Aortopathy β-アミノプロピオニ トリルによる大動脈瘤と解離のマウスモデルでのマイクロ CT 定量分析

Summary

放射線不透過性鉛ベースのシリコーンゴムを使用して大動脈径の大動脈瘤マウスモデルで定量化のためマウスの血管を灌流する詳細な方法について説明します。

Abstract

大動脈瘤および解離重大な罹患率と死亡率の人口に関連付けられて、非常に致命的なことができます。大動脈疾患の動物モデルが存在している間、血管系の生体内イメージングは制限されています。大小の船舶をイメージングの最寄りのモダリティとして浮上しているマイクロ コンピューター断層撮影 (マイクロ CT) 近年、体内と体外の両方。血管鋳造の方法と組み合わせて、正常に周波数と β アミノプロピオニ トリル扱わ C57/Bl6 マウスの大動脈の病変の分布を特徴付けるマイクロ CT を使用している私たち。このメソッドの技術的な制限には、貧しい人々 の動物の準備、容器サイズの定量化のための適切な方法論の適用とこのプロシージャの存続性によって導入された灌流の品質のバリエーションがあります。この記事は、鉛ベースの放射線不透過性シリコーン ゴム動脈瘤マウスモデルにおける aortopathy の定量的な特徴づけの血管内血流の方法論を詳しく説明します。大動脈の病理学を可視化、に加えて他の体内血管ベッドまたは事後削除血管のベッドを調べるこのメソッドを使用可能性があります。

Introduction

大動脈解離の発症率は¹年ごとの 100,000 ごとの 3 例です。大動脈解離や動脈瘤疾患アカウント以上 10,000 の死のためアメリカ合衆国で毎年、欧米²のすべての死の 1-2% を占めます。大動脈解離は、生理学的な圧力の下で大動脈壁の層を介して血液の伝播と容器の内膜層に涙によって開始されます。高い患者の脈圧は郭清の合併症発生率の増加に関連付けられます。高められた壁面せん断応力は、動脈瘤形成^3,4につながる大動脈壁の拡張に関連付けられます。大動脈解離の影響は、脳、腎臓、腸と手足、慢性脳動脈瘤、破裂、または死^5,6、7の形成を含む遠隔臓器への血流の閉塞を含まれます。

現時点では、生化学的・細胞プロセスを開始、大動脈瘤と解離の進行に関与するはまだよく理解されています。大動脈瘤と解離の再現可能な動物モデルは、自分の病態を理解するための鍵です。Β-アミノプロピオニ トリル (BAPN) は、エラスチンとコラーゲンの架橋結合を防止し、血管壁の細胞外マトリックスとその生体力学的整合性^{6の構造を大きく変更するが示されている、リジルオキシダーゼ酸化酵素阻害剤 8}。BAPN で治療の齧歯動物は、大動脈瘤や解離^9,10の共通動物モデルとして利用されています。

血管の画像診断装置は、血管病変を識別する、血管の開存性を確認して臓器灌流の評価に尽力されます。最近、マイクロ コンピューター断層撮影 (マイクロ CT) はマウスと同様に大きさで分類された動物の血管系の研究に利用されています。腔内の血液が本質的に比較的 radiolucent 骨とは違ってコンピューター断層撮影による血管軸の画像に制限が。血管内の造影剤と組み合わせた場合、ただし、マイクロ CT はマクロ解剖学的血管病理¹¹の研究のための動物の生の詳細な三次元再構成できます。

選択した造影剤 (材料の表を参照) は、クロム酸鉛と硫酸鉛を含む放射線不透過性シリコーンゴム。触媒の存在下で灌流は、時にすばやく背景組織と対照をなして高放射線不透過性血管を作り、血管のマクロ解剖学的アーキテクチャの最小限の変更で血管のキャストを形成する硬化時radiographically を検討しました。この造影剤は、扱いやすい、組織の低下と血管キャスト腐食に伴う破損による容器の損失を避けるために便利です。それは、最小限の収縮¹²治療法、血管血のクリア特許のまま、非生存実験動物マクロ血管の正確な評価を可能にします。前の仕事はさまざまな動物実験で放射線不透過性シリコーン ゴム コントラストを使用して正常に。具体的には、冠動脈、糸球体、胎盤、および脳循環^{11,12,13,14,15}の可視化に適用が示されています。本稿で我々 はマイクロ CT からマウス モデルにおける BAPN による大動脈病理学の特徴を定量的に鉛ベース放射線不透過性シリコーンゴムの血管内血流を開いて左心室穿刺の方法論を詳細します。

Protocol

動物取扱のプロトコル制度動物ケアおよびメリーランド大学ボルチモア (動物のプロトコル番号 0116024) の使用委員会によって承認された、AAALAC 国際規格に従って実施します。

1. 試薬の調製

1. ヘパリン
   1. 1000 の 250 μ L を希釈 U/mL ヘパリン硫酸 50 ml のリン酸緩衝生理食塩水 5 U/mL の最終濃度を確認します。
   2. ヘパリン (5 U/mL) 暖かいリン酸緩衝生理食塩水、37 ° C に設定水浴の血管の血液を交換します。
   3. 必要なチューブを接続することで圧力制御ポンプを準備し、2 空 10 mL 注射器、ヘパリン生理食塩水バッファーの 1 と造影剤の 1。
   4. 暖かいヘパリン リン酸緩衝生理食塩水でチューブを入力し、圧力ポンプのチューブから空気の泡を削除します。
2. 造影剤
   注: コントラスト エージェント キット成分の材料表を参照してください。
   1. 1:6 色素希釈率を達成するために希釈液と色素化合物を混ぜます。
   2. (ステップ 2.3.12)、使用の直前に 200 μ L の希釈色素化合物の各 5 mL の約数に硬化剤とそれらが (ボリューム 4%) をよくミックスを追加します。
      注: 製造元報告作業時間は 40 分。シリコーン ゴムのコントラスト剤硬化剤添加後 20 分を重合し始めると、その注入の前にすぐに解決策を準備することが重要です。
3. BAPN 飲料水
   1. 3 g/L (以前文献で説明されているプロトコルから適応)^9,16,17の最終的な集中を作成する水を飲んで β-アミノプロピオニ トリル (BAPN) を解散します。
   2. マイクロ ct 灌流の時間まで 4 週一度マウスのグループに BAPN を含む飲料水の管理します。

2. 手術

1. 動物の準備
   1. 3 週齢のマウスを引き離す、12 h 光/12 h 暗いサイクルで維持し、そしてそれらに標準的な齧歯動物の食事をフィードします。BAPN 投与群の 16-26 週間広告自由の作りたての BAPN が水を飲むを管理します。標準的な飲酒コントロール動物水の自由を提供します。
2. 麻酔の技術
   メモ: CT 解析、次の手順の前に 24 h は実行されます。手術は死後心内血流の試料を準備する制定されました。
   1. 100% O₂と 3% イソフルラン精度気化器を介して配信誘導タンクを介して麻酔を誘導します。麻酔導入後、イソフルランを中止し、チャンバー内に O₂をフラッシュします。2 2.5% イソフルランと 1 L/min O₂を介して鼻の円錐形の麻酔を維持します。
   2. 誘導室とフェイス マスクの裏を人員を保護するための廃ガス吸着炭スカベン ジャーに接続します。(つま先ピンチ) 有害な刺激への応答がないことを示すことによって十分な麻酔平面を確保します。
   3. 手術用トレイと必要な手術器械から成る術野を準備します。
   4. 外科分野に動物を転送し、背臥床でそれを配置します。
3. 手術テクニック
   1. はさみを使用して、胸骨切痕、肌と胸骨を覆う軟部組織を拡張する恥骨の中間から皮膚や軟部組織を正中切開を作る。
   2. はさみを使用して、胸腔内を入力する剣状突起で横隔膜に穴を作成します。
   3. 両側腹胸部のダイヤフラムを解剖するのにはさみを使用します。
   4. 右胸骨の国境で胸骨から肋骨を分離する肋軟骨をカットします。
   5. (近くに剣状突起) 胸骨の先端に細かい止血クランプを適用し、それがマウスの頭の上に表示されるように、止血を頭側移動します。これは胸腺、心臓、心臓と大血管さらに操作のための公開から胸骨が撤回されます。
   6. 心と胸の壁のすべての添付ファイルを鋭く解剖します。
   7. 27 g IV カテーテル針を注射器 10 mL ヘパリン リン酸緩衝生理食塩水 (5 U/mL) がプリインストールに接続し、圧力ポンプのチューブから空気の泡を除去するためにバッファーを持つすべての管を埋めます。
   8. 管路における気泡として流体の準備中に注意しては、小型船の充填を妨げる可能性があります。完全な充填と最終的なイメージングへの成果物を導入するために必要なボリュームを変更する切断された血管外に漏れるように造影剤しまうので動物の準備時に破損している船の数を制限します。
   9. 直角クランプで安定した 27 ゲージ針で左心室を穿刺します。すぐに右心室やヘパリン溶液、血液を排出する下大静脈を切開します。
      注: 血の動物の死の後血管内凝固を防ぐためには、ヘパリンを抗凝固剤として使用されます。
   10. 2 mL/分 1 つのシリンジ ポンプを使用して一定の速度で動物を灌流します。臓器のブランチング表示に注意してください。静脈の循環からの排出液が血 (約 5-6 mL) の解放されるまで灌流を続けます。ポンプを停止します。
   11. 左心室内の針の位置を妨害しないように世話 10 mL のシリンジから IV カテーテル チューブを外します。
   12. すぐに完全なデスメタル後 5 ml にコントラスト エージェント ソリューションを分離し、この時点で硬化剤を追加 (手順 1.2 を参照してください)。それらをよく混ぜます。10 mL 注射器にコントラスト エージェント ミックスの 5 mL を描画し、それを動物を灌流します。
   13. 脈管 (動脈、静脈) の完全な充填、静脈ソリューションを終了を見ることができるとき過去のポイント注入を続けます。冠状動脈、肺動脈、腸、肝臓の血管系のキャスティング エージェントの可視化を含む正常な血流の兆候を探します。
   14. 造影剤は、室温で約 20 分後に治るでしょう。硬化時に必要に応じて、個々 の器官の収穫および 10% 中性緩衝ホルマリンでそれらを修正します。マイクロ CT スキャン次の日のサンプルを使用しない場合は、全体の死体を修正します。死体でそれに続く日を使用する場合、金属製のトレイに置き、一晩を治すための 4 ° C で冷蔵庫に置いてください。

3. マイクロ CT スキャンとパラメーター

注: アクイジション ・ パラメーターは特定のイメージは使用中のマシンに依存になります。

1. 各マウスの x 線断層撮影画像 55 kVp、150 μ A の電流、2.19 のシステム倍率 2 CCD カメラ画素ビニング因子の x 線管電圧を用いたマイクロ CT スキャナーを使用して血流を次の日を取得します。29 μ m の有効画素サイズが得られます。
   1. マイクロ CT スキャナー テーブルに仰臥位マウスの死体を置き、スカウトの x 線スキャンを取得します。
   2. × 37.1 mm (トランスアキシャル) 57.4 mm (軸) の検出器の視野を大動脈のフルの長さの画像に胴体に焦点します。
   3. 2 度と当たり 2800 ms の投影時間の回転増分 180 のイメージ投射を取得します。
2. 変更, フェルドカンプ アルゴリズムを使用してイメージを再構築します。再建されたボクセル サイズは 29 μ m³ x 29 x 29 (スライス厚 29 μ m を =) ここで使用されるソフトウェアのマルチ モーダルな 3次元可視化プラグインを使用します。

4. 後処理とレンダリング

1. CT データを適切なソフトウェアを使用して DICOM 形式に変換します。
2. 動脈瘤が存在するかどうかを識別するために画像を分析します。大動脈弓、胸大動脈の最も広いポイントでマイナーな軸の直径を測るし、腹部大動脈は前述した¹⁸ (図 1)。
   注: 我々 の研究で画像を (1 つを盲目に) 2 つの独立したオブザーバーによって分析した動脈瘤が存在するかどうかを識別する DICOM ビューアーを利用しました。短軸径は、上記¹⁹ (図 1) と胸部下行大動脈や腹部大動脈を降順、大動脈弓の最も広いポイントで測定しました。BAPN 未処理マウスの非動脈瘤動脈セグメント設立年齢をマッチさせた対照値として正常血管径を意味します。
3. 動脈瘤は、大動脈のセグメント径基準円直径の 50% 以上のローカライズ済みまたはびまん性拡張として定義されます。上記の測定に基づいてこれらを検索します。

Results

このプロトコルを評価するために 20 男性アダルト マウス、上記¹⁹として混合の背景と 20-30 週齢、BAPN 治療の有無の鉛ベースの放射線不透過性シリコーンゴムと灌 (材料の表を参照してください。) 上記プロトコルを使用します。彼らは次の日にマイクロ CT スキャンを受けた (図 1と図 2)。比較対象グループのいずれかの間でマウスの年齢に有意差はありませんでした。

短軸径はこれらのマウスに定量化されたし。BAPN 処理マウスで上行大動脈の平均直径は未処理の年齢をマッチさせたコントロールよりも有意 (1.43 ± 0.56 mm対0.93 ± 0.11 mm;p = 0.023、...

Discussion

マイクロ CT イメージングは、動物モデルにおける血管病変の詳細かつ三次元復元を提供するために使用できます。血管内の造影のメディアを使用して強化しているものと非強化の軟部組織など、血管の内腔を区別できます。レーザー ・ ドップラー、微小血管造影、磁気共鳴血管造影、共焦点、または 2 光子顕微鏡を用いた組織学は血管ベッドを評価するために使用可能性があります、彼らは通常研究の限られた領域に焦点を当てるのおよび/または二次元の評価に限定されます。マイクロ CT では、基になる血管新生と血管生物学の理解を得ることで助けることができる血管構造の詳細な画像を得ることのコスト効果の高い手段を提供します。小動物イメージングの追加方法には、生体内でマイクロ CT と血管造影があります。ここで説明する手法と同様に、生体内でマイクロ CT は解像度を上げる外因性造影剤に依存します。VC、窓、Isovue 370 2 そのような血液プール造影剤が利用可能マイクロ CT、VC 窓が使用されており、大動脈次の注入²⁰20 分 〜 620 ハンス ユニットの最大平均の増強が報告されて...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microfil	Flow Tech、Inc	MV-122	黄色を使用しており、必要に応じて別の色を注文できます。キットには、MV-コンパウンド、MV-希釈剤、およびMV-硬化剤が含まれています。
ヘパリン (1000 U/mL)	Sagent Pharmaceuticals	25021-400-10
リン酸緩衝生理食塩水	Corning	21-031-CV
イソフルラン	Vet One, MWI	502017
3-Aminopropionitrile フマル酸塩	Sigma-Aldrich	A3134
シングルシリンジポンプ	Fisher Scientific	14-831-200
27ゲージ頭皮静脈セット針	Exel Int	26709	27G x 3/4", 12" tube
Inveon Micro-CTスキャナー	Siemens Medical Solutions
Osirix MD	Pimxmeo SARL		Version 8.0.2
Inveon Research Workplace	Siemens Medical Solutions		Version 4.2
Rodent Chow	Harlan Teklad	2018SX