30 s、それから 40 サイクル繰り返します 95 ° C で 5 s の 60 ° C、20 s。
  6. GAPDHにフルレングスSMN2または Δ7 SMN2の相対的な式を計算して ΔΔCt アルゴリズムを用いた非処理細胞を正常化します。

6. 西部にしみが付くこと

  1. トランスフェクション媒体をセルから削除して、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で一度洗います。
  2. プロテアーゼ阻害剤と 100 μ L の換散バッファーを追加します。
  3. 無菌細胞スクレーパーを使用して各井戸の底から細胞をデタッチし、1.5 mL チューブに収集します。30 分間氷の上のサンプルをインキュベートします。
  4. 細胞ライセートを通過 21 G 針 10 回細胞を粉砕します。
  5. 4 ° C で 15 分間 20,800 x g で遠心し、上清を新しい 1.5 mL チューブに収集します。このサンプルは、-80 ° C ディープ フリーザーで保存できます。
  6. BCA タンパク質アッセイ キットを使ってタンパク質濃度を測定し、1.0 μ g/μ L に濃度を調整します。
  7. ミックス 5 μ L の試料と 5 μ L 2 ナトリウム dodecyl 硫酸塩 (SDS) サンプル バッファー x (10 %sds; 14 %0.5 M トリス-HCl 溶液、pH 6.7; 1 %0.5 M EDTA 2Na ストック溶液、pH 8.0; 20% グリセロール; 0.004% ブロモフェノール ブルー染料、5% β-メルカプトエタノール) と 70 の ° c 10 分の熱。
  8. Bis トリス蛋白質ゲル 4-12% にサンプルをロードし、150 V で 1 時間を実行します。
  9. 各バッファーの厚いフィルター ペーパーを浸す: (集中陽極バッファー: 0.3 M トリス-HCl、20% メタノール; 陽極バッファー: 0.03 M トリス-HCl、20% メタノール; 陰極バッファー: 25 mM トリス、メタノール 20%、40 mM 6-アミノ-n-オクチル酸、0.01 %sds)。
  10. ポリフッ化ビニリデン (PVDF) 二フッ化膜に漬メタノール 20 s、陽極バッファーに転送します。
  11. SDS ページの後ゲルを平衡させ、攪拌下で 5-10 分の陰極バッファー。
  12. セミドライのあぶらとりマシン上ジェル、PVDF 膜フィルター ペーパーを次のように配置: 陽極バッファー紙/陽極バッファー紙/PVDF 膜・ タンパク質ゲル/陰極バッファー紙 (図 2) を集中しています。
  13. スタックをカバーし、20 V で 30 分間の転送を開始します。
  14. 転送後、リンス PBST PVDF 膜 (0.05% と PBS トゥイーン 20) 一度。
  15. 5% 脱脂粉乳 PBST で解散で 30 分間室温でまたは一晩のための 4 ° C で膜をブロックします。
  16. 浄化されたマウス抗召抗体と pbst; 5% 脱脂粉乳の 1: 10,000 にウサギ抗コフィリン抗体を希釈します。室温でまたは 4 ° C で 1 時間の膜を一晩インキュベートします。
  17. 10 分間 PBST で 3 回を洗ってください。
  18. 1: 10,000 の pbst; 5% 脱脂粉乳にする二次抗体 (HRP 標識ヤギ抗マウスおよび抗うさぎ IgG (H + L)) を希釈します。暗闇の中で室温で 1 時間インキュベートします。
  19. Pbst; 10 分で 3 回膜を洗浄します。
  20. 化学発光の西部のしみが付く検出キットを用いた帯域信号を検出します。

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結果

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SMA 患者線維芽細胞を使用して、第 7 と 8 つの異なるアンチセンス LNA/DNA mixmers 5 nM 濃度 (図 3) で導入させたSMN2遺伝子のイントロンの ISS N1 サイレンサー地域を対象とします。Mixmers のそれぞれには、ヌクレアーゼの劣化に抵抗するが有効になって変更された phosphorothioated バックボーンが含まれています。Mixmers、 SMN2エクソンの率の有効性を評価するには、RT-PCR 法と qPCR SMN2に固有のプライマーを用いて 7 介在物の定量化を行った。エクソン 7 78 98 %mixmers #1-5 (図 4a、b) の患者の細胞にトランスフェクション同じ用量で mixmers #6-8 を利用した中をトランスフェクトしたときからの封入効率が至らなかったと比較すると有意な差コントロール。結果...

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ディスカッション

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ここで説明の in vitro評価法は、迅速、簡単、かつ様々 な AONs のテスト十分に敏感です。このプロトコルは、エクソン スキップや他の遺伝子や様々 なセルの種類を含めることに広く適用されます。さらに、このメソッドを使用して (PMOs) を除くほとんどのエーオン化学を導入することができます。AONs は内因性、人為的に導入された遺伝子の mRNA の選択的スプライシングを調節することができ、cotransfected ターゲット遺伝子を運ぶプラスミッド ベクトルを使用することができます。

このメソッドの重要なステップは、セルの confluency はず約 65-80 %aons は線維芽細胞に導入したときです。この状態は、他の細胞型の異なる場合があります。トランスフェクション AONs の最高濃度は異なることがありますまた (0.5 - 100 nM)、標的配列やセルの種類に応じて。

このメソッドは、潜在的な落とし穴ないわけです。たとえば、mixmers の有効性、mixmers および LNA/D...

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者が明らかに何もありません。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者はニコール McRorie の実験の助けをありがちましょう。この作品は、アルバータ大学の医学、歯学、・ スリプチュク SMA 研究財団研究助成金、カナダ保健研究機構 (機構)、友人のギャレット カミング研究資金、HM のトゥーピン神経学部によって支えられました。科学研究費、筋ジストロフィー カナダ、イノベーション、アルバータ州企業と高等教育と女性や子供の健康研究所 (WCHRI) のカナダの基礎。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
SMA FibroblastsCoriell NIGMS ヒト遺伝細胞リポジトリGM03813
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)サーモフィッシャー11320033
ウシ胎児血清Sigma-AldrichF1051
ペニシリン-ストレプトマイシン (10,000 U/mL)サーモフィッシャー15140122
トリプシン-EDTA (0.05%)、フェノールレッドThermo Fisher25300062
血清欠乏培地Thermo Fisher31985070
トランスフェクション試薬Thermo Fisher15338100
グアニジナム チオシアン酸-フェノール-クロロホルム (TRIzol)Thermo Fisher15596-018
RT-PCR PrimersSequence 5' to 3'SMN2
forward: CTGCCTCCATTTCCTTCTG
SMN2リバース: TGGTGTCATTTAGTGCTGCTC
GAPDHフォワード: TCCCTGAGCTGAACGGGAAG
GAPDHリバース: GGAGGAGTTTGGTCGCTGT
qPCR Primers
全長 SMN2 フォワード:GCTATCATACTGGCTATTATATGGTTTTT
フルレングス SMN2 リバース: CTCTATGCCAGCATTTCTCCTTAAT
GAPDHフォワード: GCAAATTCCATGGCACCGT
GAPDH reverse:AGGGATCTCGCTCCTGGAA
ChloroformSigma-AldrichP3803
グリコーゲン、RNA グレードThermo FisherR0551
ImageJ Software
Protease カクテル阻害剤 ロシュ11836153001
カソードバッファー0.025 M トリスベース + 40 mM 6-アミノカプロン酸 + 20% メタノール
陽極緩衝液0.03 M トリス塩基 + 20% メタノール
中心陽極緩衝液0.3 M トリス塩基 + 20% メタノール
ベータ メルカプトエタノール ミリポアES-007-E
PVDFメンブレン GE10600021
NuPage InvitrogenNP007用ローディング/サンプルバッファー
 キアゲン 210210
dNTPsクロンテック3040
ウェスタンブロッティングOne-Step RT-PCRキット

参考文献

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