均質な時間分解蛍光共鳴エネルギー転送を用いた測定インスリン分泌の検出

サマリー

ここでは、提案する均質な時分割フレット (HTRF) 細胞から分泌されるインスリンの急速な検出のための効率的な方法として。

要約

インスリン分泌の検出だけでなく代謝の研究のように規制の分泌機構の解明にとって重要です。多数のインスリン アッセイは、何十年も存在している、けれども均一時間分解蛍光共鳴エネルギー伝達 (HTRF) 技術の最近の出現が大幅これらの測定に簡略化します。これは、急速なコスト効果の高い、再現、および堅牢な光学測定時間分解蛍光共鳴エネルギー移動を容易にする長期的な排出量と明るい蛍光物質を抗体に依存です。また、HTRF インスリン検出は高スループット スクリーニングの試金の開発の影響を受けやすいです。ここ HTRF を使用して INS 1E 細胞、ラット インスリノーマ細胞ラインでインスリン分泌を検出します。これはインスリンとグルコース刺激による変化の基底のレベルを推定することができます。さらに、このインスリン検出システムを [グルコース刺激によるインスリン分泌 (GSIS) の負の調節因子としてのドーパミンの役割を確認します。同様に、他のドーパミン D₂-受容体アゴニスト、クインピ、ブロモクリプチン、濃度依存的に GSIS を減らすような。我々 の結果は、GSIS、その薬理学的プロファイルで多数の薬の役割を決定する際に HTRF インスリン測定形式の有用性を強調表示します。

概要

主要な蛋白同化ホルモン、インスリンによるエネルギー代謝の調節を微調整します。インスリンが合成・増加細胞外グルコース レベルに応じて膵 β 細胞が発表しました。リリースされたインシュリンはインシュリン敏感なティッシュ^1,2によりブドウ糖の取り込みをトリガーします。生理学的に、これはグルコースの取り込みを調節するインスリンの分泌が続く、食後後のグルコース濃度の上昇にリンクされます。グルコース恒常性の障害がインスリン抵抗性で最高潮に達する代謝障害につながる、最終的に、2 型糖尿病^2,3、4を発症。

インスリン分泌が広く研究されていますがその分子機構、ままかり。調査の重要な分野は、インスリン分泌 β 細胞^5,6,7,8で新規変調器の識別されています。これらの研究では、グルコース刺激とインスリン分泌の結合関係の理解を深める必要があり....

プロトコル

1. INS 1E 細胞: メンテナンスとめっき

1. 5% (v/v) 熱不活化牛胎児血清 L-グルタミン, 2 mM 10 mM HEPES、1 mM ピルビン酸ナトリウム、100 U/mL ペニシリン/ストレプトマイシンを添加した INS 1E 細胞加湿 37 ˚C/5% CO₂インキュベーターと RPMI 1640 培地で培養を維持します。50 μ M β-メルカプトエタノールのソリューションです。80-90% の合流点に到達するまで、トリプシンし継代またはインスリン分泌の試金のために使用することができます (プレート) あたり 10 mL 完全 RPMI 1640 培地での細胞を培養します。
2. 1 日目:メディアを吸引し、予め温めておいた PBS の 5 mL と一度セルを洗ってください。トリプシン (0.025%) の 0.5 mL 希釈 0.5 mL の PBS のセルを trypsinize し、37 ° C で 3-4 分間インキュベートに 1:1 を追加します。15 mL 遠心管にピペットによって 9 mL 完全なメディアおよび転送細胞を加えることによってトリプシンを非アクティブ化します。
3. 遠心分離によって細胞をペレットし、約 5 mL の新鮮なメディアで再細胞ペレットを中断します。
4. 再浮遊細胞の 10 μ L を取るし、10 μ L でトリパン ブルー セル実行可能性を確認するため....

結果

定義済みの濃度 (図 2) の浄化されたヒトインスリン標準を使用してインスリン標準曲線を生成することによって、インスリン HTRF 測定を検証しました。レシオ メトリック蛍光測定値を推定することができること標準的な曲線の世代薬物治療 (図 2) への応答で分泌されたインスリン レベルを決定します。カーブ フィットの内陸のバリエーションが少なかった (R² = 0.99996 ± 5.0 x 10^-5) されたプレート境界の変化 (R² 0.947 ± 5.5 x 10 =^-5; n = 3 プレート)。

我々 は次に、INS 1E 細胞からのインスリン分泌の基底のレベルを決定しました。24 ウェル プレート形式の.......

ディスカッション

ここで説明した HTRF インスリン アッセイ培養細胞系からのインスリン分泌を測定するための迅速で効率的なシステムを提供しています。その最も重要な利点は、この試金は高い信号対雑音比のための低バック グラウンド信号を提供しています。また、HTRF 信号は、長期間安定したことを確認した (> 24 h)⁷。それにもかかわらず、のでインスリン結合モノクローナル抗体迅速分析への付加の後でバインド飽和に到達、抗体の結合の動力学は周囲温度やインスリンの分泌レベルの変動による影響は。したがって、我々 は (2 h、4 h、一晩) 抗体は完全飽和に達しているし、HTRF 信号は最も堅牢な⁷を正確に識別するために複数の時点でアッセイ プレートを読みます。私たちも最近示されているインスリン抗体は大幅プロインスリン c-ペプチドと交差反応を行う成熟インスリン⁷の非常に特定であることを示唆します。

アッセイの最適化の重要なステップは、インスリン分泌の広いダイナミッ.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
96ウェルホワイトハーフエリアプレート	Greiner Bio-One	82050-042
384ウェルホワイト少量丸底プレート	コーニング	15100157
インスリンハイレンジキット	Cisbio Bioassays	62IN1PEH	10,000テストHTRFベースのインスリンアッセイキット
PHERAstar FSXプレートリーダー	BMG Labtech	FSX	HTRFベースのアッセイ読み取りに適合したプレートリーダー
プレートシーラー	フィッシャーサイエンティフィック	DY992	抗体がインキュベートしている間にプレートをシールする
血球計算盤	ハウサーサイエンティフィック	3100
RPMI ミディアム 1640 (1x)	Gibco	11875-093	[+] L-グルタミン
トリプシン0.05%	Corning	25-052-CI	0.53 mM EDTA、(-) 重炭酸ナトリウム
DPBS (ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水)	Corning	21-031-CV	カルシウムとマグネシウムを含まない
ウシ胎児血清	Corning	35-010-CV
HEPES	Gibco	156-30-080
ピルビン酸ナトリウム	Gibco
ペニシリン/ストレプトマイシン溶液 100x	Corning	30-002 CT
2-メルカプトエタノール	Sigma	M1348
トリパン ブルーステイン (0.4%)	Gibco	15250-061
ドーパミン塩酸塩	Σ	8502
ブロモクリプチン メシル酸塩	Tocris	427
(-)-Quinpirole 塩酸塩	Tocris	1061
ウシ血清アルブミン	Calbiochem	12659
ポリ-L-リジン	Σ	P4832
グルコース Σ		G7021
DMSO(ジメチルスルホキシド)	シグマ	276855

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